广州大学微生物学期末实验报告《土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选》.doc

《广州大学微生物学期末实验报告《土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选》.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《广州大学微生物学期末实验报告《土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选》.doc（26页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、优质文本广州大学综合性实验报告实验课题：土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定学院 生命科学学院 年级：14级专业班级：生物技术142班姓名 陈子禧 学号1414300004 实验地点：广州大学生化楼指导教师 熊文婷老师、陈琼华老师 一实验目的及任务1了解微生物别离纯化的原理及微生物别离纯化常用方法和技术。2掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理及方法。【包括物理上的温度筛选和生化上的培养基筛选】3掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理及方法。【检测淀粉酶活性】4从不同环境土壤样品中筛选出能产淀粉酶的芽孢杆菌【包括取样、筛选及培养方法】5对所学习过的微生物实验方法进行综合技能训练【

2、包括糖发酵试验、IMViC试验、淀粉水解试验等，且学习新的鉴定方法如柠檬酸盐利用试验、酪素、酪氨酸的水解试验等】6培养自行设计实验流程、综合分析解决问题及判断实验结果的能力。7作为一个四人团队，且作为组长，掌握进度把握和根据个人长处和时间进行调配分工，培养团队合作能力，集思广益，将4个人的思路进行整合从而应用到实验中。( 8 )实事求是，对失误和实验数据进行准确真实记载，对自己的错误进行分析。二摘要：本次实验的目的是为了从土壤样品中筛选出2株产淀粉酶芽胞杆菌随后进行纯化培养和菌种保藏，并进行17项生化鉴定实验得到参数后与伯杰氏细菌鉴定手册比照后确认菌种的种名。我们组在个不同环境中河边和树下分别

3、采取2个土壤样品制取土壤悬液并进行挑取菌种并培养，最终筛选出2个菌种后经过4次划线纯化后各取一个菌种进行细菌鉴定试验，并进行了17项细菌生化鉴定试验后包括接触酶试验、糖发酵试验、V.P试验、MR试验、吲哚试验、耐盐试验、柠檬酸盐利用试验、明胶试验、硝酸盐复原试验、酪素水解试验、酪氨酸水解试验、运动性试验、温度试验、PH试验、卵黄反响试验、淀粉水解试验、0.001%溶菌酶试验经过对伯杰氏细菌鉴定手册比对后，初步鉴定出树下土壤所取菌种为凝结芽孢杆菌及河边土壤所取菌种为蜡状芽孢杆菌，其中河边的蜡状芽孢杆菌可以产淀粉酶但树下的芽孢杆菌并不能分解淀粉，这是我们组因为实验顺序编排不当造成的大失误，但最后仍

4、得到1株产淀粉酶能力较强的蜡状芽孢杆菌。进而对该2株菌种进行斜面保存并上交，对实验过程的各种现象进行记录并分析，并以该实验报告作为载体对我们本次的试验作总结及进行成果汇报。关键词：芽孢杆菌、细菌鉴定生化试验、装片、培养基、伯杰氏手册三前言芽孢杆菌在土壤中分布广泛，是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌。这类细菌多数为腐生菌,主要分布于土壤、植物体外表及水体中,由于它们能够产生对热、紫外线、电磁辐射和某些化学药品有很强抗性的芽孢,因此能忍受多种不良环境并在环境适宜时芽孢萌发。【本次实验由于条件限制，故所筛选的芽孢杆菌均为好氧菌，兼性厌氧型可能因环境不适已遭淘汰】土壤中蕴含着丰富的微生

5、物资源,芽孢杆菌是其中具有重要应用价值的微生物类群。有些菌种可以分泌多种酶,可应用于工业生产;有些菌种产生对昆虫毒性较强的蛋白,可生产微生物农药;有些菌种可作为多种分泌蛋白基因表达受体,在基因工程领域中有较高应用价值。淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称,是用于酿酒、食品、医药、纺织、饲料等具有商业价值的重要酶类。所以别离出产淀粉酶的芽孢杆菌有重要意义。四、实验原理我们的取样点位于广州大学，处于广州大学城四面环江，地处南亚热带,其气候属南亚热带典型的季风海洋气候。可初步判断芽孢杆菌资源丰富。本方案用五点取样法釆集土壤样品,采用纯培养的方法,别离获得芽孢杆菌。对菌株进行形态学观察及生理生化分析,以挑

