最新平面色谱法 PPT课件.ppt
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1、平面色谱法平面色谱法3-1 概述(概述(1)薄层色谱法薄层色谱法指固定相涂布于平面载体上,流动相通常是借助毛细管作指固定相涂布于平面载体上,流动相通常是借助毛细管作用流经固定相,使被分离的物质保留在固定相上的色谱方法用流经固定相,使被分离的物质保留在固定相上的色谱方法分类分类纸色谱纸色谱薄层色谱薄层色谱薄层电泳薄层电泳3-1 概述(概述(4)TLC与与HPLC的比较的比较固定相与流动相固定相与流动相样品的预处理样品的预处理进样进样色谱分离色谱分离定量定量固定相与流动相固定相与流动相HPLC流动相线速恒定流动相线速恒定流动相选择受限流动相选择受限固定相与流动相性质影响峰形固定相与流动相性质影响峰
2、形和分离度和分离度定距洗脱色谱定距洗脱色谱,并非所有组分,并非所有组分都能被检测,分析时间不可控都能被检测,分析时间不可控柱子反复使用柱子反复使用TLC薄层板各处流量不同薄层板各处流量不同流动相选择限制小流动相选择限制小吸附剂性质和流动相毛细管运动吸附剂性质和流动相毛细管运动情况影响分离度情况影响分离度定时展开色谱定时展开色谱,色谱图上各组分,色谱图上各组分均能被检测,分析时间可控均能被检测,分析时间可控薄层板一次使用,分离过程无交薄层板一次使用,分离过程无交叉污染,多样品同时分离叉污染,多样品同时分离样品预处理样品预处理HPLC防止色谱柱被污染,预处理过防止色谱柱被污染,预处理过程复杂而严格
3、程复杂而严格TLC固定相是一次性的固定相是一次性的,因此可不,因此可不需预处理,但如待测组分含量需预处理,但如待测组分含量太低、杂质太多影响待测组分太低、杂质太多影响待测组分的分离或干扰薄层板背景时可的分离或干扰薄层板背景时可采用萃取、吸附及衍生等方式采用萃取、吸附及衍生等方式进行处理进行处理可用作可用作HPLC前的预分离富集前的预分离富集进样进样HPLC对溶样溶剂及样品浓度有严格对溶样溶剂及样品浓度有严格要求要求可自动进样,每次一个样品可自动进样,每次一个样品TLC溶样溶剂可任意选择,点样体溶样溶剂可任意选择,点样体积是唯一需要严格控制的参数积是唯一需要严格控制的参数可自动进样,每次可多个样
4、品可自动进样,每次可多个样品色谱分离色谱分离HPLC每次进一个样,分析和平衡时每次进一个样,分析和平衡时间长间长恒组分洗脱适用极性范围窄的恒组分洗脱适用极性范围窄的样品;梯度洗脱适于极性范围样品;梯度洗脱适于极性范围宽的样品并需要更多的时间宽的样品并需要更多的时间反相色谱法最常用反相色谱法最常用使用相同固定相和流动相时重使用相同固定相和流动相时重现性较高现性较高TLC同时分析多个样品、方便灵活同时分析多个样品、方便灵活 1 适于各类物质的分离适于各类物质的分离 1 1正相(吸附)正相(吸附)色谱占主导色谱占主导对复杂样品分离能力好对复杂样品分离能力好定定 量量HPLC均相液体,符合比尔定律均相
5、液体,符合比尔定律 1 在线检测,线性范围宽在线检测,线性范围宽TLC不透明液体,不符合比尔不透明液体,不符合比尔定律,需溶解后定量定律,需溶解后定量离线检测,大量样品分析离线检测,大量样品分析时方便快捷时方便快捷原位测定(薄层扫描仪)原位测定(薄层扫描仪)普遍采用紫外普遍采用紫外-可见检测器可见检测器薄层扫描仪的应用(薄层扫描仪的应用(1)黄连中小檗碱含量的荧光扫描测定(定量)黄连中小檗碱含量的荧光扫描测定(定量)甲苯甲苯-醋酸乙酯醋酸乙酯-甲醇甲醇-异丙醇异丙醇-水水(6:3:2:1.5:0.3)氨蒸气预平衡)氨蒸气预平衡线性范围:线性范围:18.28 ng 329.04 ng回归方程:回
