人类细胞质RNA的提取.ppt

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1、人类细胞质RNA提取RT-PCR的原理、方法琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用第六组人类细胞质RNA提取 真核细胞质总RNA主要由rRNA（80-85%）、tRNA和核内小分子RNA(10-15%)、mRNA（1-5%）组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于细胞质中。分离提纯分离提纯RNA的目的的目的分析不同发育时期基因的表达状况获得新基因研究基因的拼接分析相应的蛋白产物RNA的不稳定性的不稳定性 由于核糖残基的2和3位置带有羟基，RNA易于被RNA酶切割水解 RNA酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复活性，不易失活。所以需要RNA酶抑制剂来抑制RNA酶的活性。3 3、分离高质量分离高质量RN

2、ARNA RNARNA的质量决定了你能够转录到的质量决定了你能够转录到cDNAcDNA上上的序列信息量的最大值。的序列信息量的最大值。（1 1）常用的常用的RNARNA酶抑制剂酶抑制剂焦碳酸二乙酯（焦碳酸二乙酯（DEPCDEPC）：是一种强烈但不彻底的是一种强烈但不彻底的RNARNA酶抑制剂。酶抑制剂。它通过和它通过和RNARNA酶的活性基团组氨酸的咪酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。的活性。异硫氰酸胍：异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对

3、RNA酶有强烈的变性作用。氧钒核糖核苷复合物：氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。RNARNA酶的蛋白抑制剂（酶的蛋白抑制剂（RNasinRNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。其它：其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。（2 2）RNARNA提取的一般步骤提取的一般步骤RNARNA提取的一般步骤是提取的一般步骤是：破碎组织破碎组织分离分离RNARNA沉淀沉淀RNARNA洗涤洗涤RNARNA融解融解RNA

4、RNA保存保存RNARNA破碎组织和灭活破碎组织和灭活RNARNA酶可以同步进行酶可以同步进行可以用盐酸胍、硫氰酸胍、可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40NP-40、SDSSDS、蛋白、蛋白酶酶K K等破碎组织等破碎组织 加入加入-ME-ME可以抑制可以抑制RNARNA酶活性酶活性分离分离RNARNA一半用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊半用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，醇，经过此步，离心，RNARNA一般分布于上层，一般分布于上层，与蛋白层分开。与蛋白层分开。沉淀沉淀RNARNA一般用乙醇、一般用乙醇、3M NaAc3M NaAc（pH-5.2pH-5.2）或异丙醇。）或

5、异丙醇。洗涤洗涤RNARNA使用使用7070乙醇洗涤，有时，为避免乙醇洗涤，有时，为避免RNARNA被洗掉，被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。融解融解RNARNA一般使用一般使用TETE。保存保存RNARNA应该尽量低温。为了防止痕量应该尽量低温。为了防止痕量RNaseRNase的污染，从的污染，从富含富含RNaseRNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNARNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNARN

6、A，对于，对于长期贮存长期贮存也应该也应该如此。如此。由于RNA的种类来源很多，因而提取制备方法各异。本次介绍的是Trizol法制备RNA。Trizol法提取RNA TRIzol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因此对纯化RNA及标准化RNA的生产十分有用。Trizol试剂主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8羟基喹啉、异硫氰酸胍、-

7、巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。Trizol试剂裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离,加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇以沉淀的方式还原。在除去水样层后，乙醇能沉淀析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。【试剂】DEPC(焦碳酸二乙酯),氯仿，异丙醇，无水乙醇，0.050.1DEPCH2O，75乙醇，TE缓冲液，琼脂糖。【配制】1.DEPC水：1ml1000ml双蒸水1 DEPC水，1000ml容量瓶中静置4小时。2.75%乙醇：无水乙醇+DEPC水，-20保存（DEPC水需先

8、高压）实验用品基本过程 一、抽提 二、分相 三、RNA沉淀 四、RNA清洗一、抽提细胞抽提1.组织取材后用灭菌的锡箔纸包好保存于液氮。实验时，在液氮中将组织研磨成粉末，趁液氮未挥发将粉末转移到EP管，室温5000rpm离心去上清。每50-100mg组织，加入1ml Trizol，反复抽吸均匀。二、分相3.在装有裂解物的离心管中加入0.2ml的氯仿(为Trizol总体积的1/5),振荡 混匀30秒，室温下静置5分钟.4.12000 rpm离心15分钟4C,分相为三层。上层：RNA(约为Trizol的 60%)；中间：DNA；下层:蛋白质(酚-氯仿)。5.小心吸取上清液，转移到另一EP管中。1ml

9、裂解物产生的上清液体积 约为0.40.6 ml。有机相和中间层含有DNA和蛋白质,避免触及。三、RNA沉淀6.上清液加入约0.5ml的异丙醇,振荡30秒混匀。室温下静置10分钟。7.4C，离心12000rpm 10分钟。8.RNA沉淀将在离心底的侧面形成。小心吸弃上清液,注意避免吸弃RNA 沉淀。四、RNA清洗9.离心管加入1ml 预冷的75%乙醇(1mlTrizol至少用1ml乙醇清洗DNA),振荡混匀30秒，使沉淀振荡起来，室温离心12000rpm12分钟。尽可能吸弃上清液,防止RNA沉淀丢失。重复以上清洗步骤一次。在75%乙醇中，RNA在4至少可以保存1周，20至少可以保存1年。10.室

10、温选择流动性小，倒置离心管于滤纸上，干燥RNA，但不能完全干燥(510分钟)。用DEPC水15l溶解沉淀，55-60孵育1015分钟。11.测量OD值后，样品放置70保存，一个月RT-PCR RT-PCR：逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。应用 RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。oligo:o

11、ligo:多聚体，相当于多聚体，相当于mRNAmRNA引物引物AMV RTAMV RT：禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶：禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶MMLV RTMMLV RT：莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶：莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶dNTPsdNTPs：脱氧核苷酸：脱氧核苷酸RNaseRNase：RNARNA水解酶水解酶PCR BufferPCR Buffer：RT-PCRRT-PCR缓冲液缓冲液MgCl2MgCl2：2 2价镁离子价镁离子基本过程 由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶即逆转录酶来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖D

12、NA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互补DNA。RT-PCR的关键步骤是在RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avian myeloblastosis virus,AMV）反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒（moloney murine leukemia virus,MMLV）反转录酶。琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳主要是应用琼脂糖凝胶作为支持物的电泳法，借助琼脂糖凝胶的分子筛作用，核酸片段因其分子量或者分子形状的不同，电泳速度有差异而分离，这种技术是基因操作中常用的一种方法。与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。PCR产物在琼脂糖凝胶上的电泳检测 在基因组DNA的提取中，用蒸馏水溶解提取出的DNA，在1.0%的琼脂糖胶进行电泳，以Marker(分子质量标准)作为参照，用5V/cm的电泳30-60分钟，最后采用EB溶液进行染色后在凝胶成像系统中进行观察拍照。结果初步分析数量分析：条带的宽度，荧光的亮度。质量分析：纯度 分子量