6、选出可产淀粉酶的菌株并进行镜检制片并进行细菌生化鉴定试验，与伯杰氏细菌鉴定手册进行比对，从而鉴定出产淀粉酶芽胞杆菌的种。五实验材料试剂与配方：试剂：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、葡萄糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO47H2O、FeSO47H2O、95%乙醇、0.5%番红色液、蒸馏水等配方：1牛肉膏蛋白胨培养基：营养琼脂3.3%、蒸馏水100mL、pH7.2-7.4。2营养肉汤:牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、NaCl 0.5%、蒸馏水100ml、pH5.7、7.2对照。3半固体培养基(运动性试验：琼脂0.5%、牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、NaCl 0.5%、蒸馏水1

7、00ml、pH7.2-7.4。4淀粉水解培养基:营养琼脂3.3%、可溶性淀粉2%、蒸馏水100ml、PH7.2-7.45卵黄反响培养基：无菌条件下去卵黄加等量的生理盐水，摇匀后，取5ml参加到融化的约 50-55的100ml的营养琼脂中内含1g葡萄糖)，混匀后倒入培养皿内。制成的卵黄平板过夜后即可使用。6硝酸盐复原实验培养基:胰蛋白胨1.0%,酵母浸粉0.5%,NaCl 1.0%, KN03 0.1%,蒸馏水 1OOmL,调节pH7.0。7明胶培养基：NaCl 0.5%、蛋白胨1.0%、牛肉膏0.3%、明胶12%、蒸馏100mL，调pH 7.2-7.4。8西蒙斯氏柠檬酸钠盐培养液：柠檬酸钠0.

8、2%、NaCl 0.5%、MgSO40.02%、磷酸二氢钾0.1%、磷酸氢氨0.1%、 溴麝香草酚蓝水溶液1ml、琼脂2%、蒸馏水100ml、PH7.2-7.4。9耐盐试验培养基2%、5%、7%、10%：营养琼脂3.3%、NaCl0.2%、0.5%、0.7%、1.0%、蒸馏水100ml、PH7.2-7.4。10糖发酵培养基110灭菌-切记重设温度绝不能破坏糖成分，且需用漏斗移入试管.葡萄糖发酵培养基：葡萄糖1.0%、蛋白胨0.2%、NaCl 0.5%、磷酸氢二钾0.02%、0.2%溴钾酚紫最后参加、PH7.2-7.4。.乳糖发酵培养基：乳糖1.5%、蛋白胨0.2%、NaCl 0.5%、磷酸氢二

9、钾0.02%、溴钾酚紫0.2%最后参加、PH7.2-7.4。.木糖发酵培养基：木糖1.0%、蛋白胨0.2%、NaCl 0.5%、磷酸氢二钾0.02%、溴钾酚紫0.2%最后参加、PH7.2-7.4。.阿拉伯糖培养基：阿拉伯糖1.0%、蛋白胨0.2%、NaCl 0.5%、磷酸氢二钾0.02%、溴钾酚紫0.2%最后参加、PH7.2-7.4。.甘露醇发酵培养基：甘露醇1.0%、蛋白胨0.2%、NaCl 0.5%、磷酸氢二钾0.02%、溴钾酚紫0.2%最后参加、PH7.2-7.4。11葡萄糖蛋白胨培养基(VP、MR试验110灭菌：葡萄糖0.5%、蛋白胨0.5%、NaCl 0.5%、PH7.2-7.4。1

10、2蛋白胨水培养基吲哚试验：蛋白胨1.0%、NaCl 0.5%、PH7.2-7.4。(13)酪氨酸培养基酪氨酸水解试验：L-酪氨酸0.5g悬浮于10ml蒸馏水中，20min 110灭菌，与100ml无菌营养琼脂混合，即成酪氨酸水解平板。(14)酪素水解培养基酪素水解试验):取5g脱脂奶粉与一号三角瓶中，参加50ml蒸馏水，110灭菌。另称1.5g琼脂置于含50mL蒸馏水的二号三角瓶中,120灭菌,待冷至45-50C时,将两液混匀倒成平板,即为牛奶平板。将平板倒置过夜,使外表水分枯燥(15)0.9%无菌生理盐水称取0.85g NaCl于100ml蒸馏水中，摇匀，120灭菌。 工具:取样：铁锹、尺子

11、、塑料袋等培养：接种环针、培养皿、棉塞、试管、试管架、锥形瓶、标签纸、打火机、酒精灯、报纸、橡皮筋、无菌棉签、滤纸片、载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、精密pH试纸、吸水纸、培养基平板，无菌水，试管架，酒精灯，酒精瓶，记号笔等其他工具：无菌操作台、恒温振荡培养箱、恒温培养、光学显微镜、高压灭菌锅、干热空气灭菌箱等六实验步骤及记录土壤取样通过实地考察，以土壤肥沃程度优先，确定采样点。采集5-20深度的土壤，五点采样，样品装在2个无菌纸袋中编号为“河边和“树下两个组名。记录采样时间、地点、环境、土壤类型等。样品存于4冰箱保存备用。土壤悬浊液的制备已配好0.9%的生理盐水并参加玻璃珠于锥形瓶，高压灭菌

