实时荧光定量PCR技术原理资料.ppt

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1、实时实时(sh sh)(sh sh)荧光定量荧光定量PCRPCR技术技术原理、应用及实践原理、应用及实践(Real time Quantitative PCR)Real time Quantitative PCR第一页，共57页。主要主要(zhyo)(zhyo)内容内容 Real-time qPCR的定量的定量(dngling)原理原理2Real-time qPCR的检测的检测(jin c)方法方法3Real-time qPCR的基本概念的基本概念 1Real-time qPCR的解析方法的解析方法 4第二页，共57页。PCRPCR：基本原理：基本原理Denaturation:94 96CAn

2、nealing:50 65CExtension:70 75C基本要素：基本要素：TemplatePrimersDNApolymerasedNTP,N=A,G,CorT第三页，共57页。PCRPCR：基本原理：基本原理理想的理想的PCR反应：反应：N=N0*2n实际实际(shj)的的PCR反应：反应：N=N0*(1+E)nN0：初始模板量：初始模板量N：第：第n次循环后的产物量次循环后的产物量 n：扩增反应的循环次数：扩增反应的循环次数 E：扩增效率：扩增效率S形曲线形曲线(qxin)，具有，具有平台效应平台效应第四页，共57页。与普通与普通(ptng)PCR(ptng)PCR的对比的对比同一个

3、样本进行同一个样本进行(jnxng)96(jnxng)96次次重复重复传统传统(chuntng)PCR检测检测Real time PCR Real time PCR 检测检测vReal time PCR-Real time PCR-起点检测起点检测：-起点量是样本中起始的起点量是样本中起始的DNADNA量量-“加入了加入了500500个拷贝个拷贝”-具有重现性，误差小具有重现性，误差小v传统传统PCR-PCR-终点检测终点检测：-终点产物量经过终点产物量经过PCRPCR放大的放大的DNADNA量量-“生成了生成了500500，00000000，00000000个拷贝个拷贝”-不恒定，误差大不恒

4、定，误差大传统传统PCR检测检测第五页，共57页。Real-time qPCR激发激发(jf)(jf)光光发射发射(fsh)(fsh)光光-在在PCRPCR反应体系中加入荧光基团。反应体系中加入荧光基团。-荧光基团在激发光的作用下，产生荧光基团在激发光的作用下，产生(chnshng)(chnshng)波长更波长更长的发射光。长的发射光。-利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。荧光基团荧光基团第六页，共57页。扩增曲线扩增曲线(qxin)(qxin)（primary curveprimary curve）扩增曲线：扩增曲线：随着随着PCRPCR反应的进行

5、，扩增产物不断累积，荧光信号反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号(xnho)(xnho)强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号号(xnho)(xnho)，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。从而得到扩增曲线图。纵坐标：纵坐标：RnRn（荧光值）（荧光值）横坐标：横坐标：cycle numbercycle number（循环数）（循环数）线性图线性图对数对数(du sh)图图第七页，共57页。荧光荧光(ynggung)阈值阈值（threshold）基线基线(baseline)(b

6、aseline)：一般以：一般以PCRPCR反应前反应前1515个循环的荧光信号作为个循环的荧光信号作为(zuwi)(zuwi)本底信号本底信号荧光阀值荧光阀值(threshold)(threshold)：扩增曲线上人为设定的一个值：扩增曲线上人为设定的一个值-缺省设置：缺省设置：PCRPCR反应前反应前3-153-15个循环荧光本底信号标准偏差的个循环荧光本底信号标准偏差的1010倍倍-手动设置：大于样本的荧光背景值手动设置：大于样本的荧光背景值第八页，共57页。Ct 值值(Cycle Threshold)CtCt值：值：PCRPCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号扩增过程中，扩增产物的荧光信

7、号达到设定的阈值时，荧光值所对应达到设定的阈值时，荧光值所对应(duyng)(duyng)的的PCRPCR循环次数。循环次数。起始模板量起始模板量 基线基线 阈值阈值 Ct Ct值值第九页，共57页。Ct 值值(Cycle Threshold)CtCt值的特点值的特点(tdin)(tdin)：相同模板进行相同模板进行9696次扩增，平台期次扩增，平台期DNADNA拷贝数波动拷贝数波动很大，但很大，但CtCt值相对固定；值相对固定；CtCt值则极具重现性值则极具重现性第十页，共57页。CtCt值可以值可以(ky)(ky)确定初始模板量？确定初始模板量？Rn=RB+X0(1+E)N*RSRn=RB

