生物技术综合实验(二)概要复习过程.ppt

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1、生物技术综合实验(二)概要一、超氧化物歧化酶一、超氧化物歧化酶简称：SOD.是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。它们以铜和锌、或锰、铁、或镍作为辅因子超氧化物歧化酶的来源超氧化物歧化酶的来源有很多途径，可以根据当地的原料超氧化物歧化酶的来源有很多途径，可以根据当地的原料来源，成本需求，技术要求来选取不同的提取途径。来源，成本需求，技术要求来选取不同的提取途径。其中根据不同的分类有以下几个途径获取该酶。其中根据不同的分类有以下几个途径获取该酶。1、植物提取、植物提取2、动物提取、动物提取3、微生物的生产发酵、微生物的

2、生产发酵4、人工合成、人工合成发展历史超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase,EC1.15.1.1,SOD）是）是1938年年Marn等人首次从牛红血等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起，人们对球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起，人们对SOD的的研究己有七十多年的历史。研究己有七十多年的历史。1969年年McCord等重新发现等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以正式将其命名为过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。超氧化物

3、歧化酶。超氧化物歧化酶的作用机理超氧化物歧化酶的作用机理氧气在有机体内代谢还原，提供了生物能量，氧气在有机体内代谢还原，提供了生物能量，最后生成水，共接受最后生成水，共接受4个电子。在这还原过程个电子。在这还原过程中，每接受一个电子就生成一个氧自由基或活中，每接受一个电子就生成一个氧自由基或活性氧。但氧自由基，能引起细胞损伤，导致疾性氧。但氧自由基，能引起细胞损伤，导致疾病发生。病发生。O2+eO2O2+2e+2H+H2O2O2+3e+3H+H2O+OHO2+4e+4H+2H2O而而SOD是体内专一清除超氧阴离子自由基的一是体内专一清除超氧阴离子自由基的一个抗氧化酶。个抗氧化酶。SOD的催化过

4、程如下：的催化过程如下：O2-+O2-+2H+H2O2+O2SOD将将O2-歧化生成双氧水。国内外对歧化生成双氧水。国内外对SOD的的毒性进行了广泛的研究，大量资料表明毒性进行了广泛的研究，大量资料表明SOD无无毒、无副作用。毒、无副作用。二、二、SOD用途及前景用途及前景1 1、抗氧化、抗氧化2 2、抗衰老、抗衰老3 3、预防慢性病及其并发症、预防慢性病及其并发症4 4、抗疲劳、抗疲劳5 5、化疗副作用的消除剂、化疗副作用的消除剂6 6、避免手术的二次伤害、避免手术的二次伤害手术会引起大量自由基，故建议手术前后口服手术会引起大量自由基，故建议手术前后口服抗氧化剂来迅速恢复体力加速伤口复原。抗

5、氧化剂来迅速恢复体力加速伤口复原。超氧化物歧化酶的应用 健康上的应用健康上的应用 SOD SOD是人体内最主要的抗氧化物质，是氧自由基的克星和是人体内最主要的抗氧化物质，是氧自由基的克星和专一清除剂；它清除人体内一些自由基。它保护细胞对抗专一清除剂；它清除人体内一些自由基。它保护细胞对抗毒性，调节毒性，调节H H2 2O O2 2的浓度，对付微生物的侵害，并且增强抗的浓度，对付微生物的侵害，并且增强抗氧化酶的活性，迅速清除过剩的自由基，保持身体健康，氧化酶的活性，迅速清除过剩的自由基，保持身体健康，体力充沛，面容体态年轻。全球体力充沛，面容体态年轻。全球118118位科学家发表联合声位科学家发