12、后，将已采集的泥土样品河边、树下摇匀后各取10.0g于100ml生理盐水的锥形瓶中，随后我们将其放置水浴摇床进行保温并摇匀，并在85C90C区间保持了20min目的为了杀死不能产生芽孢的细菌，取出并将该两组土壤悬浊液放置入冰箱冷藏。别离纯化【菌种的挑选】用一支新的无菌枪头从各浓度土壤稀释液中分别吸取0.2 mL涂布于已标记好稀释度的牛肉膏蛋白胨培养基上,每个浓度梯梯度取两个重复,标记日期、时间、组别，置于37培养箱中培养24h。经过24h后从树下的1:100、1:1000、1:100003个培养基中挑选出3个单菌落，并在河边的1:100、1:1000、1:100003个培养基中挑选出7个单菌落

13、；将10个已灭菌的培养皿标好采样地点及提取液浓度，并在皿底画十字分为1、2、3、4区域，以便其后进行划线纯化。划线时先在已经平板培养基的一边作第1次平行划线34条，再转动培养皿约60角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第1次划线局部作第2次平行划线，再用同法通过第2平行划线局部作第3次平行划线和通过第3次平行划线局部作第4次平行划线。划线完毕，在培养皿底部和顶部写上菌落编号和对应的纯化次数如“树1-1、河1-1将以上10个已接种培养皿倒置于2829恒温培养箱中培养约20h倒置培养以免冷凝水滴落污染培养基。【菌种的纯化】纯化三次后进行镜检，挑取纯化的菌种进行单染色，观察细菌是否为杆状，以及细

14、菌的大小、两端形态、粗细、着色深浅等是否一致。假设不全为杆状，那么弃用，假设个体形态不一致，且形态不一致的两种或多种细菌数量相当，那么再次纯化，直至个体形态一致。我们组在纯化第四次时已得到满意结果，并保存2号和9号菌种进行后续实验舍去其余组别并重新编号为Ttree代表采集地、Rriverside代表采集地，将T、R两组进行斜面接种6支试管三组，其中一组为了明天实验活化，一组为了菌种保藏，另一组进行备用.产淀粉酶芽孢杆菌的筛选我组操作顺序错误利用接种环挑取纯化的菌落分别点种到含淀粉培养基的无菌平板上，并标记菌落编号、日期、时间、组别，放置在37恒温培养箱中培养48h。取出平板滴加路哥氏碘液，缓慢

15、摇晃至碘液将平板覆盖均匀，静置，产生透明圈的菌株初步定为淀粉酶产生菌株。【我们的筛选环节定位错误，已将局部菌种筛去，余下的T、R两组仅有R能够产生透明圈】从活化后的斜面中沾取备份菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基，37培养12h进行革兰氏染色，培养24h进行芽孢染色。假设未观察到芽孢，挑取与之前挑取位置不同位置的菌落再次染色观察。假设仍未观察到芽孢，从斜面中挑取形态与选取的菌株不同的菌株进行活化、染色。镜检*单染色法1、涂片：用1%盐酸清洁玻片后，在玻片中央滴上一小滴蒸馏水，再用无菌操作的方法挑菌少许于玻片的水中，并充分混匀涂成薄膜。2、枯燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然枯燥。3、固定：涂面朝上，

16、通过微火2-3次。4、染色：待玻片冷却后加结晶紫或者石炭酸复红1-2滴于涂片上，覆盖涂面染色1-2分钟。5、水洗：倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至流下的水变无色为止注：勿冲去菌体。6、枯燥：自然枯燥，或用吸水纸吸干。7、镜检：油镜观察并进行摄影记录*芽孢染色方法1、 涂片、枯燥及固定2、加温染色：加5%孔雀绿染色液于玻片上，微火加热至冒蒸汽维持5分钟。3、水洗 将玻片冷却，水洗直到流出的水中无绿色为止。4、常温复染：加番红染色2分钟后，倾去染色液，水洗，直接用吸水纸吸去余水。5、镜检：用油镜观察。记录结果。*革兰氏染色方法1. 涂片、枯燥及固定2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液

17、，染1-2分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。3. 媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。4. 脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约25秒，后立即用流水冲洗。5. 复染：滴加番红染色液，染2分钟，水洗后用吸水纸吸干。 6. 镜检：观察记录染色结果。.初步鉴定以上实验已经挑选出可产芽孢的革兰氏阳性菌。随后进行17项细菌生化鉴定。并进行简述1接触酶试验：【T、R两个菌种均为阴性】用接种环挑取适量菌苔插入装有H2O2的试管中，观察是否有大量气泡产生，将接种环灼烧、冷却后插入H2O2中作空白对照。2糖发酵试验：【T、R两个菌种均只在葡萄糖发酵实验中呈阳性，且变色不产气

