人教版教学课件专题5-课题3-血红蛋白的提取和分离.ppt

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1、血红蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白两个两个两个两个肽链肽链肽链肽链两个两个两个两个一肽链一肽链一肽链一肽链四个亚铁四个亚铁四个亚铁四个亚铁血血红素基团红素基团红素基团红素基团每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。呈红色。血红蛋白的特点：血红蛋白的特点：血红蛋白的特点：血红蛋白的特点：一、基础知识一、基础知识 凝胶色谱法（分配色谱法）凝胶色谱法（分配色谱法）1 1、凝胶：、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通一些微小多孔的球体（内含许多贯穿

2、的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）2 2、概念：、概念：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法有效方法3 3、原理：、原理：用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质大的蛋白质A A路程较长，移动速度较慢路程较长，移动速度较慢 B B路程较长，移动速度较快路程较长，移动速度较快C C路程较短，移动速度较慢路程较短，移动速度较慢 D D路程较短，移动速度较快路程较短，移动速度较快D相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个的进行过程可表示为

3、图中哪一个B缓冲溶液：缓冲溶液：能够抵制（能够抵制（）对溶对溶液的（液的（）的影响，维持）的影响，维持PH PH 基本基本不变。不变。外界的酸或碱外界的酸或碱PHPH值值.概念：概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。电泳：电泳：.电泳原理：电泳原理：电泳利用了待分离样品中各种电泳利用了待分离样品中各种电泳利用了待分离样品中各种电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异分子带电性质的差异分子带电性质的差异分子带电性质的差异以及以及以及以及分子本身的大小分子本身的大小分子本身的大小分子本身的大小，形状的不同形状的不同形状的不同形状的不同，使带电分子产生不同

4、的迁移速，使带电分子产生不同的迁移速，使带电分子产生不同的迁移速，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。度，从而实现样品中各种分子的分离。度，从而实现样品中各种分子的分离。度，从而实现样品中各种分子的分离。.常见电泳类型：常见电泳类型：琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳SDSSDS聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳迁移率取决于它所带迁移率取决于它所带迁移率取决于它所带迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分净电荷的多少以及分净电荷的多少以及分净电荷的多少以及分子的大小、形状。子的大小、形状。子的大小、形状。子的大小、形状。电泳迁移率完电泳迁移率

5、完电泳迁移率完电泳迁移率完全取决于分子全取决于分子全取决于分子全取决于分子的大小。的大小。的大小。的大小。使用使用SDS-SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于白质的电泳迁移率完全取决于A A 电荷的多少电荷的多少 B B 分子的大小分子的大小C C 肽链的多少肽链的多少 D D 分子形状的差异分子形状的差异分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液有机溶剂有机溶剂 （无色透明的甲苯层）（无色透明的甲苯层）脂类物质脂类物质 （白色白色脂溶性物质沉淀层）脂溶性物质沉淀层）血红蛋白溶液血红蛋白溶液 （红色透明液体）（红色透明液体）红细胞破碎物沉（暗红色沉淀

6、物）红细胞破碎物沉（暗红色沉淀物）下列操作正确的是（下列操作正确的是（D D ）A.A.分离红细胞时采用低速长时间离心分离红细胞时采用低速长时间离心 B.B.红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可馏水就可C.C.分离血红蛋白溶液是低速短时间离心分离血红蛋白溶液是低速短时间离心 D.D.透析时要用透析时要用20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液，的磷酸缓冲液，透析透析12h12h在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程中，分析无误的是中，分析无误的是A A洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无洗涤红细胞的目的是

7、去除血浆中的葡萄糖、无机盐机盐B B洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果沉淀，达不到分离的效果C C洗涤过程选用洗涤过程选用0.1%0.1%的生理盐水的生理盐水D D透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质杂质D2.2.凝胶色谱操作凝胶色谱操作:.凝胶色谱柱的制作：凝胶色谱柱的制作：凝胶色谱柱的制作：凝胶色谱柱的制作：注意事项：注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网

8、，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。残留，蛋白质分离不彻底。.凝胶色谱柱的装填凝胶色谱柱的装填凝胶的选择：凝胶的选择：凝胶的选择：凝胶的选择：凝胶的前处理：凝胶的前处理：凝胶的前处理：凝胶的前处理：凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：注意：注意：注意：注意：1.1.1.1.凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。的空隙。的空隙。的空隙。2.2.2.2.装填凝胶柱时不得有气泡存在：装填凝胶柱时不得有气泡存在：装填凝胶柱时不得