6、表联合声明：自由基是百病之源，明：自由基是百病之源，SODSOD是健康之本。体内的是健康之本。体内的SODSOD活性活性越高，寿命就越长。越高，寿命就越长。药物类药物类主要集中在炎症病患者，尤其治疗类风湿关节炎、慢性多发主要集中在炎症病患者，尤其治疗类风湿关节炎、慢性多发性关节炎、心肌梗塞、心血管病、肿瘤患者以及放射性治疗性关节炎、心肌梗塞、心血管病、肿瘤患者以及放射性治疗炎症病患者；炎症病患者；用于生化制药用于生化制药作为一种生化酶制剂，广泛应用于临床和科研上，具有极强作为一种生化酶制剂，广泛应用于临床和科研上，具有极强的抗衰老，抗肿瘤、的抗衰老，抗肿瘤、调节人体内分泌系统作用；调节人体内分

7、泌系统作用；用于化妆品类用于化妆品类可添加在化妆品中，具有抗氧化抗腐蚀的优良性能。有减少皱纹、祛斑的功效以 SOD为主要成份的产品风靡世界，引发了化 妆品历史上的一场革命，使人类永葆青春美丽梦想成真；用作保健食品、饮料用作保健食品、饮料如SOD糖、SOD口服液、SOD干啤等都非常畅销!在饮料、糖果、糕点等食品中加入SOD既可利用其抗腐蚀性延长保质期，又可调节人体内分泌系统总之，超氧化物歧化酶可以清除体内过量的自由总之，超氧化物歧化酶可以清除体内过量的自由基，提高人体免疫力，延缓衰老；有效降低血脂、基，提高人体免疫力，延缓衰老；有效降低血脂、胆固醇、血压；胆固醇、血压；抗疲劳，增强肝肾功能；抗辐

8、抗疲劳，增强肝肾功能；抗辐射；对糖尿病有明显的恢复作用；调节女性生理射；对糖尿病有明显的恢复作用；调节女性生理周期，推迟更年期周期，推迟更年期。应用前景SOD是一种新型的抗炎症药是一种新型的抗炎症药,尤其对关节炎和类风湿关节尤其对关节炎和类风湿关节炎有明显疗效炎有明显疗效,根据根据SOD作用机制和毒性试验作用机制和毒性试验,它对治疗因它对治疗因O2引起的各种疾病都有一定的疗效引起的各种疾病都有一定的疗效。为此为此,SOD可作为抗可作为抗衰老、抗炎症、自身免疫疾病患者广泛应用的医药品。此衰老、抗炎症、自身免疫疾病患者广泛应用的医药品。此外外,SOD对治疗贝切特氏症、心肌梗塞等血虚性心脏病、对治疗

9、贝切特氏症、心肌梗塞等血虚性心脏病、胶原病、新生儿呼吸困难综合症、防御放射性伤害等也可胶原病、新生儿呼吸困难综合症、防御放射性伤害等也可望有效。近年来美望有效。近年来美、日、德、英国等对、日、德、英国等对SOD作为药品开发作为药品开发应用进行了一系列研究和临床试验并得到广泛应用。应用进行了一系列研究和临床试验并得到广泛应用。可以预言可以预言,随着人们对随着人们对SOD更广泛深入的研究更广泛深入的研究,不不同类型同类型SOD、SOD修饰物及人工有机合成修饰物及人工有机合成SOD模拟酶将在医疗、保健、食品、农业增产等方面模拟酶将在医疗、保健、食品、农业增产等方面发挥出更大的作用发挥出更大的作用.三

10、、三、SOD提取方法提取方法实验部分实验部分(P40-70）一、基本内容：一、基本内容：1.1.细胞破碎及酶的抽提。细胞破碎及酶的抽提。2.2.两种蛋白质含量测定方法及酶的活力测定。；两种蛋白质含量测定方法及酶的活力测定。；3.3.离子交换柱分离操作及分析。离子交换柱分离操作及分析。4.4.SDS-PAGESDS-PAGE电泳测定蛋白质分子量。电泳测定蛋白质分子量。5.5.固定化酶的制备技术。固定化酶的制备技术。6.6.酶的柱层析分离操作，包括装柱，恒流泵及部分收酶的柱层析分离操作，包括装柱，恒流泵及部分收集器的试调，上样，洗脱等。集器的试调，上样，洗脱等。7 7.IEFIEF测蛋白质测蛋白质