18、，其余各组糖发酵试验均呈阴性】用接种环将两种杆菌分别接种于葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇的发酵管内，每种发酵管做两个平行，标记，并设置不接种菌的相同发酵管做空白对照 37培养24h。观察记录，与对照管比拟，假设接种培养液保持原有颜色，其反响结果为阴性，说明该菌不能利用该种糖，记录用“-表示，假设培养液呈黄色，反响结果为阳性，说明该菌能分解该种糖产酸，记录用“+表示。培养液的杜氏小管内气泡明显增大为阳性反响，说明该菌分解糖能产酸产气，记录用“+表示，如杜氏小管内没有气泡为阴性反响，记录用“-表示。3V.P试验：【T、R两个菌种均为阴性】取葡萄糖蛋白胨培养液的试管，编号，以无菌操作分别接种少量菌苔

19、至以上相应试管中，空白对照管不接菌，置37恒温箱中，培养24h，培养完后，取出上述试管充分震荡2min每管分别参加40%NaOH溶液1020滴，并加萘酚，振荡试管，置37温箱中保温15-30min后，假设培养基呈红色，记录为V.P试验阳性反响+表示，假设不呈红色，记录为V.P试验阴性反响用“-表示。4MR试验：【T、R两组均为阳性】取葡萄糖蛋白胨培养液的试管，编号，以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，空白对照管不接菌，置37恒温箱中，培养24h，培养完后，取出上述试管，参加甲基红试剂2滴，变红色那么呈阳性+，黄色为阴性-。5吲哚试验：【T、R两组均为阴性】取装有蛋白胨水培养液的试管编号

20、，以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管中，并做空白对照，置37培养箱中24h，在培养液中参加乙醚1-2ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢参加5-10滴吲哚试剂，如有吲哚存在，乙醚层呈玫瑰红色，说明吲哚试验为阳性反响，否那么为阴性反响。6耐盐试验：将别离获得的菌种分别接种在含盐2%、5%、7%、10%的培养基中，设置一组对照，一组平行实验组，并置于37下培养，观察生长状况，并做记录。记录方式如下：不生长：-，生长差：+，生长一般：+，生长良好：+；7柠檬酸盐利用试验:【R菌种呈阳性变蓝色，T菌种呈阴性与空白组相同】取假设干装有西蒙斯柠檬酸盐培

21、养基的试管，将菌种接入试管，置于37恒温箱中培养2448h。假设培养基为蓝色，那么说明能利用柠檬酸盐作为碳源生长，以“+表示。假设培养基为绿色那么为阴性，以“表示。(8)明胶试验: 【T为阳性、R为阴性】挑取菌种，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度或点种于平板培养基。于2022培养714天。每天观察结果，假设因培养温度高而使明胶本身液化时，应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否被细菌液化，如确被液化，即为试验阳性，以“+表示。平板试验结果的观察为在培养基平板点种的菌落上滴加试剂，假设为阳性，10-20min后，菌落周围应出现清晰带环。否那么为阴性。(9)硝酸盐复原试验:【T、R两菌

22、种均为明显阳性】接种于硝酸盐培养基中，于35培养1-4d.将甲、乙液等量混合后约0.1 mL参加培养基内，立即观察结果。 结果：出现红色为阳性。假设参加试剂后无颜色反响，可能是：硝酸盐没有被复原，试验阴性；硝酸盐被复原为氨和氮等其他产物而导致假阴性结果，这时应在试管内参加少许锌粉，如出现红色那么说明试验确实为阴性。(10酪素水解试验：【T、R均产生明显透明圈，为阳性】取牛奶平板，将菌种划线接在平板上，每皿1株菌。设置一组对照，一组平行实验组，并置于37恒温箱培养，假设菌落周围和下面酪素已被分解而呈透明那么为阳性。11酪氨酸水解试验：【结晶均不消失，T、R两组均为阴性】取酪氨酸平板，将测试菌接种

23、于划线接于培养基上，设置一组对照，一组平行实验组，并置于37恒温箱培养，假设酪氨酸结晶被水解而变透明那么为阳性。12运动性试验：【T菌种为树根状生长，R菌种直立生长】使用半固体营养琼脂试管,将接种针从培养基中央自上而下直刺到试管底1-1.5cm处，沿穿刺线拔出接种针，置于37培养箱中培养24小时观察。观察是否为树根状生长，假设有，那么菌株有鞭毛，假设直立生长，那么菌株无鞭毛。13温度试验：使用牛肉膏蛋白胨培养基，将菌株接种到平板上，分别在5、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60条件下培养24小时，观察细菌是否生长。(14)PH试验：将菌株分别接种到不同PH为5.7和7.2