9、有气泡存在：装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气因为气因为气因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。洗涤平衡：洗涤平衡：洗涤平衡：洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲装填完毕后，立即用缓冲装填完毕后，立即用缓冲装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在液洗脱瓶，在液洗脱瓶，在液洗脱瓶，在50cm50cm50cm50cm高的操作压下，用高的操作压下，用高的操作压下，用高的操作压下，用300ml300ml300ml300ml的的的的20mmol/l20mmol/

10、l20mmol/l20mmol/l的的的的磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pHpHpHpH为为为为7.07.07.07.0）充分洗涤平衡充分洗涤平衡充分洗涤平衡充分洗涤平衡12121212小时小时小时小时。注意：注意：注意：注意：1.1.1.1.液面不要低于凝胶表面，否则液面不要低于凝胶表面，否则液面不要低于凝胶表面，否则液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流可能有气泡混入，影响液体在柱内的流可能有气泡混入，影响液体在柱内的流可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。动与最终生物大分子物质的分离效果。动与最终生物大分子物质的分离效

11、果。动与最终生物大分子物质的分离效果。2.2.2.2.不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象的现象的现象的现象。50cm高装装配配好好的的凝凝胶胶柱柱.样品加入与洗脱样品加入与洗脱调节缓冲液面调节缓冲液面调节缓冲液面调节缓冲液面滴加透析样品滴加透析样品滴加透析样品滴加透析样品注意：注意：注意：注意：正确的加正确的加正确的加正确的加样操作是：样操作是：样操作是：样操作是：1.1.1.1.不要触及并破不要触及并破不要触及并破不要触及并破坏凝胶面。坏凝胶面。坏凝胶面。坏凝胶面。2.2.2.2.贴壁加样。贴

12、壁加样。贴壁加样。贴壁加样。3.3.3.3.使吸管管口沿管壁环绕移动。使吸管管口沿管壁环绕移动。使吸管管口沿管壁环绕移动。使吸管管口沿管壁环绕移动。样品渗入凝胶床样品渗入凝胶床样品渗入凝胶床样品渗入凝胶床洗脱洗脱洗脱洗脱收集收集收集收集注意：在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，注意：在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，注意：在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，注意：在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功。说明色谱柱制作成功。说明色谱柱制作成功。说明色谱柱制作成功。开始进行层析收集得到的纯化后的蛋白二、实验操作二、实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋

13、白质的提取和分离一般分为四步：（1 1）样品处理：样品处理：包括洗涤红细胞；血红包括洗涤红细胞；血红蛋白释放；离心等操作收集到的血红蛋蛋白释放；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。白溶液。（2 2）粗分离：粗分离：透析除去分子较小的杂质。透析除去分子较小的杂质。（3 3）纯化：纯化：通过凝胶色谱法将分子量较通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。大的杂质蛋白质除去。（4 4）纯度鉴定：纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。泳鉴定。实践训练实践训练1.1.1.1.下列各项中，一般不影响在凝胶色谱法分离蛋白质下列各项中，一般不影响在凝胶色谱法分离蛋白质下列各项中，一般不影响在凝

14、胶色谱法分离蛋白质下列各项中，一般不影响在凝胶色谱法分离蛋白质中的分离度的是中的分离度的是中的分离度的是中的分离度的是()()()()A.A.A.A.层析柱高层析柱高层析柱高层析柱高 B.B.B.B.层析柱的直径层析柱的直径层析柱的直径层析柱的直径 C.C.C.C.缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液 D.D.D.D.样品的分布样品的分布样品的分布样品的分布2.2.2.2.蛋白质的提取和分离一般分为四步，即蛋白质的提取和分离一般分为四步，即蛋白质的提取和分离一般分为四步，即蛋白质的提取和分离一般分为四步，即、和、和、和、和。后三步常用的方法。后三步常用的方法。后三步常用的方法。后三步常用的方法依次

15、是、依次是、依次是、依次是、。B B粗分离粗分离粗分离粗分离纯化纯化纯化纯化样品处理样品处理样品处理样品处理纯度鉴定纯度鉴定纯度鉴定纯度鉴定透析法透析法透析法透析法凝胶色谱法凝胶色谱法凝胶色谱法凝胶色谱法SDSSDSSDSSDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳凝胶电泳凝胶电泳3.3.下列是有关血红蛋白提取和分离的相关下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是（操作，其中正确的是（）A A可采集猪血作为实验材料可采集猪血作为实验材料 B B用蒸馏水重复洗涤红细胞用蒸馏水重复洗涤红细胞C C血红蛋白释放后应低速短时间离心血红蛋白释放后应低速短时间离心 D D洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液出液A