仪器分析实验讲义.ppt

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1、仪仪器器分分析析实实验验漆红兰、高强、杜建修、岳宣峰组成（10个实验）：v光 四个实验（分光光度法、紫外吸收光谱法、荧光分析法和原子吸收光谱法）v电 四个实验（电位分析法（离子选择电极和电位滴定法）、电解分析法、循环伏安法）v色谱 两个实验（气相色谱和液相色谱）实验目录1.邻二氮菲分光光度法测定微量铁2.紫外分光光度法测定蛋白质含量3.原子吸收光谱法测定钙最佳实验条件的选择4.荧光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量5.离子选择电极法测定氟离子6.自动电位滴定法测定NaOH浓度7.库仑滴定测定硫代硫酸盐8.循环伏安法测定亚铁氰化钾9.苯、甲苯和乙苯混合物的分离与定量分析10.反相色谱法测定

2、中药样品中延胡索乙素的含量要求与注意事项要求与注意事项安全安全卫生卫生实验预习报告实验预习报告实验操作实验操作实验报告实验报告学习目的：学习目的：了解各种仪器分析方法的测定原理（了解各种仪器分析方法的测定原理（定性、定量定性、定量）熟练掌握所用仪器的操作熟练掌握所用仪器的操作正确表示实验结果正确表示实验结果学会选择合适的仪器进行所需物质的分析学会选择合适的仪器进行所需物质的分析1.分析化学是做什么的？分析化学是做什么的？分分析析化化学学是是化化学学测测量量和和表表征征的的科科学学！这这句句话可展开为：话可展开为：1）What?定定性性分分析析(qualitativeanalysis，表表征征)

3、:精精确确的的描描述述其其成成分分，含含量量、价价态态、状状态态、结结构构和和分布等特征；分布等特征；2）Howmuch?定定量量分分析析(quantitativeanalysis，测测量量):获获取取制制定定体体系系中中有有关关物物质质的的质质、量量和和结结构构等各种信息。等各种信息。第一部分 概述一、分析化学分析化学2.分析化学分类分析化学分类分析化学分为两类：化学分析以及仪器分析！分析化学分为两类：化学分析以及仪器分析！化学分析：以物质化学反应为基础的分析方法化学分析：以物质化学反应为基础的分析方法化学分离：沉淀、萃取、蒸馏等分离方法；化学分离：沉淀、萃取、蒸馏等分离方法；定性方法：加入

4、各种试剂，测量待测物（定性方法：加入各种试剂，测量待测物（analyte,targetspecies）的颜色、沸熔点、气味、光学性质）的颜色、沸熔点、气味、光学性质（拆射、反射、衍射等）以及在不同溶剂中的（拆射、反射、衍射等）以及在不同溶剂中的溶解特性。溶解特性。定量方法：重量法、滴定（容量）法定量方法：重量法、滴定（容量）法 仪仪器器分分析析：以以物物质质的的物物理理性性质质和和物物理理化化学学性性质质（光光、电、热、磁等）为基础的分析方法。电、热、磁等）为基础的分析方法。化学分离：色谱技术和毛细管电泳技术开始取代沉淀、化学分离：色谱技术和毛细管电泳技术开始取代沉淀、萃取、蒸馏等分离方法；萃

5、取、蒸馏等分离方法；定性定量方法：利用物质原子、分子、离子等的特性，定性定量方法：利用物质原子、分子、离子等的特性，如电导、电位、光吸收和发射、质荷比、荧如电导、电位、光吸收和发射、质荷比、荧光等；光等；评评论：化学分析方法多适于常量分析！尽管此法仍有广泛应用，但随时间的推论：化学分析方法多适于常量分析！尽管此法仍有广泛应用，但随时间的推移，尤其是随着大量的、新的仪器分析方法的出现，该法应用逐渐减！移，尤其是随着大量的、新的仪器分析方法的出现，该法应用逐渐减！思考：仪器分析方法所利用的许多物理现象的发现有一个多世纪了，可为什么其思考：仪器分析方法所利用的许多物理现象的发现有一个多世纪了，可为什

6、么其应用却远远滞后？应用却远远滞后？仪器分析的特点v仪器分析一般具有较强的检测能力，可以方便用于痕量分析。化学仪器分析一般具有较强的检测能力，可以方便用于痕量分析。化学分析的检测能力较差，只能用于常量组分及微量组分的分析分析的检测能力较差，只能用于常量组分及微量组分的分析v仪器分析法的取样量一般较少，可用于微量分析仪器分析法的取样量一般较少，可用于微量分析(0.110mg或或0.011mL)和超微量分析（和超微量分析（0.1g或或10mL)或半微量分析或半微量分析(0.010.1g或或110mL)v仪器分析法具有很高的分析效率，化学分析法的分析效率较低仪器分析法具有很高的分析效率，化学分析法的

