厌氧氨氧化ppt培训资料.ppt

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1、厌氧氨氧化厌氧氨氧化pptppt主要内容主要内容1 Anammox 检测手段检测手段2 Anammox 反应机理反应机理3 Anammox 影响因素影响因素4Anammox 研究进展研究进展1Anammox 研究进展研究进展 Anammox 应用现状应用现状5水体富营养化水体富营养化水体富营养化水体富营养化2011中国环境状况公报 在监测的在监测的26个湖泊（水库）中，富营养化状态的湖泊（水个湖泊（水库）中，富营养化状态的湖泊（水库）占库）占53.8%，其中，轻度富营养状态和中度富营养状态，其中，轻度富营养状态和中度富营养状态的湖泊（水库）比例分别为的湖泊（水库）比例分别为46.1%和和7.7

2、%。水体富营养化水体富营养化水体富营养化水体富营养化水体氮素污染水体氮素污染传统生物脱氮工艺传统生物脱氮工艺满足满足厌氧氨氧化工艺厌氧氨氧化工艺低碳氮比、高氨氮低碳氮比、高氨氮有机废水。有机废水。Anammox 定义定义Anammox：在在缺氧缺氧条件下通过微生物的作用，以条件下通过微生物的作用，以亚硝酸氮为电子受体亚硝酸氮为电子受体，氨氮为电子供体，将亚硝酸，氨氮为电子供体，将亚硝酸氮和氨氮同时转化为氮和氨氮同时转化为N2的过程。的过程。Anammox 发展简史发展简史1977年，年，Broda根据自由能的变化，预言自然界中存在着根据自由能的变化，预言自然界中存在着能催化能催化亚硝酸和硝酸氧

3、化氨亚硝酸和硝酸氧化氨的细菌，认为它们是隐藏于自的细菌，认为它们是隐藏于自然界的自养型细菌。然界的自养型细菌。1995年，年，Mulder和和van de Graaf等用流化床反应器研究等用流化床反应器研究生物反硝化时，发现了生物反硝化时，发现了氨氮的厌氧生物氧化现象氨氮的厌氧生物氧化现象，从而证，从而证实了实了Broda的预言。的预言。2002年，世界年，世界第一座第一座Anammox工业化生产反应器工业化生产反应器在荷兰在荷兰鹿特丹污水处理厂投入运行。鹿特丹污水处理厂投入运行。Baltimore 内港、日本海内港、日本海Chesapeake 海湾海湾波罗地海的芬兰湾波罗地海的芬兰湾安哥拉的

4、安哥拉的Benguela上升流上升流英国的泰晤士河口英国的泰晤士河口丹麦丹麦Mellerup 河口河口南海等南海等2002200320042004-2013海洋中海洋中海洋中海洋中1 厌氧盆地厌氧盆地黑海黑海2 哥斯达黎加哥斯达黎加Golfo Dulce 海湾海湾北极圈北极圈极地海冰极地海冰波罗的海波罗的海过渡区过渡区大陆架沉积物大陆架沉积物Anammox 分布分布Anammox 分布分布除了海洋、河口、海湾外，在除了海洋、河口、海湾外，在陆地生态系统陆地生态系统中也存在中也存在Anammox，湿地、农田土壤、冻土层、蓄水层等土壤，湿地、农田土壤、冻土层、蓄水层等土壤干湿界面也有探测到干湿界面

5、也有探测到Anammox菌。菌。Anammox 生物脱氮研究生物脱氮研究荷兰荷兰Delft大学生物技术系：大学生物技术系：Anammox 研究的发源地；目前研究的发源地；目前主要研究主要研究Anammox脱氮工艺及其应用。脱氮工艺及其应用。荷兰的荷兰的Paques 公司首家将公司首家将Anammox 工艺工程化应用的公司。工艺工程化应用的公司。世界世界10座座Anammox 废水处理工程：废水处理工程：荷兰的荷兰的Rotterdam，Lichtenvoorde，Olburgen；德国的；德国的Hattingen，Mechernich；日本的；日本的Mie Prefecture；澳大利来的；澳大