8、+X0(1+E)N*RS第第n n个循环的总信号个循环的总信号 =本底信号本底信号+起始起始DNADNA数目数目*PCR*PCR扩增效率扩增效率(xio l)*(xio l)*单位信号强度单位信号强度当循环次数当循环次数n=Ctn=Ct时时RCt=RB+X0(1+E)Ct*RSRCt=RB+X0(1+E)Ct*RS两边同时取对数得两边同时取对数得:lg(RCt-RB)=lgX0+Ctlg(1+E)+lgRSlg(RCt-RB)=lgX0+Ctlg(1+E)+lgRSCt=-lgX0/lg(1+E)+lg(RCt-RB)-lgRS/lg(1+E)Ct=-lgX0/lg(1+E)+lg(RCt-R

9、B)-lgRS/lg(1+E)Ct=-klgX0+b Ct=-klgX0+blgX0lgX0与与CtCt值呈线性关系值呈线性关系根据根据CtCt值可以计算值可以计算(j sun)(j sun)出样本中起始模板所含有出样本中起始模板所含有的拷贝数的拷贝数起始拷贝数越多，起始拷贝数越多，CtCt值越小。值越小。第十一页，共57页。Rn vs.Cycle number-Rn vs.Cycle number-扩增曲线扩增曲线(qxin)(qxin)LogDNA vs.Ct-LogDNA vs.Ct-标准标准(biozhn)(biozhn)曲线曲线.未知未知10410310610510210标准标准(b

10、iozhn)曲线曲线(standard curve)标准曲线分析标准曲线分析-对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释第十二页，共57页。y=-ax+b y=-ax+b 测定荧光定量测定荧光定量PCRPCR反应的有效性反应的有效性-线性的标准线性的标准(biozhn)(biozhn)曲线：相关系数曲线：相关系数R2R2-扩增效率：扩增效率：扩增效率扩增效率(E)=10-1/(E)=10-1/斜率斜率-1-1 标准标准(biozhn)曲线分析曲线分析第十三页，共57页。荧光定量荧光定量(dngling)PCR(dngling)PCR检测方法检测方法染料标记：染料标

11、记：SYBR Green I SYBR Green I探针探针(tn zhn)(tn zhn)标记：标记：水解探针水解探针(tn zhn)(tn zhn)：TaqMan TaqMan非水解探针非水解探针(tn zhn)(tn zhn)：Molecular beaconMolecular beacon 第十四页，共57页。SYBR Green I SYBR Green I 工作工作(gngzu)(gngzu)原原理理lSYBR Green I SYBR Green I 是一种与双链是一种与双链DNADNA小沟结合的荧光染料。小沟结合的荧光染料。lSYBR Green ISYBR Green I只

12、与双链只与双链DNADNA结合才结合才能发出能发出(fch)(fch)荧光。荧光。l荧光信号与双链荧光信号与双链DNADNA分子数成正分子数成正比，随着扩增产物增加而增加。比，随着扩增产物增加而增加。荧光信号强度与反应体系荧光信号强度与反应体系(tx)(tx)中所有双链中所有双链DNADNA分子成分子成正比。正比。第十五页，共57页。5353SGSGSGSG5353SGSGSGSGEmissionExcitation-变性时，变性时，DNADNA双链分开，无荧光信号。双链分开，无荧光信号。-延伸结束延伸结束(jish)(jish)时，采集荧光信号。时，采集荧光信号。SYBR Green I S

13、YBR Green I 工作工作(gngzu)(gngzu)原原理理第十六页，共57页。SYBR Green I SYBR Green I优点：优点：使用方便，成本低使用方便，成本低-仅需设计仅需设计(shj)两个引两个引物物通用性好通用性好-对对DNA模板没有选择性模板没有选择性需要在反应结束需要在反应结束(jish)时，对产物做融解曲线分析。时，对产物做融解曲线分析。缺点：缺点：SYBR Green与所有双链与所有双链DNA结合结合-引物二聚体或错误扩增产引物二聚体或错误扩增产物造成物造成(zo chn)假阳假阳性性-只能检测单一模板，无法只能检测单一模板，无法进行多重检测进行多重检测第十