7、分析效率较低v仪器分析具有更广泛的用途。仪器分析不但可用于成分分析、还可仪器分析具有更广泛的用途。仪器分析不但可用于成分分析、还可进行价态、状态及结构分析，无损分析，表面、微区分析，在线分进行价态、状态及结构分析，无损分析，表面、微区分析，在线分析和活体分析。而化学分析法一般只能用于离线的成分分析。析和活体分析。而化学分析法一般只能用于离线的成分分析。v仪器分析法的准确度一般不如化学分析法。化学分析的相对误差小仪器分析法的准确度一般不如化学分析法。化学分析的相对误差小于于0.2%，而仪器分析的相对误差通常为，而仪器分析的相对误差通常为15%，有的甚至大于，有的甚至大于10%。v仪器分析的仪器设

8、备一般比较复杂，价格比较昂贵；而化学分析使仪器分析的仪器设备一般比较复杂，价格比较昂贵；而化学分析使用的仪器一般都比较简单。用的仪器一般都比较简单。必须注意：必须注意：1）从从化化学学分分析析到到以以上上众众多多仪仪器器分分析析中中选选择择一一个个合合适适方方法法并不容易；并不容易；2）大大多多仪仪器器分分析析灵灵敏敏度度较较高高，但但不不是是所所有有仪仪器器分分析析的的灵灵敏度都比化学分析方法高；敏度都比化学分析方法高；3）仪仪器器分分析析对对多多元元素素或或化化合合物物分分析析具具更更高高的的选选择择性性，但但化化学学分分析析中中的的重重量量或或容容量量分分析析的的选选择择性性比比仪仪器器

9、分分析法析法要好；要好；4）从从准准确确性性、方方便便性性和和耗耗时时上上看看，不不能能绝绝对对地地讲讲哪哪种种方方法更好。法更好。1）电电子子计计算算机机技技术术在在一一起起分分析析中中的的广广泛泛应应用用，自自动动化化、提高分析效率、灵敏度和准确度提高分析效率、灵敏度和准确度2）不不同同分分析析方方法法的的联联用用，充充分分发发挥挥各各种种分分析析方方法法的的优优势，大大提高了仪器分析的功能。势，大大提高了仪器分析的功能。3）化化学学、物物理理学学、数数学学、电电子子学学、计计算算机机科科学学、生生命命科科学学等等各各学学科科的的互互相相渗渗透透、融融合合，使使分分析析化化学学成成为为一一

10、门门综合性的学科综合性的学科-分析学或分析科学。分析学或分析科学。仪器分析的发展现状仪器分析的发展现状仪器性能及其表征仪器性能及其表征问题：如何判断哪种仪器分析方法可用于解决某个分问题：如何判断哪种仪器分析方法可用于解决某个分析问题呢？析问题呢？基基于于以以上上问问题题，你你必必须须了了解解该该仪仪器器的的性性能能，或或者者说说，该仪器到底可作什么分析？该仪器到底可作什么分析？定量分析方法评价指标定量分析方法评价指标 标准曲线标准曲线和灵敏度（被测定物质浓度或含量与仪器响和灵敏度（被测定物质浓度或含量与仪器响应信号的关系曲线，其中成直线的部分称为线性范围，应信号的关系曲线，其中成直线的部分称为

11、线性范围，回归方程、回归系数）回归方程、回归系数）精密度精密度（使用同一方法，对同一试样进行多次测定所（使用同一方法，对同一试样进行多次测定所得结果的一致程度（重复性和再现性），用标准偏差得结果的一致程度（重复性和再现性），用标准偏差S和相对标准偏差量度和相对标准偏差量度RSD）准确度准确度（试样含量的测定值与试样含量真实值（或标（试样含量的测定值与试样含量真实值（或标准值）相符合程度，用相对误差量度）准值）相符合程度，用相对误差量度）Ex检出限检出限，DL选择性选择性IUPACIUPAC规规定定，评评价价一一个个分分析析方方法法的的主主要要评评价价指标指标 精密度精密度 准确度准确度 检出限

12、检出限选择分析方法的几种考虑选择分析方法的几种考虑仪器分析方法众多，对一个所要进行分析的对象，到仪器分析方法众多，对一个所要进行分析的对象，到底选择何种分析方法呢？可从以下几个方面考虑：底选择何种分析方法呢？可从以下几个方面考虑：您所分析的物质是元素？化合物？有机物？化合物您所分析的物质是元素？化合物？有机物？化合物结构剖析？结构剖析？您对分析结果的准确度要求如何？您对分析结果的准确度要求如何？您的样品量是多少？您的样品量是多少？您样品中待测物浓度大小范围是多少？您样品中待测物浓度大小范围是多少？可能对待测物产生干扰的组份是什么？可能对待测物产生干扰的组份是什么？样品基体的物理或化学性质如何？