11、PIPI；1.1.8 8.PODPOD同工酶分析；同工酶分析；9.9.细胞器的分离及其标志物（酶）的测定细胞器的分离及其标志物（酶）的测定 二二.目的要求目的要求 学学习习提提取取分分离离纯纯化化超超氧氧化化物物歧歧化化酶酶的的方方法法，掌掌握握酶酶分分离离纯纯化化的的基基本本操操作作技术。包括以下内容：技术。包括以下内容：1 1细胞破碎及酶的抽提；细胞破碎及酶的抽提；2 2酶的柱层析分离操作；酶的柱层析分离操作；3 3酶的活力测定。酶的活力测定。三三.基本原理基本原理 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD,EC1.15.1.1)是一是一种歧化超氧负离子

12、自由基种歧化超氧负离子自由基O2生成生成H2O2和和O2的金属蛋白，为胞内酶，的金属蛋白，为胞内酶，在生物体内具有延缓机体衰老，对肿瘤在生物体内具有延缓机体衰老，对肿瘤、自身自身免疫性疾病和辐射损伤具有重要的防御作用，免疫性疾病和辐射损伤具有重要的防御作用，是一种重要的药用酶。根据所含的金属离子，是一种重要的药用酶。根据所含的金属离子，SOD可分为三类：可分为三类：Cu、ZnSOD、MnSOD和和FeSOD。SOD在生物界中分布极广，原核在生物界中分布极广，原核生物和真核生物中都有存在。生物和真核生物中都有存在。本本实实验验从从血血中中提提取取SOD，提提取取液液经经葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶柱柱上

13、上层层析析，分分离离出出SOD，然然后后用用邻邻苯苯三三酚酚法法测测定定其其酶酶活活力力。邻邻苯苯三三酚酚在在自自氧氧化化过过程程中中产产生生有有色色中中间间物物（红红桔桔酚酚）和和O2-,使使溶溶液液颜颜色色变变褐褐加加深深。加加入入SOD能能歧歧化化O2-阻阻止止中中间间物物（红红桔桔酚酚）的的积积累累，通通过过分分光光光光度度计计比比色色分分析析反反应应液液的的颜颜色色而而测测定定其酶活力。其酶活力。超氧化物歧化酶的工艺流程动物血液材料中制备超氧化物歧化酶分离纯化工艺分为三个主要步骤：原材料的预处理原材料的预处理乙醇乙醇-氯仿除去血红蛋白氯仿除去血红蛋白粗酶粗酶液的制备液的制备有机溶剂沉

14、淀有机溶剂沉淀 离子交换离子交换柱层析精制柱层析精制 SODSOD成品成品原材料的预处理原材料的预处理材料材料材料试剂：材料试剂：3.8%柠檬酸柠檬酸三钠，三钠，0.9%氯化钠，氯化钠，95%乙醇，氯仿，牛乙醇，氯仿，牛血。血。器材：恒温水浴，离心机，器材：恒温水浴，离心机，布氏漏斗，抽虑瓶，布氏漏斗，抽虑瓶，烧杯，量筒，搅棒烧杯，量筒，搅棒实验步骤实验步骤收集：取新鲜牛血，加入到收集：取新鲜牛血，加入到3.8%柠柠檬酸三钠液中，新鲜猪血与抗凝檬酸三钠液中，新鲜猪血与抗凝液的比例为液的比例为3:1,轻轻搅拌均匀，轻轻搅拌均匀，4000r/min,离心离心20min,收集红细收集红细胞。胞。浮选