14、七页，共57页。将温度将温度(wnd)(wnd)对荧光强度的变化求导。对荧光强度的变化求导。(-(-dI/dT)dI/dT)融解融解(rngji)(rngji)曲线曲线(dissociation (dissociation curve)curve)确认确认(qurn)PCR(qurn)PCR反应产物的反应产物的特异性特异性 对数图谱对数图谱 原始图谱原始图谱第十八页，共57页。融解融解(rngji)曲线分析曲线分析-非特异性产物非特异性产物(chnw)(chnw)-引物二聚体引物二聚体第十九页，共57页。Taqman Taqman 工作工作(gngzu)(gngzu)原理原理v探针与靶序列配对

15、探针与靶序列配对v （一段序列，两个基团，（一段序列，两个基团，5 5 报告报告(bogo)(bogo)基团、基团、33淬灭淬灭基团）基团）v完整的探针，报告完整的探针，报告(bogo)(bogo)基团基团R R发射的荧光被淬灭基团发射的荧光被淬灭基团QQ淬淬灭，灭，v 没有荧光产生。没有荧光产生。v聚合酶的聚合酶的55外切酶活性外切酶活性v报告报告(bogo)(bogo)基团基团R R与淬灭基团与淬灭基团QQ分离，发射荧光。分离，发射荧光。RQReporterQuencherRQ荧光信号强度与结合荧光信号强度与结合(jih)(jih)探针的探针的DNADNA分子成正比。分子成正比。第二十页，

16、共57页。Taqman 工作工作(gngzu)原理原理 在退火过程中，探针与靶序列在退火过程中，探针与靶序列(xli)结合结合探针探针(tn zhn)被被Taq酶的酶的5-3 外切酶活性剪切成片断外切酶活性剪切成片断游离报告基团发出荧光游离报告基团发出荧光在延伸过程中，探针部分与靶序列分离在延伸过程中，探针部分与靶序列分离第二十一页，共57页。SYBR Green I与Taqman 对比(dub)Taqman特异性高特异性高-与特异靶序列与特异靶序列(xli)结合结合对模板有选择性对模板有选择性-可进行多重可进行多重PCR反应反应 SYBR Green I 使用方便，成本低使用方便，成本低-仅

17、需设计两个仅需设计两个(lin)引物引物通用性好通用性好-对对DNA模板没有选择性模板没有选择性第二十二页，共57页。荧光定量荧光定量PCRPCR解析解析(ji x)(ji x)方法方法v绝对定量绝对定量v 样本中核酸的量（拷贝数、微克）样本中核酸的量（拷贝数、微克）v-检测某给定血液检测某给定血液(xuy)样本中的病毒颗粒数，样本中的病毒颗粒数，有有6000个拷贝个拷贝v相对定量相对定量v 不同样本中目的基因表达量的差异不同样本中目的基因表达量的差异v-肿瘤组织和正常组织相比肿瘤组织和正常组织相比v 某个基因的表达量某个基因的表达量mRNA改变了多少倍，改变改变了多少倍，改变了了60倍倍第二

18、十三页，共57页。绝对定量绝对定量(dngling)的步骤的步骤拷贝数计算拷贝数计算对标准品进行梯度浓度稀释对标准品进行梯度浓度稀释荧光定量荧光定量PCR反应反应建立标准品建立标准品未知样品未知样品Ct代入标准代入标准(biozhn)曲线曲线确定拷贝数确定拷贝数质粒提取质粒提取OD值测定值测定计算计算(j sun)待测样待测样本浓度本浓度/样本分子量样本分子量/待测样本拷贝数待测样本拷贝数标准品进行标准品进行5-6个个梯度稀释梯度稀释标准品稀释倍数为标准品稀释倍数为10第二十四页，共57页。绝对绝对(judu)定量定量Sample-样本起始浓度与样本起始浓度与CtCt呈线性关系，根据已知拷贝的