13、样品基体的物理或化学性质如何？您有多少样品，要测定多少目标物？您有多少样品，要测定多少目标物？定量测定的方法定量测定的方法1.标准曲线法标准曲线法2.标准加入法标准加入法紫外-可见吸收光谱法紫外-可见分光光度法，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。特点：带光谱 分子光谱应用：定性分析-最大吸收波长 定量分析-朗伯-比尔定律（标准曲线法和标准加入法）邻二氮菲分光光度法测定微量铁邻二氮菲分光光度法测定微量铁邻二氮菲分光光度法测定微量铁邻二氮菲分光光度法测定微量铁实验目的实验目的实验目的实验目的学习确定实验条件的方法，掌握邻二氮菲分光光学习确定实验条件的方法，掌握邻二氮

14、菲分光光学习确定实验条件的方法，掌握邻二氮菲分光光学习确定实验条件的方法，掌握邻二氮菲分光光度法测定微量铁的方法原理。度法测定微量铁的方法原理。度法测定微量铁的方法原理。度法测定微量铁的方法原理。掌握掌握721型分光光度计的正确使用方法，并了解型分光光度计的正确使用方法，并了解此仪器的主要构造。此仪器的主要构造。光分析仪器的基本部件光分析仪器的基本部件光源光源光源光源单色器单色器单色器单色器吸收池吸收池吸收池吸收池检测器检测器检测器检测器显示器显示器显示器显示器可见光区光源：卤钨灯；吸收池材质：玻璃可见光区光源：卤钨灯；吸收池材质：玻璃可见光区光源：卤钨灯；吸收池材质：玻璃可见光区光源：卤钨灯

15、；吸收池材质：玻璃紫外光区光源：氘灯；紫外光区光源：氘灯；紫外光区光源：氘灯；紫外光区光源：氘灯；吸收池材质：石英吸收池材质：石英吸收池材质：石英吸收池材质：石英 根根根根据据据据朗朗朗朗伯伯伯伯比比比比耳耳耳耳定定定定律律律律：A=bcA=bc，当当当当入入入入射射射射光光光光波波波波长长长长 及及及及光光光光程程程程b b一一一一定定定定时时时时，在在在在一一一一定定定定浓浓浓浓度度度度范范范范围围围围内内内内，有有有有色色色色物物物物质质质质的的的的吸吸吸吸光光光光度度度度A A与与与与该该该该物物物物质质质质的的的的浓浓浓浓度度度度c c成成成成正正正正比比比比。只只只只要要要要绘绘绘

16、绘出出出出以以以以吸吸吸吸光光光光度度度度A A为为为为纵纵纵纵坐坐坐坐标标标标，浓浓浓浓度度度度c c为为为为横横横横坐坐坐坐标标标标的的的的标标标标准准准准曲曲曲曲线线线线，测测测测出出出出试试试试液液液液的的的的吸吸吸吸光光光光度度度度，就就就就可可可可以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。用用用用分分分分光光光光光光光光度度度度法法法法测测测测定定定定试试试试样样样样中中中中的的的的微微微微量量量量铁铁铁铁，目目目目前前前前一一一一般般般般采

17、采采采用用用用邻邻邻邻二二二二氮氮氮氮菲菲菲菲法法法法，该该该该法法法法具有高灵敏度、高选择性，且稳定性好，干扰易消除等优点。具有高灵敏度、高选择性，且稳定性好，干扰易消除等优点。具有高灵敏度、高选择性，且稳定性好，干扰易消除等优点。具有高灵敏度、高选择性，且稳定性好，干扰易消除等优点。实验原实验原实验原实验原 理理理理在在在在pH=2pH=29 9的溶液中，的溶液中，的溶液中，的溶液中，FeFe2+2+与邻二氮菲与邻二氮菲与邻二氮菲与邻二氮菲(phen)(phen)生成稳定的桔红色配合物生成稳定的桔红色配合物生成稳定的桔红色配合物生成稳定的桔红色配合物Fe(phen)Fe(phen)3 32