6、利来的 Strass；瑞士的；瑞士的Glanerland 和和Kollikon 以及英国的以及英国的Pitsea。Anammox 生物脱氮研究生物脱氮研究澳大利亚昆士兰大学的澳大利亚昆士兰大学的JS Fuerst团队团队：研究细胞生物学，与奈梅亨大学研究细胞生物学，与奈梅亨大学团队一起探明了厌氨氧化体的结构及其生理特性。团队一起探明了厌氨氧化体的结构及其生理特性。法国的国家基因测序公司法国的国家基因测序公司Genoscope与与Nijmegen团队、团队、Vienna团队以及团队以及Munich团队团队：2005年完成了厌氧氨氧化菌年完成了厌氧氨氧化菌Kuenenia Stuttgartien

7、sis全基全基因组的测序。因组的测序。荷兰海洋研究中心的荷兰海洋研究中心的Jaap Damste研究团队研究团队：海洋生态系统有关厌氧氨氧海洋生态系统有关厌氧氨氧化的研究，并探明了厌氧氨氧化菌特征性的阶梯烷细胞化学组分化的研究，并探明了厌氧氨氧化菌特征性的阶梯烷细胞化学组分。MPE Bremen研究团队研究团队：首次证实海洋中存在厌氧氨氧化活性：首次证实海洋中存在厌氧氨氧化活性。Anammox 生物脱氮研究生物脱氮研究浙大郑平教授团队：浙大郑平教授团队：研究研究Anammox 菌种、工艺和设备。菌种、工艺和设备。2008年，年，成功将成功将Anammox 应用于味精废水处理，建立了国内第一个应

8、用于味精废水处理，建立了国内第一个Anammox 处理实际废水工程处理实际废水工程；中国科大俞汉青教授团队：中国科大俞汉青教授团队：研究研究Anammox 污泥颗粒化，成功培育污泥颗粒化，成功培育Anammox 颗粒污泥。颗粒污泥。大连理工杨凤林教授团队：分子生物学手段检测大连理工杨凤林教授团队：分子生物学手段检测Anammox 的菌群组成。的菌群组成。北京建筑工程学院郝晓地教授团队：侧重工艺及实际应用研究。北京建筑工程学院郝晓地教授团队：侧重工艺及实际应用研究。华南理工大学周少奇教授、胡勇为教授团队：华南理工大学周少奇教授、胡勇为教授团队：Anammox 处理垃圾渗滤液。处理垃圾渗滤液。广州

9、微生物所沈萍教授团队：广州微生物所沈萍教授团队：Anammox 处理垃圾渗滤液。处理垃圾渗滤液。分子生物学：分子生物学：在生物化学与遗传学、微生物学、细胞学、在生物化学与遗传学、微生物学、细胞学、生物物理学等学科相结合的基础上发展起来的崭新学科。生物物理学等学科相结合的基础上发展起来的崭新学科。研究对象：研究对象：生物大分子生物大分子核酸（核酸（DNA 和和RNA）。分子生物学技术分子生物学技术荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术 FISH多聚酶链式反应多聚酶链式反应 PCR变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳DGGEDNA克隆克隆DNA测序及序列分析测序及序列分析分子生物学技术分子生物学技术 荧光原

10、位杂交技术：荧光原位杂交技术：fluorescent in situ hybridazation，FISH20世纪世纪70年代后期年代后期根据已知微生物不同分类级别上种群根据已知微生物不同分类级别上种群特异的特异的DNA序列序列，以利，以利用荧光标记的特异寡核苷酸片段作为用荧光标记的特异寡核苷酸片段作为探针探针，与环境基因组中，与环境基因组中DNA分子分子杂交杂交，检测该特异微生物种群的，检测该特异微生物种群的存在与丰度存在与丰度。特点：特点：1.可进行样品的原位杂交，避免细菌的纯培养过程可进行样品的原位杂交，避免细菌的纯培养过程2.可有效反应环境样品中细菌数量及空间位置，并具有定性、定量分析

11、可有效反应环境样品中细菌数量及空间位置，并具有定性、定量分析和空间位置识别特点和空间位置识别特点环境中特定微生物种群的鉴定、种群数量分析及其特异微生环境中特定微生物种群的鉴定、种群数量分析及其特异微生物跟踪检测，采用该技术已发现了许多物跟踪检测，采用该技术已发现了许多新的微生物物种新的微生物物种。荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术 FISH多聚酶链式反应多聚酶链式反应：polymerase chain reaction，PCR美国美国Cetus公司公司Mullis等等1985年年一套大量快速扩增特异一套大量快速扩增特异DNA片段的系统，属片段的系统，属DNA体外合成技术体外合成技术类似于生物体内

