生物大分子的分离纯化和鉴定演示教学.ppt
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1、生物大分子的分离纯化和鉴定蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化 依据蛋白质在溶液中的性质不同(溶解度、电荷、相依据蛋白质在溶液中的性质不同(溶解度、电荷、相对分子质量的大小,特异亲和力等)确立的蛋白质和酶的分对分子质量的大小,特异亲和力等)确立的蛋白质和酶的分离方法离方法.其性质包括其性质包括:。(1 1 1 1)利用溶解度差别的分离方法)利用溶解度差别的分离方法)利用溶解度差别的分离方法)利用溶解度差别的分离方法1 1 1 1、等电点沉淀:、等电点沉淀:、等电点沉淀:、等电点沉淀:蛋白质在等电点时溶解度最小。当蛋白质混合液的蛋白质在等电点时溶解度最小。当蛋白质混合液的PHPH值值被调到其中某一种
2、成分的被调到其中某一种成分的PIPI时,该种成分蛋白质将会沉淀时,该种成分蛋白质将会沉淀下来,这种沉淀出来的蛋白质保持着天然构象(活性)能下来,这种沉淀出来的蛋白质保持着天然构象(活性)能再溶解。高于或低于该再溶解。高于或低于该PIPI的蛋白质留在溶液。的蛋白质留在溶液。如:如:GluGlu的生产也是利用此性质进行的,的生产也是利用此性质进行的,Glu PI 3.22Glu PI 3.22。2 2 2 2、盐析、盐析、盐析、盐析 高浓度的盐(常用硫酸铵)可以降低蛋白质的溶解度。因高浓度的盐(常用硫酸铵)可以降低蛋白质的溶解度。因为高浓度盐争夺了蛋白质分子的水膜层,降低了环境中水的相为高浓度盐争
3、夺了蛋白质分子的水膜层,降低了环境中水的相对浓度,还中和了蛋白质表面的电荷。不同蛋白质因所带电荷对浓度,还中和了蛋白质表面的电荷。不同蛋白质因所带电荷和水化程度不同而在不同的盐浓度下分别沉淀出来。盐的饱和和水化程度不同而在不同的盐浓度下分别沉淀出来。盐的饱和度由低到高逐次增加,如血清中加入度由低到高逐次增加,如血清中加入50%50%饱和度的饱和度的(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4可使可使球蛋白析出,加入球蛋白析出,加入100%100%饱和度饱和度(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4可使清蛋白析出,达到可使清蛋白析出,达到分级分离的目的分级分离的目的.盐析后必须脱盐。盐析后必须脱盐。
4、盐析后必须脱盐。盐析后必须脱盐。脱盐最常见的方法是透析法,也可以用凝胶层析(葡聚糖凝脱盐最常见的方法是透析法,也可以用凝胶层析(葡聚糖凝胶胶SephadexG25SephadexG25脱盐)、超过滤技术脱盐。盐析通常与等电点沉脱盐)、超过滤技术脱盐。盐析通常与等电点沉淀法相结合使用。脱盐是否彻底,要经常进行检查。如除去淀法相结合使用。脱盐是否彻底,要经常进行检查。如除去(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4可用可用10%BaCl10%BaCl2 2检查;除去检查;除去NaClNaCl可用可用10%AgNO10%AgNO3 3检查,直到检查,直到透析液中检测不出透析液中检测不出BaSOBaSO
5、4 4或或AgClAgCl为止,透析完成。为止,透析完成。3 3、有机溶剂分级法、有机溶剂分级法 有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变介质的介电常数,水是高介电常数(20时,80),有机溶剂是低介电常数物质(20时,甲醇33,乙醇24,丙酮21.4),因此有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低。这样,蛋白质分子表面的可解离基团的离子化程度减弱,水化程度降低,因此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能与盐析相似,与蛋白质争夺水化(膜)水,致使蛋白质聚集体的形成并沉淀。有机溶剂沉淀法一般与等电点沉淀法联合使用。即操作时溶液的pH值应控制在欲分离蛋白质的等电点附近
6、。(二)根据分子大小不同的分离方法:1 1、透析和超过滤:即利用蛋白质分子不能通、透析和超过滤:即利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质,使蛋白质和其他小分子物质过半透膜的性质,使蛋白质和其他小分子物质(如无机盐、单糖、水)等分开。(如无机盐、单糖、水)等分开。2 2、密度梯度(区带)离心:、密度梯度(区带)离心:蛋白质颗粒在具有密度梯度介质中离心时,每种蛋白质蛋白质颗粒在具有密度梯度介质中离心时,每种蛋白质颗粒降到与自身密度相近的密度梯度时停止不前,各种蛋颗粒降到与自身密度相近的密度梯度时停止不前,各种蛋白质被分离成各自独立的区带。白质被分离成各自独立的区带。3 3、凝胶过滤(分子筛层析)、凝胶
7、过滤(分子筛层析)根据分子大小来分离蛋白质混合物的最有效的方法之根据分子大小来分离蛋白质混合物的最有效的方法之一。当分子大小不同的混和样品通过装填有高度水化的惰一。当分子大小不同的混和样品通过装填有高度水化的惰性多聚体(葡聚糖凝胶性多聚体(葡聚糖凝胶SephadexSephadex和琼脂糖凝胶和琼脂糖凝胶SepharoseSepharose)的层析柱时,比凝胶的层析柱时,比凝胶“网眼网眼”大的蛋白质分子不能进入大的蛋白质分子不能进入“网眼网眼”而被排阻在凝胶颗粒之外,比而被排阻在凝胶颗粒之外,比“网眼网眼”小的分子则进入凝小的分子则进入凝胶胶颗粒的内部。这样,由于不同大小的分子所经历的路程不颗
8、粒的内部。这样,由于不同大小的分子所经历的路程不同而得以分离,大分子先洗下来,小分子后洗下来。同而得以分离,大分子先洗下来,小分子后洗下来。(三)根据电荷不同的分离方法:(三)根据电荷不同的分离方法:(三)根据电荷不同的分离方法:(三)根据电荷不同的分离方法:1 1、电泳电泳 2 2、离子交换层析离子交换层析(四)根据特异亲和力不同的分离方法(四)根据特异亲和力不同的分离方法(四)根据特异亲和力不同的分离方法(四)根据特异亲和力不同的分离方法亲和层析亲和层析亲和层析亲和层析层析技术 层析又称色谱法:利用混合物中各组分的物理层析又称色谱法:利用混合物中各组分的物理化学性质(分子的形状和大小,分子
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- 生物 大分子 分离 纯化 鉴定 演示 教学
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