18、+2+：此配合物的此配合物的此配合物的此配合物的lgKlgK稳稳稳稳=21.3=21.3，摩尔吸光系数，摩尔吸光系数，摩尔吸光系数，摩尔吸光系数 510510=1.110=1.1104 4LmolLmol-1-1cmcm-1-1，而，而，而，而FeFe3+3+能能能能与邻二氮菲生成与邻二氮菲生成与邻二氮菲生成与邻二氮菲生成3 3 1 1配合物，呈淡蓝色，配合物，呈淡蓝色，配合物，呈淡蓝色，配合物，呈淡蓝色，lgKlgK稳稳稳稳=14.1=14.1。所以在加入显色剂之。所以在加入显色剂之。所以在加入显色剂之。所以在加入显色剂之前，应用盐酸羟胺前，应用盐酸羟胺前，应用盐酸羟胺前，应用盐酸羟胺(NH

19、(NH2 2OHHCl)OHHCl)将将将将FeFe3+3+还原为还原为还原为还原为FeFe2+2+，其反应式如下：，其反应式如下：，其反应式如下：，其反应式如下：2Fe2Fe3+3+2NH+2NH2 2OHHCl2FeOHHCl2Fe2+2+N+N2 2+H+H2 2O+4HO+4H+2Cl+2Cl-测定时控制溶液的酸度为测定时控制溶液的酸度为测定时控制溶液的酸度为测定时控制溶液的酸度为pH5pH5较为适宜。用邻二氮菲可测定试样中铁的总较为适宜。用邻二氮菲可测定试样中铁的总较为适宜。用邻二氮菲可测定试样中铁的总较为适宜。用邻二氮菲可测定试样中铁的总量。量。量。量。实验预习实验预习实验预习实验

20、预习 vv预习邻二氮菲分光光度法测定微量铁的方法原理。预习邻二氮菲分光光度法测定微量铁的方法原理。预习邻二氮菲分光光度法测定微量铁的方法原理。预习邻二氮菲分光光度法测定微量铁的方法原理。了解了解721型分光光度计的正确使用方法，并了解此仪器的主要构型分光光度计的正确使用方法，并了解此仪器的主要构造。造。721型分光光度计型分光光度计，1cm1cm吸收池，吸收池，吸收池，吸收池，10mL10mL吸量管，吸量管，吸量管，吸量管，50mL50mL比色管（或容量瓶）比色管（或容量瓶）比色管（或容量瓶）比色管（或容量瓶）仪器和试仪器和试仪器和试仪器和试 剂剂剂剂仪仪仪仪 器器器器 1.0101.010-

21、3-3molLmolL-1-1 铁铁铁铁标标标标准准准准溶溶溶溶液液液液：准准准准确确确确称称称称量量量量0.48220.4822g gNHNH4 4Fe(SO)Fe(SO)4 412H12H2 2OO于于于于烧烧烧烧杯杯杯杯中中中中，加加加加入入入入8080mLmL6 6molLmolL-1-1 HClHCl和和和和少少少少量量量量水水水水，溶溶溶溶解解解解后后后后转转转转移移移移至至至至1L1L容容容容量量量量瓶瓶瓶瓶中中中中，以水稀释至标线，摇匀。以水稀释至标线，摇匀。以水稀释至标线，摇匀。以水稀释至标线，摇匀。100gmL100gmL-1-1铁铁铁铁标标标标准准准准溶溶溶溶液液液液:准

22、准准准确确确确称称称称量量量量0.86340.8634g gNHNH4 4Fe(SO)Fe(SO)4 412H12H2 2OO于于于于烧烧烧烧杯杯杯杯中中中中，加加加加入入入入8080mLmL6 6molLmolL-1-1 HClHCl和和和和少少少少量量量量水水水水，溶溶溶溶解解解解后后后后转转转转移移移移至至至至1 1L L容容容容量量量量瓶瓶瓶瓶中中中中，以以以以水稀释至标线，摇匀。水稀释至标线，摇匀。水稀释至标线，摇匀。水稀释至标线，摇匀。0.15%0.15%邻邻邻邻二二二二氮氮氮氮菲菲菲菲水水水水溶溶溶溶液液液液，10%10%盐盐盐盐酸酸酸酸羟羟羟羟胺胺胺胺溶溶溶溶液液液液（新新新新

23、配配配配），1 1molLmolL-1-1乙乙乙乙酸酸酸酸钠溶液，钠溶液，钠溶液，钠溶液，1molL1molL-1-1NaOHNaOH溶液，溶液，溶液，溶液，6molL6molL-1-1HClHCl（工业盐酸试样）（工业盐酸试样）（工业盐酸试样）（工业盐酸试样）试试试试 剂剂剂剂1.1.打开仪器电源开关，预热。打开仪器电源开关，预热。打开仪器电源开关，预热。打开仪器电源开关，预热。2.2.调解仪器。调解仪器。调解仪器。调解仪器。3.3.将将将将空空空空白白白白放放放放入入入入测测测测量量量量池池池池中中中中，光光光光上上上上窗窗窗窗口口口口。记记记记录录录录吸吸吸吸光光光光度度度度。将将将将滑