12、类似于生物体内DNA的复制过程，重复经过若干个的复制过程，重复经过若干个变性、退火、变性、退火、延伸延伸这这3 步循环，就可以使目的步循环，就可以使目的DNA 扩增放大扩增放大。通过通过PCR，可以在，可以在几小时内几小时内将一个分子的遗传物质成百乃至上亿将一个分子的遗传物质成百乃至上亿倍的复制。该技术具有特异性强、灵敏度高、快速、简便以及重倍的复制。该技术具有特异性强、灵敏度高、快速、简便以及重复性好等特点和优点。复性好等特点和优点。经典经典PCR荧光定量荧光定量PCR(Real-time PCR)多聚酶链式反应多聚酶链式反应 PCR环境样品环境样品DNA含量过低含量过低变性梯度凝胶电泳变性

13、梯度凝胶电泳 denaturing gradient gelelectrophoresis，DGGE：Myers等创建，属于等创建，属于DNA指纹图谱技术指纹图谱技术。PCR扩增产物扩增产物在具有变性浓度梯度的聚丙烯酰胺凝胶中具有在具有变性浓度梯度的聚丙烯酰胺凝胶中具有不同的迁移位点，不同的不同的迁移位点，不同的GC含量在胶中产生含量在胶中产生不同分离的条不同分离的条带带，每一条条带代表一个不同的微生物种群，通常用条带数，每一条条带代表一个不同的微生物种群，通常用条带数目的多少来反映微生物种群的多样性，用条带的染色强度反目的多少来反映微生物种群的多样性，用条带的染色强度反映不同细菌种群的丰度。

14、映不同细菌种群的丰度。DGGE在微生物分子生态学方面的应用在微生物分子生态学方面的应用：对复杂微生态系统的解析成为可能对复杂微生态系统的解析成为可能对微生物群落动态变化的研究成为可能对微生物群落动态变化的研究成为可能变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳 DGGE环境样品微生物分析环境样品微生物分析存在的存在的问题问题：得不到足够的目标物质进行分析得不到足够的目标物质进行分析微生物体内的蛋白质，能被纯化的部分几乎不到一半，微生物体内的蛋白质，能被纯化的部分几乎不到一半，真核细菌的蛋白质则更难得到真核细菌的蛋白质则更难得到分子克隆：分子克隆：将将目标目标DNA片断片断插入一段自复制的插入一段自复制的D

15、NA 分子分子（克隆载体）中，而后目标（克隆载体）中，而后目标DNA片断就和载体复制在一起，片断就和载体复制在一起，将这个携带着目标将这个携带着目标DNA片断的载体在片断的载体在宿主细胞宿主细胞（如酵母菌）（如酵母菌）中克隆后就可产生大量的被插入的目标中克隆后就可产生大量的被插入的目标DNA片断。片断。DNA 克隆克隆DNA测序测序：采用高温使采用高温使DNA双链变性，引物被退火后得到双链变性，引物被退火后得到延伸。延伸。Taq DNA 多聚酶多聚酶也是也是DNA 测序反应中常用的酶，它能使染料标记测序反应中常用的酶，它能使染料标记的的DNA终端分布更加均匀，具有较高的测序准确度。终端分布更加

16、均匀，具有较高的测序准确度。DNA 序列分析：序列分析：测序后一个重要步骤。测序后一个重要步骤。不同微生物有不同不同微生物有不同DNA序列，因此经过准确和合理的序列序列，因此经过准确和合理的序列分析即能鉴定目标微生物。分析即能鉴定目标微生物。1.通过通过网络数据资源网络数据资源得到有关的序列信息得到有关的序列信息2.应用软件在应用软件在数据库数据库中查询中查询3.通过通过系统发育分析系统发育分析确定微生物在发育过程中种属关系。确定微生物在发育过程中种属关系。DNA 测序及序列分析测序及序列分析细菌总细菌总DNA提取、特异性提取、特异性PCR扩增扩增16S rDNA、16S rDNA克隆、克隆、

