1.2.1基因工程的基本操作程序.ppt

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1、基因工程的基因工程的 基本操作程序基本操作程序基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、获取目的基因一、获取目的基因(一一)、目的基因的概念及基因的结构、目的基因的概念及基因的结构1 1、目的基因、目的基因主要是指主要是指_，编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因也可以是一些起也可以是一些起调控作用的因子调控作用的因子原核细胞基因原核细胞基因真核细胞基因真核细胞基因结构图结构图编码区连编码区连续性续性编码序列编码序列位置位置非编码序非编码序列位置列位置2 2、原核细胞基因与真核细胞基因的比较、原核细胞基因与真核细胞基因的比较连续连续不连续不连续非编码区非编码区非编码区和编码区中的内含子

2、非编码区和编码区中的内含子编码区编码区编码区中的外显子编码区中的外显子(二二)、获取目的基因的常用方法、获取目的基因的常用方法1、从基因文库中获取目的基因(1）、基因文库概念：）、基因文库概念：将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片断，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌片断，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌片断，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌片断，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库分别含有这种生物的不同基因，称为基

3、因文库分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库基因组文库与部分基因文库的比较文库类型文库类型基因组文库基因组文库cDNAcDNA文库文库构建方法基因多少文库大小有无启动子有无内含子物种间基因交流大大某种生物的全部基因某种生物的全部基因某种生物的部分基因小有有无有有无部分基因可以部分基因可以可以（2）基因文库的类型（3 3）、从基因文库中筛选目的基因应考虑的因素：序列、功能、位置）、从基因文库中筛选目的基因应考虑的因素：序列、功能、位置转录产物、表过产物等转录产物、表过产物等 (1(1）、）、PCR的原理：的原理：DNADNA双链复制双链复制 2 2、PCRPCR技术（多聚酶链式反应）技术（多聚

4、酶链式反应）5/3/GGTC3/5/GACC5/3/AG引物引物5/3/GG引物引物(2）、PCR过程变性变性（90-9590-95）：）：高温使高温使H H键断裂，形键断裂，形成单链成单链DNADNA复性（复性（55-6055-60）：）：引物与引物与DNADNA模板结合，模板结合，延伸延伸（70-7570-75）在）在TaqTaq酶的作用下，以酶的作用下，以dATPdTTPdGTPdCTPdATPdTTPdGTPdCTP为原料合成与模板互为原料合成与模板互补的子链补的子链（3)、特点：指数式扩增（约2n）n（4)、前提：模板：引物：原料：酶：一段已知目的基因的核苷酸序列（以便根据已知序列合

5、成引物）目的基因2条（人工合成，2条引物不一定互补）dCTP、dGTP、dATP、dTTP耐高温DNA聚合酶（Taq酶）PCR技技术术与生物体内与生物体内DNA复制的比复制的比较较项项目目PCR技技术术DNA复制复制不同不同点点解旋方式解旋方式相同点高温高温变变性解旋性解旋解旋解旋酶酶催化催化场场所所体外体外主要在主要在细细胞核内胞核内酶酶热稳热稳定的定的DNA聚合聚合酶酶解旋解旋酶酶、DNA聚聚合合酶酶温度条件温度条件在在较较高温度下高温度下进进行，行，不同不同过过程温度不同程温度不同常温原理原理DNA双双链链复制复制原料原料四种游离的脱氧核苷酸四种游离的脱氧核苷酸条件条件需模板、需模板、能

6、量能量、酶酶等等用用DNA合成合成仪合成合成3 3、化学方法人工合成、化学方法人工合成适用于核苷酸序列已知且碱基数较少的基因适用于核苷酸序列已知且碱基数较少的基因二二.基因表达基因表达载载体的构建体的构建基因工程的核心：基因工程的核心：1 1、目的。、目的。使目的基因在使目的基因在_中中稳稳定存在，并且可以定存在，并且可以遗传给遗传给下一代。下一代。使目的基因能使目的基因能够够_和和发挥发挥作用。作用。2 2、组组成：成：_+_+目的基因目的基因+_+_+标记标记基因基因(如抗生素抗性基因如抗生素抗性基因)受体受体细细胞胞表达表达启启动动子子终终止子止子3 3、基因表达载体的构建过程：、基因表

