最新张亚平,蛋白质组技术PPT课件.ppt
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1、进入夏天,少不了一个热字当头,电扇空调陆续登场,每逢此时,总会想起进入夏天,少不了一个热字当头,电扇空调陆续登场,每逢此时,总会想起那一把蒲扇。蒲扇,是记忆中的农村,夏季经常用的一件物品。记忆中的故那一把蒲扇。蒲扇,是记忆中的农村,夏季经常用的一件物品。记忆中的故乡,每逢进入夏天,集市上最常见的便是蒲扇、凉席,不论男女老少,个个手持乡,每逢进入夏天,集市上最常见的便是蒲扇、凉席,不论男女老少,个个手持一把,忽闪忽闪个不停,嘴里叨叨着一把,忽闪忽闪个不停,嘴里叨叨着“怎么这么热怎么这么热”,于是三五成群,聚在大树,于是三五成群,聚在大树下,或站着,或随即坐在石头上,手持那把扇子,边唠嗑边乘凉。孩
2、子们却在周下,或站着,或随即坐在石头上,手持那把扇子,边唠嗑边乘凉。孩子们却在周围跑跑跳跳,热得满头大汗,不时听到围跑跑跳跳,热得满头大汗,不时听到“强子,别跑了,快来我给你扇扇强子,别跑了,快来我给你扇扇”。孩。孩子们才不听这一套,跑个没完,直到累气喘吁吁,这才一跑一踮地围过了,这时子们才不听这一套,跑个没完,直到累气喘吁吁,这才一跑一踮地围过了,这时母亲总是,好似生气的样子,边扇边训,母亲总是,好似生气的样子,边扇边训,“你看热的,跑什么?你看热的,跑什么?”此时这把蒲扇,此时这把蒲扇,是那么凉快,那么的温馨幸福,有母亲的味道!蒲扇是中国传统工艺品,在是那么凉快,那么的温馨幸福,有母亲的味
3、道!蒲扇是中国传统工艺品,在我国已有三千年多年的历史。取材于棕榈树,制作简单,方便携带,且蒲扇的表我国已有三千年多年的历史。取材于棕榈树,制作简单,方便携带,且蒲扇的表面光滑,因而,古人常会在上面作画。古有棕扇、葵扇、蒲扇、蕉扇诸名,实即面光滑,因而,古人常会在上面作画。古有棕扇、葵扇、蒲扇、蕉扇诸名,实即今日的蒲扇,江浙称之为芭蕉扇。六七十年代,人们最常用的就是这种,似圆非今日的蒲扇,江浙称之为芭蕉扇。六七十年代,人们最常用的就是这种,似圆非圆,轻巧又便宜的蒲扇。蒲扇流传至今,我的记忆中,它跨越了半个世纪,圆,轻巧又便宜的蒲扇。蒲扇流传至今,我的记忆中,它跨越了半个世纪,也走过了我们的半个人
4、生的轨迹,携带着特有的念想,一年年,一天天,流向长也走过了我们的半个人生的轨迹,携带着特有的念想,一年年,一天天,流向长长的时间隧道,袅长的时间隧道,袅张亚平,蛋白质组技术什么是蛋白质组?什么是蛋白质组?(一)、双向凝胶电泳的原理等电聚焦(Isoelectric focusing,IEF)蛋白质是两性电解质 在等电聚焦中蛋白质总是向与其等电点相同的pH位置移动并停留在此位置上 等电点相同的蛋白质都聚焦在与等电点相同的pH位置上pH1pH14-pI+SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠(SDS)是一种阴离子去污剂,带大量的负电荷 SDS与蛋白质结合,其所带负电荷大大超过蛋白质所带电荷量,消除了不同蛋
5、白之间所带电荷的差异 SDS-PAGE中,蛋白质迁移率只与蛋白质的分子量有关 先根据蛋白质的等电点不同,利用等电聚焦进行第一向分离,将等电点相同的蛋白质集中在与等电点相同的pH区再以与等电聚焦成90度角的方向进行SDS-PAGE第二向分离,将等电点相同的蛋白质再按分子量大小彼此分开以此将复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上以点的形状分离。蛋白质双向凝胶电泳是各种蛋白质分离分析方法中唯一能同时分辨上千个蛋白质点的技术 蛋白质组学研究中主要的分离技术二)、双向凝胶电泳技术操作的基本过程提取蛋白样品,进行样品的预处理进行第一向等电聚焦电泳等电聚焦后的胶条经过平衡转移到第二向凝胶上,与等电聚焦呈垂直方
6、向进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳用银或考马斯亮蓝染色,经双向凝胶电泳图像分析软件进行凝胶图像分析 找出差异表达的蛋白质点细胞的破碎cell disruption去除干扰物removal of interfering substances蛋白溶解 solubilization of the proteins离子,脂质,多糖,DNA,RNA,酚类等样品制备样品制备中遵循以下原则样品制备中遵循以下原则:样本制备步骤尽可能简单样本制备步骤尽可能简单,以避免不必要的蛋白质损失;以避免不必要的蛋白质损失;裂解细胞或组织的方法应尽可能减少蛋白酶解裂解细胞或组织的方法应尽可能减少蛋白酶解(proteolysi