6、归方程:IF=720.146+34.942m r=0.998 薄层扫描仪的应用(薄层扫描仪的应用(2)巴比妥盐的三维紫外光谱巴比妥盐的三维紫外光谱-薄层色谱图(定性)薄层色谱图(定性)与标准品的紫外吸收图比较(在与标准品的紫外吸收图比较(在Rf相同的前提下)提高定性可靠性相同的前提下)提高定性可靠性3-1 概述(概述(5)平面色谱法操作流程平面色谱法操作流程吸附剂或载体的选吸附剂或载体的选择及薄层的制备择及薄层的制备滤纸或薄层板的处理滤纸或薄层板的处理点样点样样品制备样品制备色谱前衍生化色谱前衍生化滤纸或薄层板预平衡滤纸或薄层板预平衡展开展开定位定位定性定性定量定量3-1 概述(概述(6)薄层
7、色谱法的基本材料及设备薄层色谱法的基本材料及设备滤纸及薄层板滤纸及薄层板(自制或市售)(自制或市售)涂布器涂布器点样器点样器(定性:普通毛细管;定量:微量注射器或微量定量毛细管)(定性:普通毛细管;定量:微量注射器或微量定量毛细管)展开室展开室显色器显色器薄层扫描仪薄层扫描仪3-2 薄层色谱系统薄层色谱系统薄层材料薄层材料未改性固定相未改性固定相改性固定相改性固定相载板载板粘结剂粘结剂荧光指示剂荧光指示剂薄层色谱操作过程薄层色谱操作过程薄层板的制备(铺板)薄层板的制备(铺板)活化活化点样点样展开展开定位、洗脱定位、洗脱薄层材料(薄层材料(1)未改性固定相未改性固定相硅胶:硅胶:最常用极性吸附剂
8、,具有表面吸附活性中心,略带酸性最常用极性吸附剂,具有表面吸附活性中心,略带酸性氧化铝:常用极性吸附剂,具表面活性,略带碱性氧化铝:常用极性吸附剂,具表面活性,略带碱性硅藻土:中性吸附剂硅藻土:中性吸附剂纤维素:液液分配色谱担体(水为固定相),具有一定粘性纤维素:液液分配色谱担体(水为固定相),具有一定粘性聚酰胺:特殊有机薄层材料聚酰胺:特殊有机薄层材料薄层材料(薄层材料(2)表面改性固定相表面改性固定相疏水改性硅胶:疏水改性硅胶:烷基键合硅胶,疏水性随烷基链长和改性程度增加而烷基键合硅胶,疏水性随烷基链长和改性程度增加而加强。反相色谱采用高含水溶剂系统,需低改性硅胶,使溶剂体系在加强。反相色
9、谱采用高含水溶剂系统,需低改性硅胶,使溶剂体系在较大范围内可调(增加色谱选择性)较大范围内可调(增加色谱选择性)亲水性改性硅胶:亲水性改性硅胶:介于极性和疏水性改性吸附剂间的色谱选择性,极介于极性和疏水性改性吸附剂间的色谱选择性,极性排序:硅胶性排序:硅胶氨基氨基氰基氰基二羟基二羟基表面改性纤维素:乙酰化纤维素(乙酰化程度可变)表面改性纤维素:乙酰化纤维素(乙酰化程度可变)薄层材料(薄层材料(3)载板载板具有一定机械强度、化学惰性、耐一定温度、表面平整、厚度具有一定机械强度、化学惰性、耐一定温度、表面平整、厚度均匀、价格便宜均匀、价格便宜玻板:玻板:5cm 10cm、10cm 20cm、20c
10、m 20cm光滑、平整、洗净后不附水珠、干燥光滑、平整、洗净后不附水珠、干燥薄层材料(薄层材料(4)粘结剂粘结剂加强固定相颗粒的附着力,增加薄层板润湿性,改善色谱分离加强固定相颗粒的附着力,增加薄层板润湿性,改善色谱分离无机粘结剂:煅石膏无机粘结剂:煅石膏有机粘结剂:羧甲基纤维素钠(有机粘结剂:羧甲基纤维素钠(CMC)0.8%CMC溶液配均浆涂铺的薄层板强度高,色谱分离性能好溶液配均浆涂铺的薄层板强度高,色谱分离性能好注意:注意:不适合浓硫酸显色、易霉变降解不适合浓硫酸显色、易霉变降解硅胶硅胶G:含含13 15%煅石膏煅石膏制备硅胶制备硅胶G:含含30%煅石膏煅石膏氧化铝氧化铝G:含含9%煅石