19、标准品作呈线性关系，根据已知拷贝的标准品作出标准曲线出标准曲线(qxin)(qxin)。-根据未知样品的根据未知样品的CtCt值，推算出未知样本量。值，推算出未知样本量。以标准以标准(biozhn)品为标杆品为标杆第二十五页，共57页。相对相对(xingdu)定量定量 参照参照(cnzho)样样本本 Calibrator用于比较结果用于比较结果(ji gu)的基准。的基准。第二十六页，共57页。相对相对(xingdu)(xingdu)定量定量 特点特点(tdin)选择选择(xunz)内参基因内参基因内参基因内参基因beta-actinbeta-actin、GAPDHGAPDH、18S rRNA

20、18S rRNA等等看家基因看家基因housekeepinggene在细胞中的表达量在细胞中的表达量或在基因组中的拷或在基因组中的拷贝数恒定，受环境贝数恒定，受环境因素影响较小因素影响较小-文献检索文献检索-实验筛选实验筛选内参基因内参基因-同样体积或重量的样本所来源的细胞数目不同。同样体积或重量的样本所来源的细胞数目不同。-RNA-RNA抽提、反转效率不同，操作中存在误差。抽提、反转效率不同，操作中存在误差。对样本初始浓度差异进行均一化校正。对样本初始浓度差异进行均一化校正。第二十七页，共57页。2-Ct法法成立条件：假设扩增效率为成立条件：假设扩增效率为100%满足条件：满足条件：1）内参

21、基因和目标基因的扩增效率接近）内参基因和目标基因的扩增效率接近 2）内参基因和目标基因的扩增效率均为）内参基因和目标基因的扩增效率均为90%-110%假设条件：假设条件：内参基因和目标基因扩增效率差异大于内参基因和目标基因扩增效率差异大于5%1）优化实验条件，使扩增效率接近）优化实验条件，使扩增效率接近 2）使用其他）使用其他(qt)方法方法 相对相对(xingdu)定量方法定量方法第二十八页，共57页。2-Ct法法 相对定量相对定量(dngling)举例举例第二十九页，共57页。相对相对(xingdu)定量分析定量分析vv待测样品目的基因(jyn)浓度v待测样品内参基因(jyn)浓度vF=对

22、照样品目的基因(jyn)浓度v对照样品内参基因(jyn)浓度假设条件：假设条件：内参基因和目标基因扩增效率不同内参基因和目标基因扩增效率不同 优点：实验优化简单优点：实验优化简单 缺点：每一轮实验都必需缺点：每一轮实验都必需(bx)(bx)做标准曲线做标准曲线 双标准曲线法双标准曲线法80%第三十页，共57页。相对相对(xingdu)(xingdu)定量举例定量举例 双标准双标准(biozhn)曲曲线法线法第三十一页，共57页。实实 验验 流流 程程第三十二页，共57页。SYBR Green法实验法实验(shyn)流程流程 样本样本(yngbn)(yngbn)处处理理RNARNA提取提取(tq

23、)(tq)qPCR数据分析数据分析逆转录逆转录第三十三页，共57页。样本样本(yngbn)处理与处理与RNA提提取取v外界刺激外界刺激 10min 可检测的表达改变可检测的表达改变v样品离开定义环境样品离开定义环境 2min 裂解、固定细胞裂解、固定细胞vTRIzon（酚、异硫氰酸胍）（酚、异硫氰酸胍）v裂解液裂解液（氰酸胍，异硫氰酸胍，（氰酸胍，异硫氰酸胍，SDS）v液氮液氮vRNA保存保存(bocn)液液 v小心小心DNA污染！污染！v使用使用DNase v阴性对照阴性对照第三十四页，共57页。逆转录逆转录逆转录引物选择逆转录引物选择下游应用：是否下游应用：是否(sh fu)检测其它基因？

24、检测其它基因？Abundant RNA的干扰：的干扰：mRNA or total RNA？检测灵敏度是否检测灵敏度是否(sh fu)足够？足够？第三十五页，共57页。RT-PCR一步法还是一步法还是(hi shi)两步法？两步法？两步法两步法:反转录和反转录和PCRPCR扩增分两步进行。扩增分两步进行。步骤多但灵活多样。步骤多但灵活多样。cDNAcDNA可长期保可长期保留检测留检测 多个基因。便于多个基因。便于(biny)(biny)反应优化。反应优化。在工作的初期。在工作的初期。一步法：反转录和一步法：反转录和PCRPCR扩增在同一管内完成。扩增在同一管内完成。简便、快捷但只做一个基因，一旦