15、：红细胞用浮选：红细胞用3倍体积生理盐水洗倍体积生理盐水洗涤，涤，4000r/min离心离心20min,重复重复3次。次。溶血：向洗净的红细胞加入溶血：向洗净的红细胞加入11.1倍倍体积去离子水，在体积去离子水，在5下搅拌下搅拌30min,得到溶血物。得到溶血物。注意：注意：收集完新鲜血液后，应尽快加抗凝剂收集完新鲜血液后，应尽快加抗凝剂去除血红蛋白过程中，搅拌要均匀去除血红蛋白过程中，搅拌要均匀去血红蛋白去血红蛋白向溶血液中分别缓慢加入向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷倍体积的预冷95%乙醇和乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，静置左右，

16、静置1h,然后然后4000r/min离心离心20min，除去变性血红蛋白沉淀，取清夜，过，除去变性血红蛋白沉淀，取清夜，过滤，收集滤液滤，收集滤液。1.1.热变性热变性 原材料的预处理中获得的上清液加热原材料的预处理中获得的上清液加热到到6565，保温，保温10min10min，然后迅速冷却到室温，然后迅速冷却到室温，3000r/min3000r/min离心离心20min20min，弃去沉淀物，收集上，弃去沉淀物，收集上清液。清液。2.2.沉淀沉淀 清夜在冰浴中冷却，然后在清夜在冰浴中冷却，然后在-5-5一下一下的操作温度下，加入的操作温度下，加入1.51.5倍量预冷丙酮，边倍量预冷丙酮，边加

17、边搅拌均匀，即有白色沉淀产生，静置加边搅拌均匀，即有白色沉淀产生，静置23min23min，迅速抽滤，弃去滤液得肉色沉淀。，迅速抽滤，弃去滤液得肉色沉淀。沉淀物用少量蒸馏水溶解，沉淀物用少量蒸馏水溶解，4000r/min4000r/min离心离心20min20min，除去不溶物，用，除去不溶物，用pH7.6pH7.6的的2.5mmol/LK2HPO4-KH2PO42.5mmol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲液透析，即得缓冲液透析，即得粗粗SODSOD溶液溶液注意迅速冷却至注意迅速冷却至室温室温沉淀过程保持沉淀过程保持低温哦低温哦三材料器具三材料器具 1.1.材料：动物新鲜血液；材料：动物新

18、鲜血液；SephadexG75凝胶。凝胶。2.2.仪仪器器：高高速速组组织织捣捣碎碎机机；高高速速冷冷冻冻离离心心机机；层层析析柱柱（140cm）；自自动动部部分分收收集集器器；恒恒流流泵泵；进进样样器器和微量进样器；可见和微量进样器；可见/紫外分光光度计。紫外分光光度计。3.3.试试剂剂：（1 1）pH7.8,5mmol/L磷磷酸酸缓缓冲冲液液（内内含含1mmol/LEDTA）；（2 2）考考马马斯斯亮亮蓝蓝溶溶液液：称称取取100mg考考马马斯斯亮亮蓝蓝G250于于50ml95%乙乙醇醇中中，摇摇动动，待待溶溶解解后后，加加入入100ml85%磷磷酸酸，反反复复震震动动后后加加蒸蒸馏馏水水

19、定定容容至至1000ml,过过滤滤待待用用；（3 3）pH8.2,50mmol/LTris-HCl缓缓冲冲液液；（4 4）5050mmol/L邻邻苯苯三酚溶液；三酚溶液；（5 5）10mmol/LHCl溶液溶液4.试剂的配法试剂的配法（1 1）pH8.2pH8.2、50mmol/LTris-HCl 50mmol/LTris-HCl 称取称取Tris0.61gTris0.61g，EDTA-2Na0.037gEDTA-2Na0.037g，用双蒸水溶解至用双蒸水溶解至80mL80mL左右，用左右，用HClHCl调节调节pH=8.20pH=8.20（用（用pHpH计校正），最后定容至计校正），最后定容

