western的操作步骤.pdf

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1、Western Blot 操作全过程一，收蛋白a（如果要收集死细胞）1.取冰，将 4C 离心机提前降温。2.将死细胞收集到离心管：孔板内的细胞用 PBS 洗 1-2 遍，用适量的胰酶消化，用离心管内的原培养液将孔板内细胞吹打下来，收集到离心管，室温离心 1000rpm，5min。3.弃上清，将离心管倒扣在滤纸上，尽量吸尽残留上清。4.视细胞量的多少加入细胞裂解液。（1Cell Lysis Buffer：PMSF=100：1，1Cell Lysis Buffer，PMSF-20C 保存。PMSF常温易降解，拿出时间不得超过 30min，必须放置冰上。）5.冰上裂解 15min，将裂解液转移至 E

2、P 管离心，4C，12000rpm，15min。6.小心将上清转移至另一 EP 管，记下吸取的量。如：100L。7.将收集好的蛋白保存与20C。（可长期保存）b（如果不收集死细胞）1弃上清，孔板 PBS 洗 1-2 遍，吸尽 PBS。在孔板中视细胞量的多少加入相应细胞裂解液。（同上）2冰上裂解 15min，用细胞刮在孔板里将细胞刮刮。（不同的孔不能用同一个刮子，刮前用水冲洗，擦干。）3将裂解液转移至 EP 管离心，4C，12000rpm，15min。4小心将上清转移至另一 EP 管，记下吸取的量。5将收集好的蛋白保存与20C。（可长期保存）二，测蛋白浓度BCA 法（或者按照自己的试剂盒说明操作

3、）1.需 96 孔板，测蛋白浓度的 A 液，B 液，标准蛋白，要测的样品蛋白。2.按要测的样品蛋白的数量来配 AB 液，每孔需 AB 混合液 80l（A：B=50：1）。例：有 5 个样品，加上 5 个标准蛋白和空白对照。共有 11 个孔。则 A 液取 1180=880l，B 液取 88050=两液混匀，加入 96 孔板，每孔 80l。然后加入标准蛋白及样品蛋白 4l。（标准蛋白先配好浓度 125，250，500，1000，2000）3.将孔板放入 37C 温箱孵育 30min。4.用酶标仪测蛋白浓度。5.记下蛋白浓度，根据要上样的g 量算出l 量。例：蛋白浓度为1000，需上样 15g。则需

4、上样 151000=上样量不超过 20l。三，配胶1.将薄板和厚板用洁净的布擦干净，对齐，夹好。（板必须擦干净，下端对齐，否则容易漏胶。）2.配分离胶，根据要跑的蛋白分子量，配相应浓度的胶。3.快速将分离胶加入薄厚板之间，不能太满，留出浓缩胶的部分。(浓缩胶高度大约 1CM)4.在分离胶上灌水，要缓慢，为了让胶凝的更好。5.30 分钟左右，分离胶凝了，将水倒掉，滤纸吸干，找好梳子。制浓缩胶。6.灌胶，快速插入相应的梳子。7.约 15min 胶可以凝固。四，煮蛋白1.煮蛋白前将蛋白中加入 6SDS+DTT(即上样缓冲液)。例样品蛋白共有 100l，则需加 1005=20l 6SDS+DTT。混匀

5、。（加有DTT 的 SDS 应-20C 保存。DTT 应-20C 保存。SDS：DTT=9：1）。2.将蛋白沸水煮 10min。煮过的蛋白在两周内有效。五，上样，跑胶，转膜1.电泳巢内加入电泳液，夹好胶板。拔去梳子。2.每孔上样量不超过 20l，每块胶应上有 Maker。剩余的孔里上 1SDS。3.蛋白上样前要震荡混匀。4.浓缩胶 80V，分离胶 120V。5.转膜半干法转膜 或者湿转 自己的试验条件决定。根据分子量的大小，按照 Maker 的位置裁胶，根据胶的大小，剪相应大小的 NC 膜。（NC 膜要先用甲醇活化）。六，封闭5%牛奶（TBST 稀释的脱脂牛奶）室温封闭 1-2h，七，封一抗摸

6、清抗体要用的浓度。用TBST 或 5%牛奶加抗体。室温 1-2h，或 4C 过夜。用过的抗体要回收，做记号，用的第几次。放入-20保存。八，洗膜用 TBST 摇床上洗 3 遍，每次 10min。（一抗不要摇的太剧烈）九，封二抗摸清二抗的浓度。室温 45min-2h。抗体回收，做记号，用的第几次。放入-20保存。十，洗膜用 TBST 摇床上洗 3 遍，每次 10min。（二抗可以摇的稍快些）十一，发光1.在发光板内放入干净的可以夹住 NC 膜的薄膜，放好已经洗好的膜。用滤纸吸干膜上的水。2.拿齐发光板，发光液，1ml 的枪及枪头（至少两根），胶片，一张滤纸，一个离心管。3.进入暗室，反锁好门，开红灯，在离心管内配发光液，A 液：B液=1：1。先 A 后 B。切记换枪头，打开薄膜，将 AB 液混匀，均匀的洒在 NC 膜上。盖上薄膜，将多余的发光液推开，以防水多膜移动。漏出薄膜外的可用滤纸吸干。4.关灯，看见荧光，盖上胶片。胶片盖上之前先在左上角（个人习惯）折个角，好辨认方向。5.根据荧光强度按压几秒或几分钟。将胶片放入洗片机冲洗。6.等片子完全洗好，可开灯。或者 DAB 显色需要买试剂盒。十二，扫描保留结果