24、滑滑滑竿竿竿竿拉拉拉拉到到到到待待待待测测测测溶溶溶溶液，关闭窗口，记录吸光度。液，关闭窗口，记录吸光度。液，关闭窗口，记录吸光度。液，关闭窗口，记录吸光度。4.4.标准曲线的制作。标准曲线的制作。标准曲线的制作。标准曲线的制作。基本操基本操基本操基本操 作作作作1.1.吸收曲线的绘制和测量波长的选择吸收曲线的绘制和测量波长的选择吸收曲线的绘制和测量波长的选择吸收曲线的绘制和测量波长的选择：用用用用吸吸吸吸量量量量管管管管吸吸吸吸取取取取2.002.00mL1.010mL1.010-3-3mol.Lmol.L-1-1标标标标准准准准溶溶溶溶液液液液，注注注注入入入入5050mLmL比比比比色色

25、色色管管管管中中中中，加加加加入入入入1.001.00mLmL10%10%盐盐盐盐酸酸酸酸羟羟羟羟胺胺胺胺溶溶溶溶液液液液，摇摇摇摇匀匀匀匀，加加加加入入入入2.002.00mL0.15%mL0.15%邻邻邻邻二二二二氮氮氮氮菲菲菲菲溶溶溶溶液液液液，5.05.0mLmLNaAcNaAc溶溶溶溶液液液液，以以以以水水水水稀稀稀稀释释释释至至至至刻刻刻刻度度度度。在在在在光光光光度度度度计计计计上上上上用用用用1 1cmcm比比比比色色色色皿皿皿皿，采采采采用用用用试试试试剂剂剂剂溶溶溶溶液液液液为为为为参参参参比比比比溶溶溶溶液液液液，在在在在440-560440-560nmnm间间间间，每每

26、每每隔隔隔隔1010nmnm测测测测量量量量一一一一次次次次吸吸吸吸光光光光度度度度，以以以以波波波波长长长长为为为为横横横横坐坐坐坐标标标标，吸吸吸吸光光光光度度度度为为为为纵纵纵纵坐坐坐坐标标标标，绘绘绘绘制制制制吸吸吸吸收收收收曲曲曲曲线线线线，选选选选择择择择测测测测量量量量的的的的适适适适宜宜宜宜波波波波长长长长。（选择合适的波长，灵敏度和选择性的问题选择合适的波长，灵敏度和选择性的问题选择合适的波长，灵敏度和选择性的问题选择合适的波长，灵敏度和选择性的问题）实验步骤实验步骤实验步骤实验步骤 2.2.工业盐酸中铁含量的测定工业盐酸中铁含量的测定工业盐酸中铁含量的测定工业盐酸中铁含量的

27、测定：(1)(1)标标标标准准准准曲曲曲曲线线线线的的的的制制制制作作作作:在在在在5 5支支支支5050mLmL比比比比色色色色管管管管中中中中，分分分分别别别别加加加加入入入入0.200.20、0.400.40、0.600.60、0.800.80、1.001.00mLmL100100g/mLg/mL铁铁铁铁标标标标准准准准溶溶溶溶液液液液，再再再再加加加加入入入入1.001.00mL10%mL10%盐盐盐盐酸酸酸酸羟羟羟羟胺胺胺胺溶溶溶溶液液液液，2.00mL0.15%2.00mL0.15%邻二氮菲溶液和邻二氮菲溶液和邻二氮菲溶液和邻二氮菲溶液和5.0mLNaAc5.0mLNaAc溶液，以

28、水稀释至刻度，摇匀。溶液，以水稀释至刻度，摇匀。溶液，以水稀释至刻度，摇匀。溶液，以水稀释至刻度，摇匀。(2)(2)试试试试样样样样测测测测定定定定:准准准准确确确确吸吸吸吸取取取取2.02.0mLmL工工工工业业业业盐盐盐盐酸酸酸酸三三三三份份份份，按按按按标标标标准准准准曲曲曲曲线线线线的的的的操操操操作作作作步步步步骤骤骤骤，测测测测定其吸光度。（定其吸光度。（定其吸光度。（定其吸光度。（标准曲线法标准曲线法标准曲线法标准曲线法）1.1.以以以以波波波波长长长长为为为为横横横横坐坐坐坐标标标标，吸吸吸吸光光光光度度度度为为为为纵纵纵纵坐坐坐坐标标标标，绘绘绘绘制制制制吸吸吸吸收收收收曲曲

