免疫组化和荧光.ppt
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1、 制作者:白慧2014-3-211免疫组化图片 2014-3-212免疫荧光图片 2014-3-213免疫组化与免疫荧光 免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素等)显色来确定组织细胞内抗原,对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法;用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法;这两种方法总称免疫荧光技术,因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合,用于检测或定位各种抗原,也可以与其他蛋白质结合,用于检测或定位抗体,但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用,所以人们习惯称为荧光抗
2、体技术,或称为免疫荧光技术。2014-3-214实验原理 免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性,所以当抗原抗体发生反应时,只要知道其中的一个因素,就可以查出另一个因素。免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记的显色剂 显色来确定组织细胞内抗原;免疫荧光技术是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体(或抗原)上,与其相应的抗原(或抗体)结合后,在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。2014-3-215实验步骤脱蜡水化:二甲苯 20min二甲苯 20min无水乙醇 10min无水乙醇 10min95%乙醇 5min80%乙醇 5min75%乙醇 5
3、min50%乙醇 过一遍蒸馏水 过三遍高压修复 4min流水冷却PBS冲洗 5min3次3%H2O2 15 min,37/(0.5%Triton 5min)PBS冲洗 5min3次10%山羊血清封闭 37,50min一抗 4 ,过夜复温 37 ,1h PBS 冲洗 5 min x3 次 二抗 30 min PBS 冲洗 5 min x3 次DAB显色 1min/(DAPI 5min)PBS冲洗 (盖片,观察。)苏木素复染 1min自来水冲洗脱水,透明,封片。2014-3-216 抗原修复抗原修复原因原因*常规的石蜡切片标本均用甲醛固定,结果使得:常规的石蜡切片标本均用甲醛固定,结果使得:-抗原
4、性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇;抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇;-蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。*要求:在染色时,需要先进行抗原修复或暴露,即将固定时要求:在染色时,需要先进行抗原修复或暴露,即将固定时分子之间所形成的交联破坏,而恢复抗原的原有空间形态。分子之间所形成的交联破坏,而恢复抗原的原有空间形态。方法:微波修复法,高压加热法,酶消化法,水煮加热法等,方法:微波修复法,高压加热法,酶消化法,水煮加热法等,常用的修复液是常用的修复液是pH6.0的的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。的柠檬酸盐缓冲液。2014-
5、3-217注意事项标本固定脱水、石蜡包埋和制片 脱蜡和水化 抗原修复 细胞通透 灭活内源性过氧化物酶和生物素 血清封闭一抗和二抗浓度和孵育时间 抗体稀释液 切片清洗 DAB显色避光 复染封片 防止标本从玻片上脱落;除去妨碍抗原-抗体结合的类脂,使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果;固定的标本易于保存。固定剂的选择一般用4%多聚甲醛脱水用梯度乙醇(由低到高)充分脱水、对组织要完全浸蜡、切片时刀片要干净和锋利。否则,容易裂片和脱片等。为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全,而产生非特异性背景着色。由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中
6、,发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用,从而失去抗原性;通过抗原修复,使得细胞内抗原决定族重新暴露,提高抗原检测率。使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。如Triton X-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内,故在细胞免疫组化时尤为推荐使用,这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。灭活内源性POD一般3%过氧化氢灭活时间短点,可以10min左右,而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间,一般1030min;过氧化氢孵育时间过长易引起脱片 组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合,造成后续
7、结果的假阳性;封闭血清一般是和二抗同一来源的,血清中动物自身的抗体,预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合;但不能与一抗来源一致。一般室温10-30min。一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要,包括孵育时间、温度和抗体浓度。一抗孵育温度有:4、室温、37,其中4效果最佳;孵育时间:这与温度、抗体浓度有关,一般371-2h,而4过夜和从冰箱拿出后37复温45min较好。二抗一般室温或3730min-1h。抗体稀释液用一般PBS即可,但专用的抗体稀释液中除PBS外,还加了叠氮化钠防腐剂、BSA稳定剂等组份,对抗体的多次回收利用较好。正因为这种原因,抗体稀释液的PH值可能偏酸,而使抗原抗体反应不佳,终
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