7、达载体的构建过程：限制酶限制酶A识别：识别：5-ATGATCAT 3-TACTAGTA，切割位点是，切割位点是T与与G之间；之间；限制酶限制酶B识别：识别：5-CAGATCTG 3-GTCTAGAC，切割位点是，切割位点是A与与G之间之间 但是它们产生的粘性末端都是：但是它们产生的粘性末端都是：GATC 只能用同一种限制酶吗？例1.(20分)(2014天津高考)嗜热土壤芽孢杆菌产生的-葡萄糖苷酶(BglB)是一种耐热纤维素酶。（1）PCR扩增bglB基因时，选用嗜热土壤芽孢杆菌基因组DNA作 。（2）、下图为质粒限制酶酶切图谱。bglB基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的bglB基因重

8、组进该质粒，扩增的bglB基因两端需分别引入和不同限制酶的识别序列。NdeBamH模板例2.下图是将某细菌的基因A导入大肠杆菌，制备“工程菌”的示意图据图回答：(1)获得A有两条途径：一是以A的mRNA为模板，在酶的催化下，合成互补的单链DNA，然后在 的作用下合成双链DNA；二是根据目标蛋白质的序列，推测出相应的mRNA序列，再按照碱基互补配对原则，推测其DNA的序列，再通过化学方法合成所需基因。(2)利用PCR技术扩增DNA时，需添加的有机物质有4种脱氧核糖核苷酸耐热性的 和、。(3)由A和载体B拼接形成的C通常称为。(4)在基因工程中，常用Ca2+处理D，其目的是 逆转录DNA聚合酶氨基

9、酸脱氧核苷酸引物模板(A基因)基因表达载体使其成为感受态细胞，有利于吸收重组DNA分子DNA聚合酶例3、以下实例为体外处理“蛋白质-DNA复合体”获得DNA片段信息的过程图。据图回答：(1)过程酶作用的部位是，此过程只发生在非结合区DNA，过程酶作用的部位是。(2)两过程利用了酶的特性。(3)若将得到的DNA片段用于构建重组质粒，需要将过程的测序结果与酶的识别序列进行比对，以确定选用何种酶。(4)如果复合体中的蛋白质为RNA聚合酶，则其识别、结合的DNA序列区为基因的。磷酸二酯键肽键专一性限制性核酸内切启动子(或转录起始区)(5)以下研究利用了生物分子间特异性结合性质的有(多选)A.分离得到核

10、糖体，用蛋白酶酶解后提取rRNAB.用无水乙醇处理菠菜叶片，提取叶绿体基粒膜上的光合色素C.通过分子杂交手段，用荧光物质标记的目的基因进行染色体基因定位D.将抑制成熟基因导入番茄，其mRNA与催化成熟酶基因的mRNA互补结合，终止后者翻译，延迟果实成熟A、C、D例例4.(20144.(2014新新课标课标全国卷全国卷)植物甲具有极植物甲具有极强强的耐旱性，其耐旱性与的耐旱性，其耐旱性与某个基因有关，若从某个基因有关，若从该该植物中植物中获获得得该该耐旱基因，并将其耐旱基因，并将其转转移到耐旱性移到耐旱性低的植物乙中，有可能提高后者的耐旱性。回答下列低的植物乙中，有可能提高后者的耐旱性。回答下列