24、的营养肉汤中，置于37培养24小时，观察是否长菌，比拟生长情况。15卵黄反响试验：【T无乳白色的浑浊环，R产生乳白色浑浊环】取18-24小时的斜面或培养液中的菌体，点种在卵黄反响培养基中，点的直径约为2-3mm，置于37培养箱中培养18-24小时，观察，如菌落四周形成乳白色的浑浊环，表示卵磷脂分解生成脂肪，说明有卵磷脂酶。160.001%溶菌酶试验：【T、R两个菌种均为阴性】将菌种制成菌悬液，涂布在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，将干净的小滤纸片充分浸在溶菌酶试剂中，贴在平板上，置于37培养箱中培养24小时后观察，假设出现抑菌圈，那么为阳性反响，无那么为为阴性反响。(17)淀粉水解试验：【R为阳性，

25、T为阴性】将菌种接种到淀粉水解平培养基中，置于37培养基中培养24小时，观察是否有透明圈出现，假设有，那么菌种能产胞外淀粉酶，假设无，那么不能产该酶。将以上鉴定结果与以下伯杰氏手册进行比对通过比对可以得知T(树下采集菌种)为凝结芽孢杆菌、R河边采集菌种为蜡状芽孢杆菌*菌落和个体形态观察详细步骤见上页 1、单染色 2、革兰氏染色 3、芽孢染色七实验结果记录及分析1.土壤样品记录：土壤采集地点颜色湿度气味广州大学生化楼的树木下红褐色中度，较干爽，呈粉末状无特殊异味广州大学生化楼下的河涌边棕黑色高度，较湿润，呈粘土状土腥味重，似放线菌气味备注：采集时间为2015.12.3号下午，温度约为2025摄氏

26、度,树下样品记为T，河边样品记为R2.土壤稀释液涂布后培养情况：土壤记号/稀释梯度1/1001/10001/100001/100000T较多菌落3个菌落2个菌落无菌生长R多菌落5个菌落1个菌落无菌生长我们从树下的1:100、1:1000、1:10000中挑选出3个单菌落，并在河边的1:100、1:1000、1:10000中挑选出7个单菌落进行纯化培养。随后我们选择了两个来自该两组采样点的菌种用作后续实验 R(riverside)组 T(tree)组3.菌落特征描述由以上2张图及现场观察可以看出：R组菌：浅黄偏白色，外表扁平，边缘较为圆滑，湿润且色泽较为光滑，无特殊异味。 通过第四次划线纯化，已

27、明显产生单菌落。T组菌：白色，外表扁平，边缘粗糙呈放射性生长状，湿润程度偏低较为粗糙，无特殊异味。 通过第四次划线纯化，已明显产生单菌落。4.镜检观察：经过小组讨论并商量已筛选出两个形态和采样地点各不同的菌种，并经镜检后，已进行四次划线纯化的单染色装片。A.单染色法: R(riverside)组对应上文河边 T(tree)组对应上文树下 菌体细长 菌体粗短菌种R：用显微镜油镜在10*100的放大倍数下观察，细杆状细菌被染成紫红色，均匀除右下角集团外散布在视野图内，杆状细菌较为细长如细丝状，个别菌体末端紫色较深，应该是形成了芽孢。菌种T：用显微镜油镜在10*100的放大倍数下观察，粗短杆状细菌被

28、染成紫红色。连接较为紧密有形成链状的趋势，疑似观察到芽孢，较小的小型菌体从正常体型的杆菌末端分出。B.革兰氏染色观察：菌种R：用显微镜油镜在10*100的放大倍数下观察，细杆状细菌被染成紫色，证明该菌为革兰氏阳性菌。染色较浅局部应该为该菌芽孢。一个细胞内一边或两边深的局部，可能都是正在形成的晶体蛋白。菌种T: 用显微镜油镜在10*100的放大倍数下观察，粗杆状细菌被染成紫色，较浅局部应为芽孢。以上两个镜检结果均证明R、T两个菌种为革兰氏阳性菌。C.芽孢染色观察：【备注】：由于在第一次镜检时培养时间不够或操作失误，无法将芽孢染成绿色，只能从革兰氏染色中确定产芽孢的特性，加上考虑对于无芽孢杆菌在制