29、曲曲线线线线，选选选选择择择择测测测测量量量量的的的的最最最最适适适适宜波长条件。宜波长条件。宜波长条件。宜波长条件。2.2.以以以以铁铁铁铁浓浓浓浓度度度度为为为为横横横横坐坐坐坐标标标标，吸吸吸吸光光光光度度度度为为为为纵纵纵纵坐坐坐坐标标标标绘绘绘绘制制制制标标标标准准准准曲曲曲曲线线线线。根根根根据据据据试试试试样样样样的的的的吸吸吸吸光光光光度度度度，从从从从标标标标准准准准曲曲曲曲线线线线求求求求出出出出工工工工业业业业盐盐盐盐酸酸酸酸中中中中铁铁铁铁的的的的含含含含量量量量（以以以以g/mLg/mL表表表表示示示示），计计计计算算算算测测测测量量量量结结结结果果果果的的的的平均值

30、和相对偏差平均值和相对偏差平均值和相对偏差平均值和相对偏差（准确度的问题）（准确度的问题）（准确度的问题）（准确度的问题）。数据处理数据处理数据处理数据处理1.1.邻二氮菲分光光度法测定微量铁时为何要加入盐酸羟胺溶液？邻二氮菲分光光度法测定微量铁时为何要加入盐酸羟胺溶液？邻二氮菲分光光度法测定微量铁时为何要加入盐酸羟胺溶液？邻二氮菲分光光度法测定微量铁时为何要加入盐酸羟胺溶液？2.2.吸收曲线与标准曲线有何区别？在实际应用中有何意义？吸收曲线与标准曲线有何区别？在实际应用中有何意义？吸收曲线与标准曲线有何区别？在实际应用中有何意义？吸收曲线与标准曲线有何区别？在实际应用中有何意义？3.3.透射

31、比与吸光度两者关系如何？测定条件指哪些？透射比与吸光度两者关系如何？测定条件指哪些？透射比与吸光度两者关系如何？测定条件指哪些？透射比与吸光度两者关系如何？测定条件指哪些？4.4.邻二氮菲与铁的显色反应，其主要条件有哪些？邻二氮菲与铁的显色反应，其主要条件有哪些？邻二氮菲与铁的显色反应，其主要条件有哪些？邻二氮菲与铁的显色反应，其主要条件有哪些？5.5.加各种试剂的顺序能否颠倒？加各种试剂的顺序能否颠倒？加各种试剂的顺序能否颠倒？加各种试剂的顺序能否颠倒？注意事项和问题注意事项和问题注意事项和问题注意事项和问题紫外分光光度法测定蛋白质含量紫外分光光度法测定蛋白质含量紫外分光光度法测定蛋白质含量

32、紫外分光光度法测定蛋白质含量实验目的实验目的实验目的实验目的学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。掌握掌握掌握掌握TU-1901TU-1901紫外紫外紫外紫外-可见分光光度计的使用方法并了可见分光光度计的使用方法并了可见分光光度计的使用方法并了可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。解此仪器的

33、主要构造。解此仪器的主要构造。解此仪器的主要构造。本本本本实实实实验验验验采采采采用用用用紫紫紫紫外外外外分分分分光光光光光光光光度度度度法法法法测测测测定定定定蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质含含含含量量量量。蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质中中中中酪酪酪酪氨氨氨氨酸酸酸酸和和和和色色色色氨氨氨氨酸酸酸酸残残残残基基基基的的的的苯苯苯苯环环环环含含含含有有有有共共共共轭轭轭轭双双双双键键键键，因因因因此此此此，蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质具具具具有有有有吸吸吸吸收收收收紫紫紫紫外外外外光光光光的的的的性性性性质质质质，其其其其最最最最大大大大吸吸吸吸收收收收峰峰峰峰位位位位于于于于280280nmnm附附附附近

34、近近近（不不不不同同同同的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质吸吸吸吸收收收收波波波波长长长长略略略略有有有有差差差差别别别别）。在在在在最最最最大大大大吸吸吸吸收收收收波波波波长长长长处处处处，吸吸吸吸光光光光度度度度与与与与蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质溶溶溶溶液液液液的的的的浓浓浓浓度度度度的关系服从朗伯的关系服从朗伯的关系服从朗伯的关系服从朗伯-比耳定律。比耳定律。比耳定律。比耳定律。280nm275nm实验原理实验原理实验原理实验原理实验预习实验预习实验预习实验预习vv预习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。预习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。预习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。预习紫外