11、问题问题：(1)(1)理理论论上，基因上，基因组组文文库库含有生物的含有生物的基因；而基因；而cDNAcDNA文文库库含有含有生物的生物的基因。基因。(2)(2)若要从植物甲中若要从植物甲中获获得耐旱基因，可首先建立得耐旱基因，可首先建立该该植物的基因植物的基因组组文文库库，再从中再从中出所需的耐旱基因。出所需的耐旱基因。全部部分筛选(4)(4)将耐旱基因将耐旱基因导导入入农农杆菌，并通杆菌，并通过农过农杆菌杆菌转转化法将其化法将其导导入植物入植物乙乙的的体体细细胞中，胞中，经过经过一系列的一系列的过过程得到再生植株。要确程得到再生植株。要确认该认该耐旱基因是耐旱基因是否在再生植株中正确表达，

12、否在再生植株中正确表达，应检测应检测此再生植株中此再生植株中该该基因的基因的，如果如果检测结检测结果呈阳性，再在田果呈阳性，再在田间试验间试验中中检测检测植株的植株的是否得是否得到提高到提高(4)(4)假如用得到的二倍体假如用得到的二倍体转转基因耐旱植株自交，子代中耐旱与不耐基因耐旱植株自交，子代中耐旱与不耐旱植株的数量比旱植株的数量比为为3131时时，则则可推可推测该测该耐旱基因整合到了耐旱基因整合到了(填填“同源染色体的一条上同源染色体的一条上”或或“同源同源染色体的两条上染色体的两条上”)。(三三)将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞转化转化:方法方法导入植物细胞导入植物细胞导入

13、动物细胞导入动物细胞导入微生物细胞导入微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞法感受态细胞法目的基因进入目的基因进入_ _ 内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方法：（1 1）农杆菌转化法农杆菌转化法(适合双子植物适合双子植物)（2）基因枪法（3）花粉管通道法2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞-显微注射法显微注射法3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞（1）原核生

14、物特点：）原核生物特点：单细胞、遗传物质少、单细胞、遗传物质少、繁殖快繁殖快（2）方法）方法步骤步骤：用用CaCa2+2+处理细胞得到感受态细胞处理细胞得到感受态细胞表达载体与感受态细胞混合表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNADNA分子分子四四.目的基因的检测与鉴定：目的基因的检测与鉴定：步步骤骤检测检测内容内容方法方法标记基标记基因筛选因筛选筛选出含目的基因的细胞筛选出含目的基因的细胞利用标记基因进行筛选利用标记基因进行筛选分分子子检检测测第一步第一步转转基因生物的基因生物的DNADNA上是否上是否插入了插入了_DNADNA分子分子杂杂交技交技术术(DNA(DNA和和

15、DNADNA之之间间)第二步第二步目的基因是否目的基因是否转录转录出了出了_分子分子杂杂交技交技术术(DNA(DNA和和mRNAmRNA之之间间)第三步第三步目的基因是否翻目的基因是否翻译译成成_抗原抗原抗体抗体杂杂交技交技术术个体生物学个体生物学水平水平鉴鉴定定抗虫或抗病接种抗虫或抗病接种实验实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度，以确定是否有抗性以及抗性的程度目的基因目的基因mRNAmRNA蛋白蛋白质质1、利用标志基因进行筛选的原理与方法 为为了了检测检测重重组质组质粒是否粒是否导导入原本无入原本无ampR和和tetR的大的大肠肠杆菌，将大杆菌，将大肠肠杆菌在含氨杆菌在含氨苄苄青霉素的培养基

16、上培养，得到如青霉素的培养基上培养，得到如图图二的菌落。再将二的菌落。再将灭灭菌菌绒绒布按到培养基上，使布按到培养基上，使绒绒布面沾上菌落，然后将布面沾上菌落，然后将绒绒布按到含四布按到含四环环素的培养基上培养，得到如素的培养基上培养，得到如图图三的三的结结果果(空圈表示与空圈表示与图图二二对对照无菌落的位置照无菌落的位置)。与与图图三空圈相三空圈相对应对应的的图图二中的菌落表二中的菌落表现现型型是是_ _，图图三三结结果果显显示，多数大示，多数大肠肠杆菌杆菌导导入的是入的是_。能抗氨能抗氨苄苄青霉素，但不能抗四青霉素，但不能抗四环环素素pBR322质质粒粒2、DNA分子杂交的原理与方法变性2