20、至100mL100mL。（2 2）10mmol/LHCl 10mmol/LHCl（3 3）50mmol/L50mmol/L邻苯三酚邻苯三酚 称取邻苯三酚称取邻苯三酚0.063g0.063g，用，用10mmol/LHCl10mmol/LHCl溶液溶液溶解，定容至溶解，定容至10mL10mL，避光保存。，避光保存。（4 4）SODSOD样液样液 四四.实验操作实验操作(一一)SOD的提取的提取1.取取新鲜血液新鲜血液,冷水浸泡冷水浸泡24h,24h,沥干，加冰冻的沥干，加冰冻的pH7.8,5mmol/L磷酸缓冲液适量，用高速磷酸缓冲液适量，用高速组织捣碎机捣碎。组织捣碎机捣碎。2.2.用高速冷冻离

21、心机以用高速冷冻离心机以8000rpm离心除去固离心除去固型物（需型物（需45次，每次次，每次15min）,上清液即上清液即SOD酶液。酶液。（二）（二）SOD的凝胶层析分离纯化的凝胶层析分离纯化 1.凝胶的准备：凝胶的准备：（1）称取称取SephadexG75干凝胶干凝胶2g，加适量洗脱液沸水浴溶胀，加适量洗脱液沸水浴溶胀2小时（也可室温小时（也可室温溶胀溶胀24小时）。小时）。（2）用倾斜法倾去表面悬浮的细小颗粒，室温储存于磷酸缓冲液中备用。）用倾斜法倾去表面悬浮的细小颗粒，室温储存于磷酸缓冲液中备用。2 2装柱：装柱：（1 1）将层析柱竖直固定于支架上）将层析柱竖直固定于支架上,连接好恒

22、流泵、部连接好恒流泵、部分收集器分收集器,调节洗脱液的操作压调节洗脱液的操作压60cm。（2）先向层析柱中加入）先向层析柱中加入1/3高度的高度的pH7.8,5mmol/L磷磷酸缓冲液酸缓冲液,然后用大口进样器吸取上述准备好的凝胶徐然后用大口进样器吸取上述准备好的凝胶徐徐注入柱中缓冲液内徐注入柱中缓冲液内,让其自然沉降，沉降好的柱床顶让其自然沉降，沉降好的柱床顶部离管口部离管口12cm为宜。若高度不够，可放去部分缓冲为宜。若高度不够，可放去部分缓冲液，搅起管中凝胶界面，继续添加凝胶。液，搅起管中凝胶界面，继续添加凝胶。（3）装毕，用）装毕，用23个床体积的洗脱液洗脱，以使床柱个床体积的洗脱液洗

23、脱，以使床柱稳定。稳定。3 3上样：上样：（1 1）放去床表面上的缓冲液至与凝胶界面平齐。）放去床表面上的缓冲液至与凝胶界面平齐。（2 2）用用进进样样器器吸吸取取酶酶液液0.5ml，加加样样时时将将进进样样器器尖尖端端接接触触柱柱内内壁壁并并在在离离床床表表面面数数毫毫米米处处随随加加随随沿沿内内壁壁转转动动一一周周，使使样样品品尽尽快快分分布布于于全全表表面面。然然后后打打开开恒恒流流泵泵，待待样样品品液液面面与与床床柱柱表表面面平平齐齐时时，关关闭闭恒恒流流泵泵，以以少少许许（0.10.11ml）缓缓冲冲液液冲冲洗洗内内壁壁数数次次，在在打打开开恒恒流流泵泵，放放至至液液面面与与床床柱柱

24、表表面面平齐。平齐。（3 3）先先用用进进样样器器加加1cm高高度度的的缓缓冲冲液液覆覆盖盖样样品品，然然后后加加足缓冲液，连接好进液管。足缓冲液，连接好进液管。4洗脱：洗脱：开启部分收集器和恒流泵，以开启部分收集器和恒流泵，以pH7.8,5mmol/L磷酸缓冲液进行洗脱。调节流速，控制磷酸缓冲液进行洗脱。调节流速，控制每管收集洗脱液每管收集洗脱液1ml，每管按收集顺序做好标记。，每管按收集顺序做好标记。5 5洗脱液酶蛋白含量的测定：洗脱液酶蛋白含量的测定：（1 1）取取洁洁净净试试管管数数支支，分分别别加加入入考考马马斯斯亮亮蓝蓝溶溶液液3ml,摇摇匀匀，将将其其中中一一支支试试管管不不加加