7、s)或降解或降解(degradation);;避免反复冻融样本。避免反复冻融样本。样本于双向电泳前新鲜制备及溶解样本于双向电泳前新鲜制备及溶解;去除样本中的脱氧核糖核酸去除样本中的脱氧核糖核酸(DNA),核糖核酸核糖核酸(RNA),脂脂质等;质等;在样本加入尿素后避免加热;在样本加入尿素后避免加热;蛋白质提取一般使用含有变性剂、表面活性剂、还原剂、蛋白质提取一般使用含有变性剂、表面活性剂、还原剂、固定固定pH梯度缓冲液梯度缓冲液(IPGbuffer)。提取的主要方法是对细胞、组织等样品进行破碎、溶解、提取的主要方法是对细胞、组织等样品进行破碎、溶解、失活或还原失活或还原,尽可能断开蛋白质间的连
8、接键尽可能断开蛋白质间的连接键,再采用三氯乙再采用三氯乙酸与冷丙酮联用来沉淀提取全部蛋白质。酸与冷丙酮联用来沉淀提取全部蛋白质。第一向:变性的等电聚焦电泳,根据蛋白质的等电点进行分离第二向:SDS 聚丙烯酰胺电泳,根据蛋白质分子量进行分离(三)、双向凝胶电泳过程中需要注意的问题1.双向凝胶电泳结果的可重复性蛋白质样品制备是关键 1).尽可能地使蛋白质组中的各种蛋白质成分都溶解在裂解液中 2).防止制备过程中蛋白成分的降解与修饰 3).要保证蛋白质彻底变性 4).取材要有重现性:用细胞 不用组织5)裂解液中需加:尿素断裂蛋白质的氢键和疏水键 还原剂破坏蛋白质中的二硫键 兼性离子去垢剂增加疏水性氨
9、基酸残基的溶解性 6)整个制备过程需在低温环境中进行,在裂解液中加入蛋白酶抑制剂用固相pH梯度等电聚焦(IPG)防止阴极飘移,pH 梯度不稳定 载体两性电解质在电场中依据其等电点形成pH梯度,这种pH梯度因阴极飘移而不稳定,缺少重现性。IPG中的pH梯度是凝胶聚合过程中通过酸性和碱性丙烯酰胺缓冲液形成的,是稳定的 双向电泳中的等电聚焦选用IPG2 凝胶中蛋白质的染色同位素同位素是目前已知最灵敏的蛋白质染色方法同位素是在细胞代谢过程中掺入蛋白质的,不同蛋白质掺入的同位素量不同,因此同位素强度不能代表蛋白质的实际丰度 同位素标记的蛋白质不能直接用于后续的鉴定实验 银染色 银染色是除同位素外最灵敏的
10、染色方法 只需110ng蛋白质即可显示出条带。酸性的硝酸银染色法更适合酸性蛋白的染色,碱性的银氨染色法对碱性蛋白质的灵敏度稍高 双向电泳的染色(银染)双向电泳的染色(银染)考马斯亮蓝染色 考马斯亮蓝R-250为三苯基甲烷,考马斯亮蓝G-250为二甲花青亮蓝 R-250比G-250的灵敏度稍高,100ng左右蛋白质即可显示出条带,G-250更适合染色小分子多肽 方法简便,是最常用的染色方法 脱色后的蛋白质样品可用于质谱分析等后续研究 双向电泳的染色(考马斯亮蓝染色)双向电泳的染色(考马斯亮蓝染色)非共价修饰的荧光染料 如Sypro red 和Sypro orange 灵敏度可与银染媲美 方法简单
11、,一步染色,无需脱色 样品可直接用于序列测定和质谱分析锌、铜负染 凝胶背景为不透明的乳白色或青绿色,蛋白斑点则是透明的灵敏度介于银染和考马斯亮蓝染色之间染色对后续分析的干扰较小目前在蛋白质组研究中经常将两种染色方法结合使用先经银染分析确定有意义的蛋白斑点,再加大上样量,重作电泳,用考马斯亮蓝染色纯化的样品经脱色后进一步进行质谱鉴定 差异凝胶电泳(Differential gel electrophoresis)2、质谱仪的基本组成、质谱仪的基本组成1.气体扩散2.直接进样3.气相色谱1.电子轰击2.化学电离3.场致电离4.激光 1.单聚焦 2.双聚焦 3.飞行时间4.四极杆 质谱图意义质谱图意
12、义A:离子的相对强度离子的相对强度(Yaxis)B:离子的质量与电荷比离子的质量与电荷比(m/z,Xaxis)C:质谱图中最强的峰称为基峰质谱图中最强的峰称为基峰(basepeak)D:相对于特定的检测器时称为峰的绝对强度相对于特定的检测器时称为峰的绝对强度E:所有质谱峰对应的是离子电信号强度和离子应在所有质谱峰对应的是离子电信号强度和离子应在m/z位置而非真实的离子强度和离子位置而非真实的离子强度和离子.F:棒状谱棒状谱(centroidalpeak)G:高斯峰高斯峰(gausspeak)基基质辅质辅助激光解吸助激光解吸电电离离飞飞行行时间质谱时间质谱 (MALDI-TOF)MALDI-TO
13、F)(1)主要技术主要技术基质辅助激光解吸电离基质辅助激光解吸电离(Matrix-assisted laser desorption/ionization,MALDI)技术线线性性飞飞行行时间质时间质量量检测检测器器(time of flighttime of flight,TOF)TOF)MALDI原理:将将分分析析物物分分散散在在基基质质分分子子(尼尼古古丁丁酸酸及及其其同同系系物物)中中并并形形成成晶晶体体,当当用用激激光光(337nm的的氮氮激激光光)照照射射晶晶体体时时,基基质质分分子子吸吸收收激激光光能能量量,样样品品解解吸吸附附,基基质质样样品品之之间间发发生生电电荷荷转转移移使
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