17、16S rDNA基因测序和基因测序和16S rDNA基因序列分析。基因序列分析。Anammox 菌的分子生物学鉴定菌的分子生物学鉴定迄今为止共发现了迄今为止共发现了9 个种个种的厌氧氨氧化菌，分别归在的厌氧氨氧化菌，分别归在5 个属个属中，中，并建立了厌氧氨氧化菌科（并建立了厌氧氨氧化菌科（Anammoxaceae）“Candidatus Brocadia anammoxidans”“Candidatus Brocadia fulgida”“Candidatus Kuenenia stuttgartiensis”“Candidatus Scalindua brodae”“Candidatus

18、Scalinduawagneri”“Candidatus Anammoxoglobus propionicus”“Candidatus Jettenia asiatica”“Candidatus Anammoxoglobus sulfate”“Candidatus Scalindua sorokinii”Anammox 菌的分子生物学鉴定菌的分子生物学鉴定Strous等最先发现等最先发现Candidatus Brocadia anammoxidans并确定并确定其其16S rDNA 序列及在细菌进化树上的位置，序列及在细菌进化树上的位置，B.anammoxidans的的16S rDNA基因序列

19、常被用来设计为特定基因序列常被用来设计为特定的寡核苷酸探针，以用于荧光原位杂交的寡核苷酸探针，以用于荧光原位杂交(FISH)。Schmid等在德国几个污水处理厂中发现等在德国几个污水处理厂中发现Candidatus Kuenenia stuttgartiensis，它们的，它们的16S rDNA 序列形成了一个明显独立序列形成了一个明显独立的种群，其中有的种群，其中有85%的细菌与已发现的的细菌与已发现的B.anammoxidans的的16S rDNA序列相似性少于序列相似性少于90%，因而认为是一种新的厌氧氨，因而认为是一种新的厌氧氨氧化菌氧化菌。Anammox 菌的分子生物学鉴定菌的分子生

20、物学鉴定革兰阴性菌革兰阴性菌专性厌氧菌专性厌氧菌红菌红菌470nm有较强的有较强的吸收峰吸收峰多样，呈球形、多样，呈球形、卵形等卵形等直径直径0.8-1.1m无荚膜无荚膜壁表面有火山口壁表面有火山口状结构状结构有少量菌毛有少量菌毛细胞壁细胞壁细胞膜细胞膜细胞内细胞内 厌氧氨氧化体厌氧氨氧化体 核糖细胞质核糖细胞质 外室细胞质外室细胞质生理生理特征特征个体个体形态形态细胞细胞结构结构Anammox 反应机理反应机理Anammox菌生理生化特征菌生理生化特征Anammox 菌菌图图2 颗粒污泥外观扫描电镜照片颗粒污泥外观扫描电镜照片图图1 Anammox颗粒污泥颗粒污泥图图3反反应应器器内内富富集

21、集培培养养物物Anammox 菌菌图图4 颗粒污泥内部颗粒污泥内部 Anammox 菌菌图图5 颗粒污泥超薄切片，透射电镜照片颗粒污泥超薄切片，透射电镜照片羟胺和联氨氧化还原羟胺和联氨氧化还原酶（酶（HAO）厌氧氨氧化分解代谢厌氧氨氧化分解代谢的场所。的场所。1、特有结构特有结构2、占细胞体积、占细胞体积30%以上以上3、可完整分离、可完整分离4、单层不可渗透的、单层不可渗透的膜包围膜包围5、几乎无、几乎无RNA/DNA厌氧氨氧化体厌氧氨氧化体Anammox 反应机理反应机理Anammox 反应机理反应机理1997年，年，Van de Graaf 等通过等通过15N 标记标记实验发现：实验发现

22、：羟胺（羟胺（NH2OH）最可能是氨氧化的电子受体，并推测出其代谢途径。最可能是氨氧化的电子受体，并推测出其代谢途径。n厌氧氨氧化菌首先厌氧氨氧化菌首先NO2-转化成转化成NH2OH，再以，再以NH2OH 为电子受体将为电子受体将NH4+氧化形联氨（氧化形联氨（N2H4）；N2H4 转化成转化成N2，并为，并为NO2-还原成还原成NH2OH 提供提供电子。电子。n试验中有少量试验中有少量NO2-被氧化成被氧化成NO3-,推测可能是为厌氧氨氧化菌固定推测可能是为厌氧氨氧化菌固定CO2 提供电子。提供电子。n生物转化过程中存在以下平衡关系生物转化过程中存在以下平衡关系:NH4+:NO2-:NO3-