25、失败简便、快捷但只做一个基因，一旦失败 难以查找难以查找(ch zho)(ch zho)原因。在工作的成原因。在工作的成熟阶段。熟阶段。第三十六页，共57页。荧光定量荧光定量(dngling)PCR体系体系TemplatePrimersDNA聚合酶BufferanddNTPsDye第三十七页，共57页。总原则与普通总原则与普通PCRPCR相同：相同：避免引物二聚体，避免二级结构避免引物二聚体，避免二级结构(jigu)(jigu)扩增片段长度（扩增片段长度（80-300bp)80-300bp)推荐做跨推荐做跨intronintron设计设计引物设计引物设计(shj)原则原则第三十八页，共57页。

26、Master mix使用使用Master mix有效降低系统误差有效降低系统误差-热启动酶热启动酶Hotstar化学修饰，低温下酶活抑制性强，热复活需化学修饰，低温下酶活抑制性强，热复活需10minFast Hotstar抗体修饰，热复活仅需几十秒抗体修饰，热复活仅需几十秒-Buffer反应增强反应增强(zngqing)剂剂减少模板二级结构影响减少模板二级结构影响控制控制Mg2+浓度浓度稳定剂稳定剂-DyeReal SYBRGreen mix RealSuper mix第三十九页，共57页。Master mix的优化的优化新型荧光染料新型荧光染料(Super Green)(Super Gree

27、n)激发、发射波长激发、发射波长(bchng)(bchng)与与SYBR GreenSYBR Green近近似似对对PCRPCR反应抑制更轻微反应抑制更轻微可使用较高浓度可使用较高浓度(1uM,SYBR green(1uM,SYBR green 0.3uM)0.3uM)更亮，灵敏度更高更亮，灵敏度更高较短的链延长时间较短的链延长时间对小片段对小片段DNADNA和和ssDNAssDNA结合更弱结合更弱减少背景，有效信号更强减少背景，有效信号更强与更强的信号协同，使溶解曲线峰更窄，适与更强的信号协同，使溶解曲线峰更窄，适合于合于HRMHRM分析分析化学性质更稳定化学性质更稳定致突变性与毒性更弱致突

28、变性与毒性更弱SYBR GreenSuper Green第四十页，共57页。Master MixROXPassiveReference不参与、不干扰PCR反应恒定发射荧光信号用于校正因信号检测器到各孔间光路不同而导致的系统误差。有不同系统，需参照仪器要求(yoqi)选择。第四十一页，共57页。v误差控制v使用Mastermixv配置预混体系v设置生物学重复（不同个体(gt)）v技术性重复（复孔）v阳性和阴性对照v实验环境控制v试剂准备区v核酸制备(zhbi)区v反应液制备(zhbi)区v荧光定量PCR反应区荧光荧光(ynggung)(ynggung)定量定量PCRPCR体系体系第四十二页，共5

29、7页。数据分析数据分析融解曲线：单一特异性产物扩增曲线：-Ct值大小-各复孔之间重复性-不同浓度梯度稀释(xsh)的间隔性标准曲线：-R20.980或r0.990-反应效率尽可能高：90%-110%-目的基因的扩增效率接近内参基因第四十三页，共57页。操作操作(cozu)注意事项注意事项为避免(bmin)加样误差，保证重复性，配制预混体系配制反应体系时，液体要缓慢加至管底，减少吹打低速离心，充分混匀，如有气泡短暂离心不要直接在八连管上进行标记避光保存，试剂分装避免(bmin)反复冻融酒精擦拭移液器的吸头设置反应重复（至少二个）设置对照第四十四页，共57页。案例分析案例分析(fnx)总体原则总体