35、分光光度法测定蛋白质含量的原理。vv预习紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验步骤。预习紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验步骤。预习紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验步骤。预习紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验步骤。vv了解了解了解了解TU-1901TU-1901紫外紫外紫外紫外-可见分光光度计的主要构造。可见分光光度计的主要构造。可见分光光度计的主要构造。可见分光光度计的主要构造。TU-1901TU-1901紫外紫外紫外紫外-可见分光光度计，比色管，吸量管可见分光光度计，比色管，吸量管可见分光光度计，比色管，吸量管可见分光光度计，比色管，吸量管标准蛋白质溶液：标准蛋白质溶液：标准蛋白质溶液：标准

36、蛋白质溶液：5.00mg.mL5.00mg.mL-1-1溶液溶液溶液溶液0.9%NaCl0.9%NaCl溶液，待测蛋白质溶液溶液，待测蛋白质溶液溶液，待测蛋白质溶液溶液，待测蛋白质溶液（牛血清白蛋白）（牛血清白蛋白）（牛血清白蛋白）（牛血清白蛋白）仪器与试剂仪器与试剂仪器与试剂仪器与试剂1.1.启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器。启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器。启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器。启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器。2.2.在在在在工工工工作作作作界界界界面面面面上上上上选选选选择择择择测测测测量量量量

37、项项项项目目目目（光光光光谱谱谱谱扫扫扫扫描描描描，光光光光度度度度测测测测量量量量），本本本本实实实实验验验验选选选选择择择择光度测量，设置测量条件（测量波长等）。光度测量，设置测量条件（测量波长等）。光度测量，设置测量条件（测量波长等）。光度测量，设置测量条件（测量波长等）。3.3.将空白放入测量池中，点击将空白放入测量池中，点击将空白放入测量池中，点击将空白放入测量池中，点击STARTSTART扫描空白，点击扫描空白，点击扫描空白，点击扫描空白，点击ZEROZERO校零。校零。校零。校零。4.4.选择最大吸收波长及标准曲线的制作。选择最大吸收波长及标准曲线的制作。选择最大吸收波长及标准曲

38、线的制作。选择最大吸收波长及标准曲线的制作。基本操作基本操作基本操作基本操作实验步骤实验步骤实验步骤实验步骤1.1.最大吸收波长的选择及最大吸收波长的选择及最大吸收波长的选择及最大吸收波长的选择及标准曲线的制作标准曲线的制作标准曲线的制作标准曲线的制作：用吸量管分别吸取用吸量管分别吸取用吸量管分别吸取用吸量管分别吸取1.01.0、1.51.5、2.02.0、2.52.5、3.0mL5.00mg.mL3.0mL5.00mg.mL-1-1标准蛋白质溶液于标准蛋白质溶液于标准蛋白质溶液于标准蛋白质溶液于5 5只只只只10mL10mL比色管中，用比色管中，用比色管中，用比色管中，用0.9%NaCl0.

39、9%NaCl溶液稀释至刻溶液稀释至刻溶液稀释至刻溶液稀释至刻度，摇匀。用度，摇匀。用度，摇匀。用度，摇匀。用1cm1cm石英比色皿，以石英比色皿，以石英比色皿，以石英比色皿，以0.9%NaCl0.9%NaCl溶液为参比，对起哄一溶液为参比，对起哄一溶液为参比，对起哄一溶液为参比，对起哄一个试样进行波长扫描，选择最大吸收波长，在选择的最大波长处个试样进行波长扫描，选择最大吸收波长，在选择的最大波长处个试样进行波长扫描，选择最大吸收波长，在选择的最大波长处个试样进行波长扫描，选择最大吸收波长，在选择的最大波长处（一般在（一般在（一般在（一般在280nm280nm左右）处分别测定各标准溶液的吸光度左

40、右）处分别测定各标准溶液的吸光度左右）处分别测定各标准溶液的吸光度左右）处分别测定各标准溶液的吸光度A A280280，记录，记录，记录，记录所得读数。所得读数。所得读数。所得读数。2.2.样品测定样品测定样品测定样品测定：取待测蛋白质溶液取待测蛋白质溶液取待测蛋白质溶液取待测蛋白质溶液3mL3mL，按上述方法测定，按上述方法测定，按上述方法测定，按上述方法测定280nm280nm处的吸光度。处的吸光度。处的吸光度。处的吸光度。平行测定三份。平行测定三份。平行测定三份。平行测定三份。1.1.以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制吸收曲线，选择测量的最适宜以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制吸收曲

41、线，选择测量的最适宜以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制吸收曲线，选择测量的最适宜以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制吸收曲线，选择测量的最适宜波长条件（波长条件（波长条件（波长条件（计算机处理数据计算机处理数据计算机处理数据计算机处理数据）。）。）。）。2.2.以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。3.3.根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。根据样品溶液的吸