29、悬液时高温水浴已被杀死，故从划线纯化第四次开始预设T、B两个菌种为产芽孢杆菌，并与实验最后一天重新取用48h培养物进行制作芽孢染色装片并进行镜检观察。菌种R：显微镜油镜在10*100的放大倍数下观察，杆状细菌被染成紫红色。细菌中央被染成绿色的柱形局部及游离在外的绿色圆形局部为该菌芽孢培养时间可能较长导致游离芽孢的产生但仍可明确判定为产芽孢杆菌.(R菌)菌种T：显微镜油镜在10*100放大倍数下观察，粗杆状细菌被染成紫红色.菌体连成链状大量中间存在绿色局部，且视野中游离芽孢明显较多，可明确判定为产芽孢杆菌.5.细菌生化鉴定接触酶试验：*记录：产气为动态过程，采用文字记录菌种R：挑取活化的菌种R并

30、接入装有H2O2的试管中，观察到无气泡产生，说明该菌的接触酶试验为阴性。菌种T：菌种T与菌种R实验现象大致相同。挑取活化的菌种T并接入装有H2O2的试管中，观察到无气泡产生，说明该菌的接触酶试验为阴性。【备注】由于第一次使用浓度较稀的H2O2无反响，但通过用重新稀释得到的H2O2溶液仍无反响，故均判断为阴性实验现象分析： 由以上现象判断，T菌种和B菌种均不产生接触酶.糖发酵试验：*记录：实验组较多，采用文字记录实验工程菌种A菌种B空白对照葡萄糖发酵试验+变色不产气+变色不产气-乳糖发酵试验-木糖发酵试验-阿拉伯糖试验-甘露醇发酵试验-R、T两种菌在木糖、阿拉伯糖、乳糖、甘露醇发酵中均呈现为阴性

31、(-),既不产酸也不产气,【本次实验均采用1个菌种2个实验，即进行平衡实验且留有每种糖发酵实验空白对照，确保实验的准确性】实验现象分析：以上结果现象说明T、R两个菌种均能分解利用培养基中的葡萄糖作为碳源生长且将葡萄糖分解为有机酸使溴甲酚紫变色为黄色，但产酸不产气，故杜氏小管中无气泡生成，且T、R两组实验的黄色深浅近乎一样，故可判定它们分解葡萄糖的效率相近，能较好地分解利用培养基中的葡萄糖。.VP试验：*记录：采用文字记录菌种R的两个平衡组现象相同，均呈黄色，为阴性-；菌种T的两个平衡组现象相同，均呈黄色，为阴性-。空白组：呈黄色实验现象分析：由以上现象记录判断R、T菌种均为VP试验阴性，说明R

32、、T菌种均不能利用葡萄糖脱羧形成乙酰甲基甲醇。所以均与空白组一样呈现黄色。.MR试验：*记录：采用文字记录菌种R：加甲基红指示剂1-2滴，呈现浅的淡红色，判断呈弱阳性。菌种T：加甲基红指示剂1-2滴，呈现鲜红色，判断呈阳性。空白组：无明显现象。实验现象分析：在已判断葡萄糖发酵试验为阳性的根底下，R、T两菌种在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量有机酸，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红变色。由以上现象及分析可判断MR试验中为T为阳性、R为弱阳性。p.s：医学上的检验标准：较为严格，甲基红为酸性指示剂，pH范围

33、为4.4-6.0，其pK值为5.0。故在pH5.0以下，随酸度而增强红色，在pH5.0以上，那么随碱度而增强黄色，在pH5.0或上下接近时，可能变色不够明显，此时应延长培养时间，重复试验。.吲哚试验：从37C培养箱经培养24h后取出R、T两组实验组，在培养液中参加乙醚1-2ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢参加5-10滴吲哚试剂。*记录：采用文字记录参加吲哚试剂后菌种R：无红色产生，呈阴性菌种T：无红色产生，呈阴性实验现象分析：由以上参加吲哚试剂的现象可得出R、T两菌种均不能分解培养基中的色氨酸生成吲哚(靛基质)，进而不能与试剂中的对二甲基氨基

34、苯甲醛作用，无法生成玫瑰吲哚而呈无色，故判断R、T两菌种均为吲哚试验阴性。.耐盐实验：*记录：组别较多，采用文字记录现象含盐量为2%的培养基： T和R菌种均能生长，形成白色菌落，其中T菌落面积较大含盐量为5%的培养基：T和R菌种均不能生长含盐量为7%的培养基: T和R菌种均不能生长含盐量为10%的培养基：T和R菌种均不能生长实验现象分析：T菌种能在含盐量2%的培养基中生长；而B菌种也能2%的培养基中生长,但两个菌种在含盐量为5%的培养基、含盐量为7%的培养基、含盐量为10%的培养基均不能生长同时可以初步猜测华南地区即广州大学土壤点的盐浓度较低。T、R两个菌种只适合在含盐量较低的环境中存活，耐盐

