大肠杆菌基因工程——人胰岛素202-2教学内容.ppt

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1、大肠杆菌基因工程人胰岛素202-2目目 录录1.利用重组大肠杆菌生产医用蛋白或多肽2.胰岛素的生产方法3.产人胰岛素大肠杆菌工程菌的构建策略1 1 A链和B链的编码区由化学合成，两个双链DNA片段分别克隆在含有Ptac启动子和-半乳糖苷酶基因的表达型质粒上，后者与胰岛素编码序列形成杂合基因，其连接位点处为甲硫氨酸密码子。重组分子分别转化大肠杆菌受体细胞，两种克隆菌分别合成-半乳糖苷酶-人胰岛素A链以及-半乳糖苷酶-人胰岛素B链两种融合蛋白。经大规模发酵后，从菌体中分离纯化融合蛋白，再用溴化氢在甲硫氨酸残基的C端化学切断融合蛋白，释放出人胰岛素的A链和B链。胰岛素AB链分别表达法的基本原理AB链

2、 分 别 表 达 法2 2人胰岛素原表达法虽然上述工艺路线并不比AB链分别表达更为简捷，而且需要额外使用两种高纯度的酶制剂，但由于其体外折叠成功率相当高，在一定程度上弥补了工艺繁琐的缺陷，使得产品的生产成本仅为50美元/g。将人胰岛素原cDNA编码序列克隆在-半乳糖苷酶基因下游，两个DNA片段的连接处仍为甲硫氨酸密码子。该杂合基因在大肠杆菌中高效表达后，分离纯化融合蛋白，并同样采取溴化氢化学裂解法回收人胰岛素原片段，然后将之进行体外折叠。由于C肽的存在，胰岛素原在复性条件下能形成天然的空间构象，为3对二硫键的正确配对提供了良好的条件，使得体外折叠率高达80%以上。为了获得具有生物活性的胰岛素，

3、经折叠后的人胰岛素原分子必须用胰蛋白酶特异性切除C肽，可获得完整的A链以及C端带有精氨酸Arg的B链。AB链同时表达法链同时表达法 这种方法的基本思路是将人胰岛素的A链和B链编码序列拼接在一起，然后组装在大肠杆菌-半乳糖苷酶基因的下游。重组子表达出的融合蛋白经溴化氢CNBr处理后，分离传话A-B链多肽，然后再根据两条链连接处的氨基酸性质，采用相应的裂解方法获得A链和B链肽段，最终通过体外折叠制备具有活性的重组人胰岛素。与第一种方法相似，其最大的缺陷仍是体外折叠的正确率较低，因此目前尚未进入应用阶段。3 3 上述三种工程菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原编码序列与大肠杆菌-半乳糖苷酶基因拼接的方法，所生产的融合型重组蛋白表达率高，且稳定性强，但不能分泌，主要以包含体的形式存在与细胞内。一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略是将胰岛素或胰岛素原编码序列插入到表达型质粒-内酰胺酶基因的下游，后者所编码是降解青霉素的酶蛋白，通常能被大肠杆菌分泌到细胞外。由此构建得到的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融合蛋白的优良特性，为胰岛素的后续分离纯化工序减轻了负担。小 结14.52 533感谢聆听感谢聆听还有202-2的小伙伴们