42、光度，从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。数据处理数据处理数据处理数据处理荧光分析法荧光分析法，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。特点：带光谱 分子光谱应用：定性分析-激发波长和发射波长 定量分析-（标准曲线法）荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B B2 2的含量的含量的含量的含量实验目的实验目的实验目的实验目的学习荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素学习荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生

43、素学习荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素学习荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B B2 2的分析原理。的分析原理。的分析原理。的分析原理。掌握荧光分光光度计的操作技术和测定多维葡萄掌握荧光分光光度计的操作技术和测定多维葡萄掌握荧光分光光度计的操作技术和测定多维葡萄掌握荧光分光光度计的操作技术和测定多维葡萄糖粉中维生素糖粉中维生素糖粉中维生素糖粉中维生素B B22的方法。的方法。的方法。的方法。实验原理实验原理实验原理实验原理荧光分析法荧光分析法 常常常常温温温温下下下下，处处处处于于于于基基基基态态态态的的的的分分分分子子子子吸吸吸吸收收收收一一一一定定定定的的的的紫紫紫紫外外外外可可

44、可可见见见见光光光光的的的的辐辐辐辐射射射射能能能能成成成成为为为为激激激激发发发发态态态态分分分分子子子子，激激激激发发发发态态态态分分分分子子子子通通通通过过过过无无无无辐辐辐辐射射射射跃跃跃跃迁迁迁迁至至至至第第第第一一一一激激激激发发发发态态态态的的的的最最最最低低低低振振振振动动动动能能能能级级级级，再再再再以以以以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。在稀溶液中，荧光强度在稀溶液中，荧光强度

45、在稀溶液中，荧光强度在稀溶液中，荧光强度I IF F与物质的浓度与物质的浓度与物质的浓度与物质的浓度c c有以下的关系：有以下的关系：有以下的关系：有以下的关系：当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：这是荧光光谱法定量分析的理论依据。这是荧光光谱法定量分析的理论依据。这是荧光光谱法定量分析的理论依据。这是荧光光谱法定量分析的理论依据。a.a.与紫外与紫外与紫外与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。可见分

46、光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。b.b.选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。质。质。质。c.c.所需试样量少、操作方法简便。所需试样量少、操作方法简便。所需试样量少、操作方法简便。所需试样量少、操作方法简便。荧光分析法的特点荧光分析法的特点激发光谱：固定测量波长激发光谱：固定测量波长激发光谱：固定测

47、量波长激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长选最大发射波长选最大发射波长选最大发射波长)，化合物发射的荧光强度与，化合物发射的荧光强度与，化合物发射的荧光强度与，化合物发射的荧光强度与照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。荧光强度最大。荧光强度最大。荧光强度最大。发发发发射射射射光光光光谱谱谱谱：固固固固定定定定激激激激发发发发光光光光波波波波长长长长(选选

48、选选最最最最大大大大激激激激发发发发波波波波长长长长),),化化化化合合合合物物物物发发发发射射射射的的的的荧荧荧荧光光光光强强强强度度度度与与与与发射光波长关系曲线。发射光波长关系曲线。发射光波长关系曲线。发射光波长关系曲线。固固固固定定定定发发发发射射射射光光光光波波波波长长长长进进进进行行行行激激激激发发发发光光光光波波波波长长长长扫扫扫扫描描描描，找找找找出出出出最最最最大大大大激激激激发发发发光光光光波波波波长长长长，然然然然后后后后固固固固定定定定激激激激发发发发光光光光波波波波长长长长进进进进行行行行荧荧荧荧光光光光发发发发射射射射波波波波长长长长扫扫扫扫描描描描，找找找找出出出

49、出最最最最大大大大荧荧荧荧光光光光发发发发射射射射波波波波长长长长。激激激激发发发发光光光光波波波波长长长长和和和和发射荧光波长的选择是本实验的关键。发射荧光波长的选择是本实验的关键。发射荧光波长的选择是本实验的关键。发射荧光波长的选择是本实验的关键。荧光光谱荧光光谱荧光光谱荧光光谱激发光谱激发光谱激发光谱激发光谱 发射光谱发射光谱发射光谱发射光谱 荧光分析仪器荧光分析仪器常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器

50、和显示记录器五部分构成，如下图所示：录器五部分构成，如下图所示：录器五部分构成，如下图所示：录器五部分构成，如下图所示：荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点：荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点：荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点：荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点：a.a.荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响；荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响；荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响；荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响；b.b.荧光分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较好的激发光并消除其荧光分析仪器有两个单色器，能