最新微生物综合实验2PPT课件.ppt
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1、微生物综合实验微生物综合实验2 2微生物学综合实验(二)微生物学综合实验(二)第一阶段:分组第一阶段:分组-选题选题-制定实验方案制定实验方案第二阶段:菌株筛选第二阶段:菌株筛选-分离纯化分离纯化-菌落形态观察菌落形态观察第三阶段:菌株保藏第三阶段:菌株保藏-个体形态个体形态-生理生化特征生理生化特征第四阶段:分子鉴定第四阶段:分子鉴定-生物信息学分析生物信息学分析样品的采集采泥器:适用于采集海洋、河流、湖泊、水产养殖场等水底表层泥样 泥样的采集南森采水器:可以采取海洋不同深度的若干个水样,同时测定各水样所在水层的水温。水样 的采集装有海水样品的离心管在超净工作台中处理将采集的样品装于灭菌的离
2、心管中,在尽可能短的时间内进行处理(无菌条件下)。选择合适的培养基培养基的选择标准:有针对性的提供营养物质,如产纤维素酶菌的分离,鉴于菌株可以利用纤维素为碳源,因此需要加入羧甲基纤维素钠,培养后用刚果红染色。菌种的分离纯化1.分离:用无菌生理盐水对样品进行梯度稀释,在相应的培养基上利用平板涂布法对样品涂布,放置在合适温度下培养(海洋菌28)2.纯化:待平板上有明显菌落生长,挑取单个菌落进行划线分离培养,直至纯化。平板分区划线分离法(左)及培养后菌落分布示意图(右)形态观察:菌落形态观察与描述:每人提供一张带有单菌落的划线分离培养的固体平板数字化照片;鼓励另外提供能够显示菌株特点的照片。4月11
3、号之前发指导教师邮箱。形态观察:1、菌株编号:、菌株编号:QM272、培养基:海洋细菌、培养基:海洋细菌2216E3、培养时间:、培养时间:48h4、菌落形态描述:菌落圆形、菌落形态描述:菌落圆形、光滑、湿润、边缘整齐、奶光滑、湿润、边缘整齐、奶油色、直径油色、直径3-5mm、形态观察:显示菌株特点的照片(需附说明):细菌QM38在海洋细菌2216E平板上生长96h,由于分泌胞外琼胶酶,琼脂降解,导致平板液化。形态观察:显示菌株特点的照片(需附说明):利用卢戈氏碘液对琼胶降解细菌进行筛选,能够产生胞外琼胶酶的菌株,其菌落周围有着色浅的透明区域。第三阶段:菌株保藏第三阶段:菌株保藏-个体形态个体
4、形态-生理生化特征生理生化特征 菌株保藏:初定于4月13号-17号菌株保藏 1、海洋细菌的菌种是重要的海洋微生物资源;2、学习菌株保藏的相关理论知识;3、利用-80超低温冰箱冷冻保藏菌株。4、具体保藏步骤介绍。甘油冷冻保藏法甘油冷冻保藏法原理:加入保护剂:丙三醇,-70-80保存。步骤:保种液配方:1%Nacl,15%丙三醇,85%水 灭菌 将纯化后的菌种在普通斜面上进行划线 加入保种液,将菌洗脱 加入灭过菌的菌种保存管中超低温冰箱保存画蛇形线 菌种保存管第三阶段:菌株保藏第三阶段:菌株保藏-个体形态个体形态-生理生化特征生理生化特征 个体形态观察:4月11号-1、个体形态与大小;2、革兰氏染
5、色;3、芽胞染色、鞭毛染色。第三阶段:菌株保藏第三阶段:菌株保藏-个体形态个体形态-生理生化特征生理生化特征 生理生化特征:1、生长温度试验;生长盐度实验;2、TCBS培养基生长实验;3、氧化酶、过氧化氢酶实验;4、API 试剂条进行快速生理生化特征测定温度实验n用接种环挑取新鲜细菌培养物于4ml无菌水中稀释,取20ul滴于2216E平板上,分别放在5 、15 、28 、37 、42恒温培养箱中培养,观察菌落生长情况。n培养时间依温度而异,5、15 培养一周;37 、42培养两天。盐度实验n用不同浓度的NaCl溶液代替陈海水,配制不同NaCl浓度的培养基。挑取培养了48h的新鲜菌落于4ml无菌
6、水中稀释后,取20ul滴于0,1,3,5,7,9%NaCl浓度的培养基上,28培养72h,观察菌落生长状况。n培养基由指导教师统一提供TCBS生长试验 TCBS培养基是一种弧菌的鉴别性培养基,菌落一般呈绿色、黄绿色和黄色等颜色,原因是有些菌可以利用培养基中的蔗糖产酸,使培养基的pH值降低,指示剂变黄色,而不能利用蔗糖的弧菌菌落仍呈现绿色。有时随着培养时间的延长,黄色菌落颜色也会发生变化,变成浅绿色或绿色,这主要也是由于培养基pH的变化造成的。培养基由指导教师统一提供,或指定一个小组准备。鉴于部分生理生化实验培养基的配置要求较高,且不易观察实验结果。因此部分实验采用API试剂条进行。API鉴定系
7、统鉴定系统 API是 Analytic Products INC的简称。API鉴定系统是由法国生物一梅里埃公司生产的细菌数值分类分析鉴定系统。该系统品种齐全,包括的范围广,鉴定的能力强,数据库在不断地完善和补充,目前约有 1000种生化反应,可鉴定的细菌大于 550种。是世界范围内应用最广、种类最多、最受微生物学家推崇的国际标准化产品。API组成nAPI鉴定系统的主要部分是 API试剂条及检索工具此外有些反应还需使用添加试剂。n发酵试验:为碳水化合物与酸的分解代谢试验,结果 是通过 PH的变化引起酸碱指示剂颜色的改变来判断。如葡萄糖、乳糖、甘露糖、蔗糖、甘露醇、肌醇、山梨醇等。n同化试验:根据
8、待测菌能否利用反应杯中的单一碳水 化合物作为碳源而得以生长来判断。如葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇、N一乙酰葡糖铵、葵酸、乙二酸、苹果酸等。n酶试验:根据待测菌含有相应的酶就可分解底物,再 通过显色反应来判断。如碱性磷酸酶、氧化酶、一半乳糖苷酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、色氨酸脱羧酶、吲哚产生等。n其它生化反应:如硝酸盐还原酶、七叶苷、明胶、硝酸盐还原等。API种类根据用途不同,API分为14种:API 20 E、API 20 NE、API 20 STREP、API CAMPY、API STAPH、API NH、API 20 C AUX 、API Candida、API 20 A、API
9、CORYNE、API 10 S、RAPID 20 E、API LISTERIA、API ZYM、API 50 CH API 50 CHB、API 50 CHL、API 50 CHEAPI种类鉴定细菌鉴定细菌 API 20E 肠杆菌和其他非苛养革兰氏阴性杆菌 RapiD 20E 肠杆菌 API 10 S 肠杆菌和其他非苛养革兰氏阴性杆菌 API 20 NE 非肠道和非苛养革兰氏阴性杆菌 API Staph 葡萄球菌,考克氏菌和微球菌属 API 20 Strep 链球菌 API Coryne 棒状杆菌 API Listeria 李斯特氏菌 API种类鉴定细菌鉴定细菌 API Candida 酵母菌
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