35、度较差即同时说明对环境中盐度变化适应能力差。 .柠檬酸盐利用试验：*记录现象以文字及图片记录菌种R：菌种R经过两天培养，柠檬酸盐培养基颜色由绿色变成蓝色，说明说明菌种R在柠檬酸盐利用试验中表现为阳性+菌种T：菌种T与空白对照一样，柠檬酸盐培养基颜色依然呈现绿色。说明菌种T在柠檬酸盐利用试验中表现为阴性-，不能利用柠檬酸盐作为碳源生长且接种物已转变为黄褐色，且后面稀释划线局部无新菌落生成，故可推断不能生长繁殖的T菌落已经死亡。实验现象记录分析： 柠檬酸盐培养基系一综合性培养基，其中柠檬酸钠为碳的唯一来源。而磷酸二氢铵是氮的唯一来源。如R菌能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分解

36、柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。而不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌如T菌，在该培养基上不生长，不能利用柠檬酸钠作为碳源,且观察到T菌的划线局部无新的菌落生成，而旧的接种物已变为黄褐色不知是否可以判定已经死亡。【同时在T菌培养基中发现一个蓝色点，经判断为培养基被划破的地方，应被杂菌污染，所以个人认为假设在培养皿中进行柠檬酸盐实验，虽然变色现象会比试管更明显，但由于与空气接触面积大，易增加杂菌污染，所以更应防止破坏培养基，且必须倒置培养】.明胶试验：*记录：为性质实验，故采用文字记录经过在20培养箱中培养7天后，从培养箱中取出，但因为室温较高故

37、所有试管中的明胶均不能凝固，所以我们将冰箱中放置20分钟后再进行观察。在取出培养箱时，连同空白组和平衡实验带来的总和共5支管，均是液体状态，无法判断是否被细菌液化，故放置进冰箱静置观20分钟观察。结果呈现如下：菌种R:2支试管明胶状态与空白组情况一样，均为凝结状态，倾斜后液体不晃动呈现半固体状态。故判断R菌种为明胶试验阴性-菌种T:2支试管明胶呈现液体状，倾斜后液体会流动。故判断为明胶试验阳性+空白组：凝固状态，倾斜后明胶不流动。 菌种R 菌种T 菌种R 空白组实验现象记录分析：*通过本次明胶试验，我们可以判定菌种R不能产生明胶酶，菌种T可以产生明胶酶。因为该实验原理是利用某些细菌可产生一种胞

38、外酶-明胶酶，能使明胶分解为氨基酸，从而失去凝固力，半固体的明胶培养基成为流动的液体。*而实质上我们也可以同时明白到明胶【明胶是胶原局部水解而得到的一类蛋白质】作为一种大分子有机物不能被细菌直接利用，故细菌会分解出一种胞外酶-明胶酶，使明胶这种大分子被酶分解成氨基酸后进入蛋白质利用，而氨基酸为小分子与蛋白质的结构不同，故不能凝固。我同时感觉到这个实验对我们的生化机理也有十分重要的指导作用，可以解释许多细胞分泌胞外酶的现象。p.s同时其实我们发现这种明胶运动实验所耗时间较长为7天，所以通过百度搜寻，我们找到一个更为快捷得出结果的医学检验方法。明胶琼脂平板法可于普通琼脂参加1%明胶倾注平板后，分为

39、四个区，每个区分别划线接种一种被检菌，经24-48小时培养后，于培养基外表注入氯化汞溶液(氯化汞12g，蒸馏水80ml，浓盐酸16ml)，如细菌液化明胶，那么在菌落周围出现透明带。通过用透明带产生的效果，减少细菌需要消耗的底物的量，同时使效果更明显，且透明带的出现远远比明胶液化效果的产生来得更快。在现实应用上，该测试更多用于医学检测如：胃肠炎、肠热症、菌血症或败血症、破伤风、气性坏疽、肉毒中毒、结肠炎等急性疾病，故诊断时间和处理时间应尽可能压缩，故根据准确性和时效性，可能以上查到的方法2更适合用于现实生活。.硝酸盐复原试验：*记录：为性质实验，采用图片记录，该实验我们有失误，未参加杜氏小管菌种

