大肠杆菌宿主菌蛋白质残留量.doc

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1、 页号：1/4江苏金丝利药业有限公司 操作规程题 目大肠杆菌宿主菌蛋白质残留量检验标准操作规程编 号QC-OS-026-06复 印 号制 定 人审 核 人批 准 人制定日期审核日期批准日期颁发部门质检部生效日期分发部门（岗位）：档案室、生产部、质检部、理化检测2修订原因及目的：对配液及具体操作进行细化完善。标题：进一步加强注射用重组人白介素-2原液大肠杆菌宿主菌蛋白质残留量的控制。范围：注射用重组人白介素-2原液大肠杆菌宿主菌蛋白质残留量的检测。责任人：质检部经理、理化检测人员正文：一 制订依据：中国药典2010 年版三部。 简述：利用酶联免疫法测定大肠杆菌表达系统生产的重组制品中菌体蛋白质残

2、留量，具体如下：将兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体包被，结合菌体蛋白，再和有辣根过氧化酶标记的兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体结合，加入底物，产生的物质在492nm处测吸光度，与参考品的标准曲线对照，即可得原液中菌体蛋白的含量。二 规程：1 仪器与用具1.1 CS-9301PC型酶标仪 日本岛津制作所。1.2 Multiskan FC酶标仪 美国Thermo Scientific1.3 96孔细胞培养板。1.4 37恒温培养箱。1.5 BCD-180WD型冰箱 上菱冰箱厂。1.6 移液枪 美国Thermo Scientific。2 试药与试液2.1 实验材料 所需化学试剂均应为分析纯。2.2 包被液（pH9.

3、6碳酸盐缓冲液） 称取碳酸钠0.32g，碳酸氢钠编号：QC-OS-026-06 页号：2/4 江苏金丝利药业有限公司 操作规程0.586g，置200ml量瓶中加水溶解并稀释至刻度。4冷藏保存。2.3 磷酸盐缓冲液(pH7.4) 称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g（相当于Na2HPO412H2O 3.63g，Na2HPO412H2O中磷酸氢二钠所占百分比为39.7%）、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解稀释至500ml，121灭菌15分钟。2.4 洗涤液（pH7.4） 取聚山梨酯20 0.5ml，加磷酸盐缓冲液至500 ml，4冰箱保存。2.5 稀释液（pH7.4） 称取牛血清白蛋

4、白0.5g，加洗涤液溶解并稀释至100 ml，4冰箱保存。2.6 浓稀释液 称取牛血清白蛋白1.0g，加洗涤液溶解并稀释至100 ml，4冰箱保存。2.7 底物缓冲液（pH5.0枸橼酸-磷酸盐缓冲液） 称取磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）1.84g，枸橼酸0.51g，加水溶解并稀释至100ml，4冰箱保存。2.8 底物液 取邻苯二胺8mg，加30%过氧化氢30l，溶于底物缓冲液20ml中，临用时现配。2.9 终止液 1mol/L硫酸溶液，取硫酸5.5ml，缓缓注入80ml水中，冷却至室温，加水稀释至100ml，摇匀；硫酸的用量根据硫酸的实际含量计算得出，计算公式如下：硫酸用量=（摩尔浓度

5、配制体积摩尔质量）/（含量密度）。2.10 兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体（DakoCytomation，Polyclonal Rabbit Anti-Escherichia Coli，Code No./Code-Nr. B 0357，规格：9.9g/L）。于28冰箱保存，有效期按标签规定执行。每次实验前取4l，在刻度试管中用包被液稀释至4ml（稀释1000倍），制成10g/ml抗体。2.11 辣根过氧化酶（HRP）标记的兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体（E.coli Antibody，HRP comjugate，Thermo scientific，Catalog Number：PA 1-73030，规格：

6、1ml）。于28冰箱保存，有效期为6个月，-20保存，有效期更长。每次实验前取4l，在刻度试管中用稀释液稀释至4ml（稀释1000倍）。2.12 标准品溶液的制备 标准品规格为204 g/支，4保存，由中国药品生物制品检定所提供。标准品用1ml纯化水溶解，再用稀释液定容至10ml，分装至0.5 ml EP中，装量为0.15ml/管，4保存，有效期为一周；-20保存，有效期为6个月。在配制记录中明确其配制批号，其格编号：QC-OS-026-06 页号：3/4江苏金丝利药业有限公司操作规程式为：CP+年份+月份+日期。如配制批号为CP，则表明是2013年7月10日配制的菌体蛋白标准溶液，及时填写配