23、=1:1.32:0.26。Fig.6 Possible metabolic pathway for AnammoxAnammox 反应机理反应机理Anammox 影响因素影响因素影响影响因素因素pH泥龄泥龄氧氧基质浓度基质浓度磷酸盐磷酸盐有机物有机物 温度温度光光温度温度：适宜温度为适宜温度为30-40。pH：影响影响细菌细菌（电解质平衡和酶活性电解质平衡和酶活性）和基质和基质（FA和和游离亚硝酸游离亚硝酸）。氧：有抑制作用，微氧条件氧：有抑制作用，微氧条件(0.5%空气饱和度空气饱和度)可可完完全抑制全抑制，但该抑制作用是可逆的但该抑制作用是可逆的；大于大于18%空气饱空气饱和度和度，菌群不

24、可恢复。，菌群不可恢复。最适pH为6.7-8.3Anammox 影响因素影响因素基质浓度：氨浓度和硝酸盐浓度低于基质浓度：氨浓度和硝酸盐浓度低于1000 mg/L不不产生抑制产生抑制；亚硝酸盐浓度超过亚硝酸盐浓度超过100 mg/L产生明显抑产生明显抑制。制。泥龄：厌氧氨氧化菌生长缓慢，泥龄：厌氧氨氧化菌生长缓慢，故故泥龄越长越好泥龄越长越好。有机物：有机物：异养菌增殖较快异养菌增殖较快，从而抑制厌氧氨氧化活，从而抑制厌氧氨氧化活性。性。Anammox 影响因素影响因素磷酸盐：高浓度的磷酸盐有抑制作用。磷酸盐：高浓度的磷酸盐有抑制作用。对对Brocadia anammoxidans，加入，加入

25、1mM的磷酸盐对的磷酸盐对其活性无影响，但加入其活性无影响，但加入5mM完全抑制；完全抑制；而而Kuenenia stuttgartiensis耐受力为耐受力为20mM。光：厌氧氨氧化菌属光敏性微生物，光能抑制其活光：厌氧氨氧化菌属光敏性微生物，光能抑制其活性，降低性，降低30%-50%的氨去除率。的氨去除率。Anammox 影响因素影响因素Anammox 特点特点同比例除氮同比例除氮1234无机碳源无机碳源CO2自养菌自养菌红色红色生长慢生长慢厌氧厌氧对氧敏感对氧敏感优优 点点已知的最简捷、最经济的生物脱氮途径已知的最简捷、最经济的生物脱氮途径与传统硝化与传统硝化/反硝化相比反硝化相比无需无

26、需外加碳源外加碳源污泥污泥产量少产量少无需供氧无需供氧无需无需外加碱度外加碱度 倍增时间长，生长缓慢倍增时间长，生长缓慢 抗冲击负荷能力弱抗冲击负荷能力弱 对环境条件要求苛刻，对环境条件要求苛刻，DO、温度、温度、pH、有机物等、有机物等会对会对Anammox过程产生影响过程产生影响缺缺 点点不同脱氮工艺比较不同脱氮工艺比较参数参数AnammoxCANONSharon传统脱氮工艺传统脱氮工艺反应器个数反应器个数112/进水水质要求进水水质要求含氨氮及亚含氨氮及亚硝酸盐硝酸盐常规常规常规常规常规常规产物产物N2,NO3-N2,NO3-N2,NH4+N2,NO3-,NO2-运行状态运行状态兼氧兼氧

27、微量曝气微量曝气好氧好氧好氧，兼氧好氧，兼氧需氧量需氧量无无低低低低高高pH控制控制无无无无无无需要需要生物截留量生物截留量有有有有无无无无有机碳源需求有机碳源需求无无无无无无需要需要污泥产量污泥产量低低低低低低高高1 1两相两相Sharon-Anammox工艺工艺2 2单相单相CANON工艺工艺Anammox 应用现状应用现状两相两相Sharon-Anammox工艺工艺Sharon：single reactor for high activity ammonia removal over nitriteSharon-Anammox工艺是一种将短程硝化和厌氧工艺是一种将短程硝化和厌氧氨氧化联合

