医学分子生物学-上课用-9基因功能研究基本策略教案资料.ppt

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1、医学分子生物学医学分子生物学-上课用上课用-9 9基因功能研究基本策略基因功能研究基本策略基因功能研究的方法：l 动物转基因技术l 基因打靶l 基因沉默第一节 转基因动物z转基因技术(transgenic technology)：用重组DNA技术将外源基因导入并整合到宿主基因组内，并使其在体内表达和稳定遗传给后代。细胞模型 转基因动物 转基因植物一.转基因生物的意义z20 世纪 80 年代(Brinster and Palmiter)：p著名的转基因小鼠实验：金属硫蛋白基因启动子驱动大鼠生长激素基因表达。z转基因生物的用途：p研究手段：疾病的转基因动物模型。p改良动物性状：抗病性、耐寒性等。p

2、生产产品：抗体、疫苗等的生产。二、动物转基因技术的基本原理1.外源目的基因分离；2.转基因与表达载体重组；3.重组的转基因导入受精卵或胚胎干细胞；4.转基因胚胎的培养和移植；5.胚胎发育和生长的鉴定及转基因动物品系的筛选；6.外源目的基因的整合率和表达效率检测。（一）基本原理供体基因供体基因受体的受精卵受体的受精卵（一）基本原理转基因的受精卵（一）基本原理转基因动物转基因动物（二）基本过程上游基因改造和载体构建中游基因转移、胚胎移植与建系下游基因整合、表达的检测与细胞筛选1.上游基因改造和载体构建外源基因:完整的转录单位，由顺式作用元件、结构基因和转录终止信号组成。报告基因:在表达载体中引入易

3、于检测的报告基因。GFP、LacZ、Apr。融合基因(fusion gene):将特定的目的基因与报告基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成完整的转录单位。动物转基因常用的载体z腺病毒载体 z逆转录病毒载体 z非病毒类载体：如质粒等。2.中游基因转移、胚胎移植与建系基因转移技术 1)显微注射法（microinjection)2)胚胎干细胞法(embryonic stem cells,ES)3)逆转录病毒感染法 4)精子载体法1)DNA显微注射法受精卵原核显微注射法是最常用、最经典基因转移方法。持卵管DNA注射针精原核卵原核DNA 显微注射法的特点DNA 大小无限制，最大可达 250Kb。随

4、机整合：在染色体上整合的位点是随机的，整合的拷贝数也不一定。总效率较低(实际成功率1/1000)。提高显微注射 DNA 表达的成功率z转入的外源基因要能够高效表达，最好是可以诱导表达。z转入基因中应该包含有帮助提高整合效率的序列，如微卫星序列。微卫星序列微卫星序列诱导表达启动子外源基因3）逆转录病毒感染法n逆转录病毒载体的构建获得四/八细胞胚胎/囊胚/原肠胚外源 DNA 导入早期胚胎：获得病毒颗粒感染早期胚胎 包装细胞与早期胚胎共培养感染后的胚胎植入受体动物子宫，发育成携带外源基因的动物。逆转录病毒感染法逆转录病毒感染法外源基因外源基因外源基因外源基因逆转录病毒载体逆转录病毒载体逆转录病毒载体

5、逆转录病毒载体逆转录病毒感染逆转录病毒感染逆转录病毒感染逆转录病毒感染四四四四/八细胞胚胎八细胞胚胎八细胞胚胎八细胞胚胎/囊胚囊胚囊胚囊胚/原肠胚原肠胚原肠胚原肠胚嵌合小鼠嵌合小鼠嵌合小鼠嵌合小鼠纯合体小鼠纯合体小鼠纯合体小鼠纯合体小鼠逆转录病毒感染法的特点z通过病毒 DNA 插入宿主 DNA 的机制，将外源目的基因整合到宿主基因组，整合效率高。z反转录病毒载体容量有限，只能转移小片段DNA(10kb)。z对家禽类的转基因研究有重要意义。4）精子载体法外源 DNA精子 卵细胞 受精卵 转基因动物共育法脂质体转染法电穿孔法DNA精子受精卵DNA卵细胞DNA胚胎干细胞DNA逆转录病毒感染磷酸钙-D