30、原则v偶然因素-操作原因v实验(shyn)重复 生物学重复、技术性重复v机器因素 仪器加样孔v结合扩增曲线、融解曲线、标准曲线分析v单孔和多孔分析v内参基因和目的基因对比分析第四十五页，共57页。案例分析案例分析(fnx)扩增曲线扩增曲线v曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明显。v扩增曲线整体平行性好，基线(jxin)平而无上扬现象。v模板进行梯度稀释时，各浓度间隔性好。vCt15-35v重复性第四十六页，共57页。扩增曲线-低浓度样本(yngbn)没有稀释好-重复性差，加样存在误差案例分析案例分析(fnx)扩增曲线扩增曲线第四十七页，共57页。案例分析案例分析(fnx)扩增曲线扩增曲线 无

31、信号或Ct值偏大内参(ni cn)基因和目的基因均无信号-RNA降解内参(ni cn)基因和目的基因均偏大-模板量低-对未知浓度的样品应从稀释最高浓度做起内参(ni cn)基因正常，而目的基因偏大或无信号 -引物设计-目的基因表达量低第四十八页，共57页。案例案例(n l)分析分析vQ内参基因(jyn)与目的基因(jyn)的Ct值之差在多大范围内可以接受？vA：v-在使用2-Ct法计算的前提是，公式成立的条件是内参基因(jyn)和目的基因(jyn)的扩增效率相接近并且足够高，在90%-110%之间，因此内参基因(jyn)与目的基因(jyn)的差值是可以接受的。v-内参基因(jyn)和目的基因(

32、jyn)的Ct值在15-35以内，并且重复管之间的重复性很好，这样的数据都是可以接受的。第四十九页，共57页。案例案例(n l)分析分析 扩增曲线扩增曲线扩增曲线不平滑(pnghu)-样本浓度太低-原始信号弱关闭(gunb)ROX校正信号第五十页，共57页。案例分析案例分析(fnx)扩增曲线扩增曲线扩增曲线很早扬起-样本浓度太高（稀释(xsh)样品浓度）第五十一页，共57页。案例分析案例分析 熔解熔解(rn ji)曲线曲线熔解曲线出现双峰引物峰：-阴性对照(duzho)（体系污染，配合扩增曲线）-降低引物浓度-重新设计引物非特异性扩增-基因组污染-非特异片段（重新设计引物）第五十二页，共57页

33、。案例分析案例分析(fnx)熔解曲线熔解曲线非正常熔解曲线-试剂(shj)污染-仪器需要校正第五十三页，共57页。v各点之间线性关系v各孔的重复性vR2相关系数vSlope E 反应(fnyng)效率 案例分析案例分析 标准标准(biozhn)(biozhn)曲线曲线第五十四页，共57页。案例案例(n l)(n l)分析分析 标准曲线标准曲线标准曲线的线性关系不佳-加样存在误差-样品稀释不准确(zhnqu)使得标准曲线不呈梯度。第五十五页，共57页。扩增效率低（引物的扩增效率、引物与模板的最适比例(bl)）-调节引物终浓度 案例分析案例分析 标准标准(biozhn)(biozhn)曲线曲线第五

34、十六页，共57页。Trouble shooting 常见问题常见问题 可能原因可能原因 解决方法解决方法Housekeeping gene 无信号RNA降解用新鲜组织提取RNAHousekeeping gene 有信号而目标基因无信号1.目的基因表达低。逆转录效率不高2.PCR引物不良1.富集mRNA 2.在逆转录中尝试不同引物，如特异引物。3.尝试不同PCR引物。减小产物大小，改换目标 区段，考虑不同剪接体。4.尝试不同热循程序，降低复性温度。Housekeeping gene反应效率正常,但目标因放大效率不高PCR引物不良重新设计引物，减小产物大小，改换目标区段，考虑不同剪接体目标基因表达丰度在样本之间异常一致RNA被基因组DNA污染1.使用跨intron 引物2.用DNase处理RNA3.确保RNA阴性对照表现阴性溶解曲线出现杂峰1.出现非特异PCR产物2.出现引物二聚体1.尝试不同PCR引物2.尝试不同热循程序，升高复性温度3.修改仪器设置，将检测温度设定在在引物二聚体解链温度与PCR特异产物解链温度之间。阴性对照在30个循环以内出现信号试剂被污染1.注意区分信号是来自引物二聚体还是PCR产物2.查找，替换污染试剂3.使用UNG系统。第五十七页，共57页。