25、任任何何试试液液作作为为对对照照管管，其其余余的的分分别别加加入入从从第第五五收收集集管管起起的的洗洗脱脱收收集集液液50l,反反复复摇匀。摇匀。（2 2）以对照管为调零液，用）以对照管为调零液，用1cm比色杯在比色杯在595nm波长波长下测定各管的下测定各管的OD595nm值。值。（3 3）合合并并OD595nm值值高高的的原原收收集集液液，此此即即纯纯化化的的SOD酶液。保留测酶活力。酶液。保留测酶活力。（4）测定完毕，先用乙醇洗去比色杯的颜色，再用）测定完毕，先用乙醇洗去比色杯的颜色，再用蒸馏水荡洗，用擦镜纸拭干水珠，倒扣在培养皿内。蒸馏水荡洗，用擦镜纸拭干水珠，倒扣在培养皿内。（5）清

26、理干净工作台，在仪器使用登记本上登记使）清理干净工作台，在仪器使用登记本上登记使用情况。用情况。（三）（三）SOD酶活力测定酶活力测定在一般情况下，在一般情况下，SOD活性测定只能应用活性测定只能应用间接活性间接活性测定法测定法。其测定其测定方法很多，常见的有方法很多，常见的有化学法化学法、免疫法、免疫法和等电点聚焦法。其中化学法应用最普遍，化学法的和等电点聚焦法。其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和色中间物和O2-，利用，利用SOD分解而间接推算酶活力。分解而间接推算酶活力。在化学方法中，最常用的

27、有黄嘌呤氧化酶法，邻在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，还原法，光化学扩增法，光化学扩增法，Cyte还原法等。其中改良的邻苯三酚还原法等。其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。本实验采用自氧化法简单易行较为实用。本实验采用邻苯三酚自邻苯三酚自氧化方法氧化方法。邻苯三酚自氧化法邻苯三酚自氧化法原理原理：邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-（超氧阴离子自由基），生成带色的中间产物（红桔（超氧阴离子自由基），生成带色的中间产物（红桔酚），反应开始后反应

28、液先变成黄棕色，酚），反应开始后反应液先变成黄棕色，几分钟几分钟后转后转绿，绿，几小时几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。本实验中测定的是邻苯三酚自氧化不断氧化的结果。本实验中测定的是邻苯三酚自氧化过程中的过程中的初始阶段初始阶段，中间物的积累在滞留，中间物的积累在滞留3045s后，后，与时间成与时间成线性关系线性关系，一般线性时间维持在，一般线性时间维持在4min的范围的范围内，中间物在内，中间物在325nm波长出有强烈光吸收。当有波长出有强烈光吸收。当有SOD存在时，由于它能催化存在时，由于它能催化O2-与与H+结合生成结合生成O2

29、和和H2O2，从而阻止了中间有色产物的积累，导致吸光值下降因从而阻止了中间有色产物的积累，导致吸光值下降因此，通过测定它们在特定波长下得光吸收变化速率计此，通过测定它们在特定波长下得光吸收变化速率计算出算出SOD的酶活性的酶活性。邻苯三酚 O2-+红桔酚（自氧化：有色物质积累，吸光值增加）（自氧化：有色物质积累，吸光值增加）O2-+O2-+2H+H202+O2（SOD催化：阻止中间产物积累，吸光值降低）催化：阻止中间产物积累，吸光值降低）pH=8.2SOD实验步骤：实验步骤：1 1测测定定邻邻苯苯三三酚酚溶溶液液自自氧氧化化速率速率：取取两两支支试试管管按按右右表表加加入入25预预热热过过的的