7、液记录。2.13 供试品溶液的制备 取供试品适量，用稀释液稀释成每1ml约含250g的溶液。如供试品每1ml中含量小于500g时，用浓稀释液稀释一倍（即稀释倍数为2）。3 操作方法3.1 包被 取4条酶标板，固定在96孔酶标板的框子上，用包被液稀释兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体至10g/ml，以100l/孔加至96孔酶标板内， 4放置过夜（1618小时）。3.2 封闭 用洗涤液洗板3次，用洗涤液制备1%牛血清白蛋白，以每孔200l加至板内，置372小时。3.3 将封闭好的酶标板用洗涤液洗涤3次。3.4 加样3.4.1 菌体蛋白标准品稀释方法 用稀释液稀释菌体蛋白标准品至下列浓度：500ng/ml、2

8、50ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.625ng/ml、7.8125ng/ml。具体方法：取已配制好的菌体蛋白标准品1管（0.15ml/管），其浓度为20.4g/ml，在刻度试管中用稀释液稀释20.4倍（0.1ml +1.94 ml），混匀得到1000ng/ml的溶液。另取2条酶标板，固定在96孔酶标板的框子上，在以上酶标板中分别加150l稀释液，在第一排孔中加入150l浓度为1000ng/ml菌体蛋白标准品的溶液，用排枪吹吸7次混匀后在以上酶标板中进行2倍系列稀释，重复7次，分别得到以上相应浓度的标准品溶液，每个稀释度做2孔。3.4.2 以100l

9、/孔加入标准品溶液和待检供试品溶液，每个稀释度做双孔，同时加入两孔空白对照（稀释液），37放置2小时。3.5 用稀释液稀释辣根过氧化酶（HRP）标记的兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体1000倍，以100l/孔加至板内，37放置1小时。3.6 用洗涤液洗板10次，以100l/孔加入临时配制的底物液，37避光放置40分钟。3.7 以50l/孔加入终止液终止反应。3.8 将酶标板放入酶标仪中，选择492nm波长测吸光度，应用计算机分析软件进行读数和数据分析，也可以使用手工作图法计算，实验完毕编号：QC-OS-026-06 页号：4/4江苏金丝利药业有限公司操作规程及时做好原始记录（见记录QC-R-2510-

10、*）。4 结果计算与判断以参考品溶液的吸光度对相应的浓度作标准曲线，并以供试品溶液吸光度在标准曲线上得到相应菌体蛋白含量，按以下公式计算待检供试品菌体蛋白残留百分含量。 cn供试品菌体蛋白残留量(%) = 100% T106 c为供试品溶液中菌体蛋白质含量，ng/ml；n为供试品稀释倍数； T为供试品蛋白质含量，mg/ml。QC-R-2510-02江苏金丝利药业有限公司大肠杆菌宿主菌蛋白质残留量检验原始记录 样品背景：样品名称批 号取样日期稀释倍数编号批 号取样日期稀释倍数编号检验日期检验记录：检验依据 酶标仪型号 兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体厂家 货号 浓度 辣根过氧化酶标记的兔抗大肠杆菌菌体蛋

11、白抗体厂家 货号 菌体蛋白标准品批号 配制批号 浓度 规格 酶标仪检测数据附后，检测结果如下： 检验结果：以参考品的吸光度对相应的浓度作标准曲线，并以供试品溶液吸光度在标准曲线上得到相应菌体蛋白含量c，代入下列公式计算待检供试品菌体蛋白残留量，结果如下： cn供试品菌体蛋白残留量(%) = 100% T106 编号宿主菌蛋白质残留量（%）结 论编号宿主菌蛋白质残留量（%）结 论检验人： 报告日期： 复核人： 复核日期： EM-R-0001-01江苏金丝利药业有限公司管理文件起草（修订）申请表文件名大肠杆菌宿主菌蛋白质残留量检验标准操作规程编号QC-OS-026-06修订原因及目的： 对配液及具体操作进行细化完善。主要起草（修订）内容：1、细化配液方法，明确兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体及辣根过氧化酶（HRP）标记的兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体厂家、浓度及稀释方法。起草（修订）人： 日 期：审核意见：同意修订“大肠杆菌宿主菌蛋白质残留量检验标准操作规程”。 审核人： 日 期：