17、.(20152.(2015威海模威海模拟拟)科学家将人的生科学家将人的生长长激素基因与某种激素基因与某种细细菌菌(不含抗不含抗生素抗性基因生素抗性基因)的的DNADNA分子分子进进行重行重组组，并成功地在，并成功地在该细该细菌中得以表达菌中得以表达(如下如下图图)。请请据据图图分析回答：分析回答：(1)(1)过过程程所示所示获获取目的基因的方法是取目的基因的方法是。(2)(2)细细菌是理想的受体菌是理想的受体细细胞，胞，这这是因是因为为它它。(3)(3)质质粒粒A A与目的基因与目的基因结结合合时时，首先需要用，首先需要用酶酶将将质质粒切开粒切开“缺口缺口”，然后用，然后用酶酶将将质质粒与目的

18、基因粒与目的基因“缝缝合合”起来。起来。逆转录法逆转录法(反转录法反转录法)繁殖快、单细胞、遗传物质较少繁殖快、单细胞、遗传物质较少限制性核酸内切限制性核酸内切DNADNA连接连接(4)(4)若将若将细细菌菌B B先接种在含有先接种在含有 的培养基上能生的培养基上能生长长，说说明明该该细细菌中已菌中已经导经导入外源入外源质质粒，但不能粒，但不能说说明外源明外源质质粒是否成功插入目的基粒是否成功插入目的基因；若将因；若将细细菌菌B B再重新接种在含有再重新接种在含有 的培养基上不能生的培养基上不能生长长，则说则说明明细细菌菌B B中已中已经导经导入了插入目的基因的重入了插入目的基因的重组质组质粒

19、。粒。(5)(5)检测检测工程菌中的生工程菌中的生长长激素基因是否激素基因是否转录转录出出mRNAmRNA和是否翻和是否翻译译出生出生长长激素，可采用的技激素，可采用的技术术分分别别是是 、。氨苄青霉素氨苄青霉素四环素四环素核酸分子杂交抗原核酸分子杂交抗原抗体杂交抗体杂交4.(20154.(2015唐山模唐山模拟拟)基因工程是在基因工程是在现现代生物学、化学和工程学基代生物学、化学和工程学基础础上上建立和建立和发发展起来的，并有展起来的，并有赖赖于微生物学理于微生物学理论论和技和技术术的的发发展运用。基因展运用。基因工程基本操作流程如下工程基本操作流程如下图图，请请据据图图分析回答分析回答问题

20、问题：(1)(1)图图中中A A是是。(2)(2)在上述基因工程的操作在上述基因工程的操作过过程中，可以遵循碱基互程中，可以遵循碱基互补补配配对对原原则则的的步步骤骤有有(用用图图解中序号表示解中序号表示)。(3)(3)不同种生物之不同种生物之间间的基因移植成功，从分子水平分析，的基因移植成功，从分子水平分析，进进行基因行基因工程的主要理工程的主要理论论依据是不同生物的依据是不同生物的DNADNA结结构的基本形式构的基本形式(填相填相同、不相同同、不相同)，也，也说说明了生物共用一套明了生物共用一套。载体相同遗传密码子(4)(4)研究中研究中发现发现，番茄体内的蛋白，番茄体内的蛋白酶酶抑制抑制