11、膏煅石膏硅胶硅胶H:不含粘结剂不含粘结剂薄层材料(薄层材料(5)荧光指示剂荧光指示剂适当波长激发光照射下可产生均匀的荧光背景,清晰显示化合物暗斑适当波长激发光照射下可产生均匀的荧光背景,清晰显示化合物暗斑用量:用量:1.5 2.0%短波荧光指示剂:短波荧光指示剂:254 nm紫外光激发发出荧光紫外光激发发出荧光譬如锰激活的硅酸锌譬如锰激活的硅酸锌长波荧光指示剂:长波荧光指示剂:366 nm紫外光激发发出荧光紫外光激发发出荧光譬如银激发的硫化锌、硫化镉譬如银激发的硫化锌、硫化镉五味子提取物五味子提取物TLC石油醚(石油醚(30-60)-甲酸乙酯甲酸乙酯-甲酸(甲酸(15:5:1)254nm 举举
12、 例例硅胶硅胶H不含粘合剂不含粘合剂硅胶硅胶G硅胶和煅石膏混合而成硅胶和煅石膏混合而成硅胶硅胶HF254不含粘合剂,含荧光指示剂不含粘合剂,含荧光指示剂 254nm波长照射下呈现荧光背景波长照射下呈现荧光背景硅胶硅胶GF254同时含粘合剂和荧光指示剂同时含粘合剂和荧光指示剂 254nm波长照射下呈现荧光背景波长照射下呈现荧光背景硅胶硅胶HF254+366不含粘合剂,含荧光指示不含粘合剂,含荧光指示 254nm和和356nm波长呈现荧光背景波长呈现荧光背景薄层色谱操作过程(薄层色谱操作过程(1)薄层制备(铺板)薄层制备(铺板)1份吸附剂(硅胶、氧化铝)份吸附剂(硅胶、氧化铝)+3份粘合剂份粘合剂
13、+水水搅拌至均匀糊状(无气搅拌至均匀糊状(无气泡和板结)泡和板结)均匀涂布薄层板均匀涂布薄层板硅胶硅胶G:自含粘合剂(含自含粘合剂(含5 10%煅石膏),仅加水煅石膏),仅加水硅胶硅胶H:不含黏合剂,需另加不含黏合剂,需另加CMC(0.4 1%澄清水溶液)澄清水溶液)预制板效果最佳(贵)预制板效果最佳(贵)/用涂布器自制亦可用涂布器自制亦可薄层色谱操作过程(薄层色谱操作过程(2)活化活化将晾干后的薄层板置于将晾干后的薄层板置于110 C烘烘30min,放在,放在干燥器干燥器中备用中备用吸附剂活性越强,活性级别越低,最好为吸附剂活性越强,活性级别越低,最好为2-3级级(共(共5级)级)赫曼尼柯法
14、测定活性赫曼尼柯法测定活性偶氮苯偶氮苯30 mg对甲基偶氮苯、苏丹红、苏丹黄、对氨基偶氮苯各对甲基偶氮苯、苏丹红、苏丹黄、对氨基偶氮苯各20 mg,溶于,溶于50 mL CCl4中配成实验溶液,在氧化铝或硅胶薄层上,以中配成实验溶液,在氧化铝或硅胶薄层上,以CCl4为展开剂展开,然后计算各染料组分的比移值,对照为展开剂展开,然后计算各染料组分的比移值,对照参照表参照表确定薄层确定薄层活性。活性。预制板及非吸附原理的薄层板不要活化预制板及非吸附原理的薄层板不要活化薄层色谱操作过程(薄层色谱操作过程(3)点样点样成功分离和精确定量的关键成功分离和精确定量的关键点样要求:点样要求:点样远点应小而圆,
15、距板边缘点样远点应小而圆,距板边缘2 cm需要时可多次点样(前次点样溶剂挥干),防止边缘效应需要时可多次点样(前次点样溶剂挥干),防止边缘效应点样量无超载,防止拖尾点样量无超载,防止拖尾点样勿伤及薄层表面点样勿伤及薄层表面点样装置:点样装置:容量毛细管、自动薄层点样仪等容量毛细管、自动薄层点样仪等薄层色谱操作过程(薄层色谱操作过程(4)展开展开展开原理:展开原理:差速迁移差速迁移展开方式:展开方式:上行展开(最常用),还有其它多种形式上行展开(最常用),还有其它多种形式展开过程:展开过程:展开室预先用展开剂饱和(平衡系统)展开室预先用展开剂饱和(平衡系统)点样薄板一段浸点样薄板一段浸入展开剂(
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