28、的脱氮工艺。氨氧化联合的脱氮工艺。荷兰荷兰Delft大学大学2001年开发的。年开发的。两相两相Sharon-Anammox工艺工艺 在两个反应器内，先在一个反应器内有氧条件下，在两个反应器内，先在一个反应器内有氧条件下，利用氨氧化细菌将利用氨氧化细菌将NH4+氧化生成氧化生成NO2-；然后在另；然后在另一个反应器缺氧条件下，以一个反应器缺氧条件下，以NH4+为电子供体，将为电子供体，将NO2-反硝化。反硝化。1 基本原理基本原理NH4+HCO3-+0.75O2 0.5NH4+0.5NO2-+CO2+1.5H2ONH4+1.32NO2-+0.066HCO3+0.13H+1.02N2+0.26N

29、O3-+0.066CH2O0.sN0.1s+2.03H2O两相两相Sharon-Anammox工艺工艺n分别在两个反应器内实现部分硝化和厌氧氨氧化，能优化分别在两个反应器内实现部分硝化和厌氧氨氧化，能优化两类细菌的生存环境，运行性能稳定。两类细菌的生存环境，运行性能稳定。n与传统硝化与传统硝化反硝化过程相比：反硝化过程相比：运行费用减少运行费用减少90%CO2排放量减少排放量减少88%，不产生，不产生N2O有害气体有害气体 无需有机物无需有机物 不产生剩余污泥不产生剩余污泥 节省占地面积节省占地面积2 优点优点 荷兰鹿特丹污水处理厂荷兰鹿特丹污水处理厂2002年年世界上第一个生产性世界上第一个

30、生产性Sharon-Anammox工艺在工艺在荷兰鹿特丹污荷兰鹿特丹污水处理厂水处理厂正式运行，用于处理正式运行，用于处理处理污泥消化液。处理污泥消化液。设计处理流量为设计处理流量为550m3/dSHARON 反应器有效容积反应器有效容积1650 m3（=19.5m，H=5.75m）Anammox反应器容积反应器容积70 m3（=2.2m，H=18m）CANON：completely autotrophic nitrogen removal over nitrite 基于亚硝酸盐的完全自养脱氮基于亚硝酸盐的完全自养脱氮CANON工艺是一种在同一个反应器内实现亚硝化工艺是一种在同一个反应器内实现

31、亚硝化和厌氧氨氧化的脱氮工艺。和厌氧氨氧化的脱氮工艺。荷兰荷兰Delft大学提出的。大学提出的。单相单相CANON工艺工艺n亚硝化菌在有氧条件下把亚硝化菌在有氧条件下把NH4+化成化成NO2-，厌氧氨氧化菌则，厌氧氨氧化菌则在无氧条件下把在无氧条件下把NH4+和和NO2-转化为转化为N2，即利用亚硝化菌，即利用亚硝化菌和厌氧氨氧化菌的协同作用，在同一个反应器中完成亚硝和厌氧氨氧化菌的协同作用，在同一个反应器中完成亚硝化和厌氧氨氧化。化和厌氧氨氧化。1 基本原理基本原理单相单相CANON工艺工艺NH4+1.5 O2 NO2-+H2O+2H+NH4+1.3NO2-1.02N2+0.26NO3-+2

32、H2ONH4+0.85O2 0.43N2+0.13NO3-+1.3H2O+1.4H+单相单相CANON工艺工艺1自养型微生物自养型微生物不需要碳源不需要碳源2硝化硝化50%的氨氮的氨氮控制在亚硝化阶段控制在亚硝化阶段节约碱度节约碱度50%3限氧条件下进行限氧条件下进行节约供氧量节约供氧量理论上节约供氧理论上节约供氧62.5%2 优点优点厌氧氨氧化菌倍增时间长厌氧氨氧化菌倍增时间长所需环境温度为中高温所需环境温度为中高温Anammox菌特征信息工程化应用困难工程化应用困难接种污泥的优化环境因子的控制合理优化合理优化工艺参数工艺参数展展 望望展展 望望实现实现高效脱氮高效脱氮基质抑制基质抑制动力学动力学如何解除如何解除基质抑制基质抑制结束！结束！