40、R：分为2组进行平衡实验，参加约0.1ml10滴AB混合液后，试管里立即出现深的橙红色，并产生一局部絮状沉淀物如图见图一试管底部深色局部，说明菌种R能利用硝酸盐，其在硝酸盐复原试验中表现为阳性(+)。菌种T：菌种T与菌种R试验现象大致相同,且颜色深浅程度也相近。参加约0.1ml10滴AB混合液后，试管里立即出现深的橙红色并亦产生一局部絮状不溶物如图见图二第三支试管上半部白色絮状局部。说明菌种T能利用硝酸盐，其在硝酸盐复原试验中表现为阳性+。空白组：培养基溶液参加AB混合液后始终为黄色，无明显实验现象。 T R T R 空白 T R T R 空白 图一 图二实验现象记录分析：通过本次实验的结果，

41、我们能得悉到菌种R和菌种T均能通过复原途径利用硝酸盐，其在硝酸盐复原试验中表现为阳性(+)。在进行实验时混合AB两液能闻到浓烈的醋酸味，故在网上搜索原理发现本实验是通过一些细菌阳性菌能将硝酸盐复原为亚硝酸盐，随后亚硝酸盐与醋酸作用，生成亚硝酸，亚硝酸与试剂中的对氨基苯磺酸作用生成重氮基苯磺酸，后者与-萘胺结合生成N-萘胺偶苯磺酸这个原理进行的。而该实验我们也有失误，未参加杜氏小管进行对产氮气的检测，因为实质上硝酸盐复原过程会因细菌不同而异。有的细菌仅使硝酸盐复原为亚硝酸盐，如大肠埃希菌等；有的细菌可使其复原为亚硝酸盐和离子态的铵；有的细菌能使硝酸盐或亚硝酸盐复原为氮，如沙雷菌属；有的细菌还可以

42、将其复原产物在合成性代谢中完全利用。所以参加杜氏小管能更加具体地分析细菌的特性从而对细菌的分类鉴别，医学上对病人的诊断有着不可或缺的作用，而不应仅仅得悉实验的颜色变化。从沉淀物方面推测，絮状物有可能是蛋白质与亚硝酸盐产生的变性，亦有可能是蛋白质的盐析或者是菌体繁殖的细菌沉淀。因为反响原理较为复杂，我仍未完全剖析明白，故只能做出初步推测另外，如果想检查培养基中硝酸盐是否被分解，可取锌粉少许参加培养基内，如出现红色说明硝酸盐仍存在;假设不出现红色，表示硝酸盐已被分解。.酪素水解试验：*记录：现象通过图像进行记录菌种R：通过观察并进行测量菌种R的2个接种位点都产生直径约为1.0cm的透明圈，说明菌种

43、R能产生可以水解酪素的物质，在酪素水解试验中表现为阳性(+)菌种T：通过观察并进行测量菌种T的2个接种位点都产生直径约为0.700.90cm的透明圈(均比菌种R产生的透明圈小，说明菌种T能产生可以水解酪素的物质，在酪素水解试验中表现为阳性(+)空白组：无接种位点即为空白组，无透明圈等现象产生。 反面 正面实验现象记录分析： 通过本次实验记录发现，T、R两个菌种都能产生酪素酶使牛奶奶粉中的天然酪素结晶进行分解利用。尽管已经尽量减少变量处于同一个培养皿即也培养时间相同，但由于接种物的量(菌量不同)无法通过透明圈判断哪个菌种的酶产生效率更高。.酪氨酸水解试验： *记录：由于无阳性现象产生，采用文字记

44、录菌种R：均能生长，为白色菌落但无透明环。证明酪氨酸结晶没有被水解，为阴性菌种T：均能生长，为白色菌落但无透明环。证明酪氨酸结晶没有被水解，为阴性空白组：无菌生长，无明显变化。实验现象记录分析：通过实验现象显示，菌种R与菌种T均不能利用酪氨酸，培养基内的酪氨酸结晶依然存在无任何水解效应，细菌只是利用其中的营养琼脂进行生长繁殖。.运动性试验： *记录： 菌种R：外表有较厚白色菌膜，试管澄清，为直立的生长柱仅在柱的周边生成微量白色菌落，故判断为运动性试验阴性-。 菌种T:外表有白色菌膜厚度与菌种R相似，为树根状的生长柱，树根状明显，试管同样为澄清状态，故判断为运动性试验阳性+，细菌具有鞭毛有运动能力。 R管 R管 T管 T管 T R 比照图实验现象记录分析： 经过对以上实验现象进行分析，可观察到T菌种在穿刺通道中形成树根状的生长柱，且随着接种针由上而下深入培养基菌量逐渐减少的原因，上端扩散的云雾状效果明显而下端扩散效果较弱。即由该现象可判断T菌种有鞭毛能运动扩散到半固体培养基中；而R菌种无法在半固体培养基中扩散，只能向上外表进行生长繁殖，故判断为无鞭毛，但又因为两个菌种在外表都产生浓重的白色菌膜，故可推测为好氧菌。 .温度试验：*记录