21、剂对剂对害虫的消化害虫的消化酶酶有抑制作有抑制作用，用，导导致害虫无法消化食物而被致害虫无法消化食物而被杀杀死，人死，人们们成功地将番茄的蛋白成功地将番茄的蛋白酶酶抑制抑制剂剂基因基因导导入玉米体内，玉米入玉米体内，玉米获获得了与番茄相似的抗虫性状，玉得了与番茄相似的抗虫性状，玉米米这这种种变变异的来源是异的来源是。基因重组(5)科学家在某种植物中找到了抗枯萎病的基因，并用基因工程的方法将该基因导入金茶花叶片细胞的染色体DNA上，经培养长成的植株具备了抗病性，这说明目的基因(抗枯萎病的基因)已。如果把该基因导入叶绿体DNA中，将来产生的配子中_(填“一定”或“不一定”)含有抗病基因。表达不一定

22、【解析解析】(1)图中中A A是运是运载目的基因的目的基因的载体。体。(2)基因工程的操作步基因工程的操作步骤包括包括获取目的基因，基因表达取目的基因，基因表达载体的构建，体的构建，将目的基因将目的基因导入受体入受体细胞，目的基因的胞，目的基因的检测与与鉴定。只有将目的基因定。只有将目的基因导入受体入受体细胞胞过程不遵循碱基互程不遵循碱基互补配配对原原则。(3)基因工程的操作基基因工程的操作基础是不同生物的是不同生物的DNA结构基本形式相同，且共构基本形式相同，且共用一套用一套遗传密密码子。子。(4)基因工程又称基因工程又称DNA重重组技技术，其，其变异原理异原理为基因重基因重组。(5)如果把

23、抗枯萎病的基因如果把抗枯萎病的基因导入叶入叶绿体体DNA中，将来中，将来产生的雌配子中生的雌配子中可能含有抗病基因，雄配子中不含抗病基因。可能含有抗病基因，雄配子中不含抗病基因。【考考题题回回访访】1.(20151.(2015石家庄模石家庄模拟拟)据据图图表回答表回答问题问题：(1)(1)假假设设所用的限制所用的限制酶酶均能将所均能将所识别识别的位点完全切开，采用的位点完全切开，采用EcoREcoR和和PstPst酶酶切含有目的基因的切含有目的基因的DNADNA，能得到，能得到种种DNADNA片段。如果将片段。如果将质质粒粒载载体和含目的基因的体和含目的基因的DNADNA片段只用片段只用Eco

24、REcoR酶酶切，切，酶酶切切产产物再加入物再加入DNADNA连连接接酶酶，其中由两个，其中由两个DNADNA片段之片段之间连间连接形成接形成的的产产物有物有 、4质粒质粒连接物目的基因目的基因连接物质粒目的基因连接物(2)为了防止目的基因和质粒表达载体酶切后的末端任意连接，酶切时应该选用的酶是、。EcoRSma（3 3）若启）若启动动子位于子位于图图中中质质粒粒SmaSma和和EcoREcoR酶酶切位点之切位点之间间(左左侧侧)，能，能否用否用EcoREcoR和和SmaSma进进行切割，行切割，进进而而连连接？接？为为什么？什么？不能。这样会使质粒中的启动子丢失，使形成的基因表达载体无法转录

25、。不能转录出信使不能转录出信使RNARNA，不能编码蛋白质。，不能编码蛋白质。有调控序列，如启动子和终止子有调控序列，如启动子和终止子：能转录出信使：能转录出信使RNARNA，能编码蛋白质，能编码蛋白质 编码区编码区非编码区非编码区原核细原核细胞胞 基因基因结构结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 启动子启动子终止子终止子2、原核细胞的基因结构注意：启动子注意：启动子起始密码子，终止子起始密码子，终止子终止密码子：启动子和终止子终止密码子：启动子和终止子位于位于DNADNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止；起始密码子和终片段上，分别控制转录过程的启动和终止；起始密码子和终止密码子位于止密码子位于mRNAmRNA上，分别控制翻译的起始和终止。上，分别控制翻译的起始和终止。3 3：真核细胞的基因结构：真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子（不编内含子（不编码蛋白质）码蛋白质）外显子（编码外显子（编码蛋白质）蛋白质）启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游