6、NA共沉淀法逆转录病毒感染法电穿孔法四细胞胚胎囊胚原肠胚转基因动物微注射显微注射3.下游基因整合与表达检测及筛选染色体基因水平：是否整合了外源基因以及整合的位点和拷贝数。转录水平：转基因的 mRNA 的存在与否以及表达水平。蛋白水平：转基因的蛋白质的表达以及功能检测。鉴定方法PCRSouthern blot染色体原位杂交Northern blotRT-PCRWestern blot基因转移鼠纯合鼠系的建立转基因杂合鼠未转基因鼠生殖系细胞中不含转入基因生殖系细胞中含转入基因子代多次交配可得到纯合转基因鼠系n分析动物表型与外源基因的关系，揭示外源基因的功能。n建立人类疾病的转基因动物模型。n基因产

7、品的制备：乳腺、膀胱生物反应器。三.转基因动物的应用1.人类疾病的转基因动物模型z各种人类遗传病的鼠模型，如：y老年性痴呆症(Alzheimersdisease)、y关节炎(arthritis)、y肌肉营养缺乏症(muscular distrophy)、y肿瘤发生(tumorigenesis)、y高血压(hypertension)、y神经退行性疾病(neurodegenenerative disorder)、y内分泌功能障碍(endocrinological disfunction)、y动脉硬化症及其他很多疾病。2.利用转基因动物反应器生产药用蛋白z转基因动物反应器：乳腺、膀胱、血液生物反应器

8、z抗凝血酶 III：转基因绵羊的乳汁中。z乳球蛋白z红细胞生成素z凝血因子 VIIIz凝血因子 IXz生长激素3.转基因改良移植器官z改造异种来源器官的遗传性状，使之适应于人体器官或组织的移植。z1997 年起，利用遗传改良的转基因猪肝做为严重肝病患者的离体生命支持物。4.动物的克隆z1996 年，首次实现动物的无性生殖。z由绵羊的乳腺细胞提供细胞核，卵细胞提供细胞质发育而来。z核移植技术（Nuclear Transfer)核移植技术（Nuclear Transfer)第二节 基因打靶基因打靶(Gene Targeting)：通过 DNA 定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，在生物活体内

9、研究此基因的功能。基因敲除(gene knockout):删除靶基因的重要功能区，使靶基因失活。基因敲入(gene knockin):将外源基因整合到特定靶位点，进行特异性表达。一、基因打靶的基本程序z打靶载体的构建。z打靶载体导入 ES 细胞及其鉴定。z基因敲除 ES 细胞注射入胚泡。z胚泡植入假孕小鼠的子宫。z嵌合体的杂交建立基因打靶的纯合鼠系。1.打靶载体的构建同源基因片段同源基因片段同源基因片段同源基因片段质粒载体质粒载体质粒载体质粒载体HB1HB1 HB2HB2neoneor r基因基因基因基因HSV-tkHSV-tk基因基因基因基因2.打靶载体导入ES细胞磷酸钙-DNA 共沉淀法逆

10、转录病毒感染法电穿孔法脂质体转染法显微注射法（1）打靶载体的正-负选择z与整合位点两端区域同源的两段 DNA 序列(HB1和HB2)。z目的基因。z编码抗 G418 的新霉素磷酸转移酶基因（neor基因）。z2个不同的胸苷激酶基因（HSV-tk1和HSV-tk2），分别来自I 型II型单纯疱疹病毒。打靶载体的正筛选 tk1 HB1 neor HB2 tk2载体载体同源重组neorG418正筛选，细胞存活染色体染色体打靶载体的负筛选 tk1 HB1 tk1 HB1 neoneor r HB2 tk2 HB2 tk2染色体染色体染色体染色体非特异性整合非特异性整合 GCVGCV负筛选，细胞死亡负筛

11、选，细胞死亡（2）PCR 鉴定z在打靶载体的 HB1 和 HB2 之间，加上一个载体和鼠的基因组中都没有的独特DNA 序列（US）。z如发生随机整合，PCR 无法扩增出预期的DNA 片段。z如果整合于特定位点时，则 PCR 可以扩增出预期大小的片段。PCR 鉴定：特异整合 tk1 HB1 US neor HB2 tk2P2P1PCR反应有特异条带特异整合3.基因敲除小鼠的获得z基因敲除ES细胞注射入胚泡z胚泡植入假孕小鼠的子宫z嵌合体的杂交育种：同源重组只发生在一条染色体上，因而同源重组后只能得到嵌合体，将嵌合体杂交，即可得到纯合子。第三节 基因沉默在RNA水平上研究基因功能的方法：（一）反义

12、RNA（二）RNA干扰技术 （二）RNA 干扰z1990 年，Jorgense 等通过 转基因改造牵牛花颜色。z外源基因不但不能加深花的颜色，反而造成内源基因表达的降低。RNA 干扰是dsRNA 导致的基因沉默z1998 年，Fire 等在 C.elegans 中用 antisense RNA 抑制基因表达。yds RNA 比 sense 或 antisense RNA 都好。y注射甚至口服 dsRNA 都能诱发基因沉默。y很少量的ds RNA 就能诱发 C.elegans 整体的基因沉默，甚至能传递到子一代。zRNA 干扰：RNA interference(RNAi)RNAi 是真核生物中广

13、泛存在的现象植物：干扰因素自叶脉向外扩散，绿色荧光蛋白(GFP)基因被抑制，显露出红色。线虫：左侧为 GFP 转基因线虫；右侧线虫则经 GFP dsRNA 处理。部分细胞 RNAi 相关蛋白表达较低，仍有绿色荧光。Hela 细胞：经 ORC6 siRNA 作用后，细胞出现多核现象。绿色为 tubulin，红色为 DNA。ORC6 细胞分裂调控蛋白。果蝇：右侧果蝇为野生型，左侧为 shRNA 造成的色素缺乏的缺陷型。1.RNA 干扰zRNA 干扰(RNAi)：由短双链 RNA 诱导的同源 mRNA 降解，抑制基因表达。zRNA 干扰技术可以用于基因敲除，选择性关闭特定细胞基因。（1）siRNA

14、的产生zDicer：RNase III 的一种，可降解 dsRNA 成 siRNA。zsiRNA(Short interfering RNA)：2123nt（2）siRNA 诱导同源序列的降解zRNA-Induced Silencing Complex（RNA诱导的沉默复合物）z产生两种后果：y同源 mRNA 的降解。y同源 mRNA 翻译受阻。2.基因沉默的机制是多方面的zdsRNA 造成的 mRNA 降解。转录后基因沉默(Post-translational gene silencing)zdsRNA 造成同源性基因的甲基化和表达关闭。zdsRNA 造成染色质结构变化。zdsRNA 对蛋白

15、质的合成产生影响。RNAi 和基因敲除z在基因组 DNA 上，通过同源重组进行的基因敲除。z在 mRNA 水平进行的基因敲除：y反义RNAy核酶(Ribozyme)yRNAi：dsRNA;siRNA;shRNA3.dsRNA 能够诱发细胞的抗病毒反应z在哺乳动物存在干扰素相关的抗病毒体系。zdsRNA 激活 dsRNA-dependent protein kinase(PKR)，进一步诱导非序列依赖的内源性 RNA 降解。z在胚胎期细胞，上述非特异的抗病毒体系尚未形成。通过 dsRNA 可以诱导序列特异的 RNAi。3.siRNA 与 shRNAz 30bp siRNA 可以诱导 RNAi，并克服哺乳细胞的障碍。zShort hairpin RNA：(shRNA)z可达成稳定的基因敲除。shRNA 与 siRNA 的比较zsiRNAy应用非常方便，干扰效力往往比较高。y只能进行达成瞬时的基因表达抑制。在线虫和植物，siRNA 可扩增，但哺乳细胞不能。zshRNAy前期工作比较复杂。y可以进行稳定的基因表达抑制。结束结束