30、缓缓冲冲液液,然然后后加加入入预预热热过过的的邻邻苯苯三三酚酚（空空白白管管用用10mmol/LHCl代代替替邻邻苯苯三三酚酚），迅迅速速摇摇匀匀，立立即即倾倾入入1cm比比色色杯杯中中，在在325nm波波长长处处测测定定光光吸吸收收值值，每每隔隔30s读读数数一一次次，测测定定4min内内每每分分钟钟光光吸吸收收值值的的变变化化。要要求求自自氧氧化化速速率率控控制制在在每每分分钟钟的的光光吸吸收收值值为为0.070士0.002（可可增增减减邻邻苯苯三三酚酚的的加加入入量量，以以控控制光吸收值）。制光吸收值）。试剂试剂空白管空白管（mL）自氧化自氧化管管（mL）pH8.2、50mmol/LTr

31、is-HCl4.54.510mmol/L HCl0.01 45 mmol/L邻苯三酚邻苯三酚0.012.2.SOD样液活力测定：样液活力测定：样样品品管管取取代代自自氧氧化化管管。样样品品管管测测定定时时先先加加入入预预热热的的待待测测酶酶液液，在在25水水浴浴锅锅中中保保温温10min，再再加加入入预预热热的的邻邻苯三酚。其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定苯三酚。其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定。试剂试剂空白管空白管（mL）样品管（样品管（mL）pH8.2 50mmol/LTris-HCl 4.5 4.510mmol/L HCl 0.015 SOD样酶样酶 0.00545 mmol/L邻苯

32、三酚邻苯三酚 0.013.数据处理数据处理 3.1 3.1 加入加入SODSOD酶前后邻苯三酚自氧化速率的计算酶前后邻苯三酚自氧化速率的计算 时间时间30s60s90s120s150s180s210s自氧化自氧化大豆提取液大豆提取液SOD标准品标准品3.2 3.2 SOD酶活力计算：酶活力计算：(酶活力单位定义酶活力单位定义:在一定条件下在一定条件下,每每1mL反应液中每反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定义为一时的酶量定义为一个活力单位。个活力单位。)SDS-PAGE技术及原理技术及原理酶固定化技术酶固定化技术酶固定化技术酶固定化技术邻苯三酚的自

33、氧化曲线邻苯三酚的自氧化曲线(25 pH8.2Tris-HCL缓冲液4.5mL 45mL邻苯三酚溶液0.01mL)BackSOD酶对邻苯三酚自氧化的抑制酶对邻苯三酚自氧化的抑制酶活力测定曲线酶活力测定曲线Back清清场场1.各组将实验台清理好，实验用具各组将实验台清理好，实验用具清洗干净，恢复实验开始时的状清洗干净，恢复实验开始时的状态。态。2.派人清扫实验室。派人清扫实验室。色谱法色谱法纯化超氧化物歧化酶纯化超氧化物歧化酶 操作步骤操作步骤 1 1、DEAE-DEAE-纤维素的预处理：纤维素的预处理：DEAE-纤维素2 2、装柱、装柱 （1 1）层析柱用洗涤液洗清洁，柱）层析柱用洗涤液洗清洁

34、，柱的下端联接塑料管，装上螺旋夹。的下端联接塑料管，装上螺旋夹。关上螺旋夹，柱内装入缓冲液关上螺旋夹，柱内装入缓冲液I I，微开螺旋夹。让缓冲液缓慢流出，微开螺旋夹。让缓冲液缓慢流出，赶走死区及塑料管中的气泡，柱赶走死区及塑料管中的气泡，柱中保留少量缓冲液，关闭螺旋夹。中保留少量缓冲液，关闭螺旋夹。（2 2）将基本平衡好的）将基本平衡好的DEAE-DEAE-纤维素纤维素浆液（约有浆液（约有1 1倍体积的缓冲液倍体积的缓冲液I I）放在抽滤瓶中减压除尽气泡，然放在抽滤瓶中减压除尽气泡，然后沿管壁倒人柱中，待沉降至床后沿管壁倒人柱中，待沉降至床高约高约1cm1cm高度时，部分旋松螺旋夹，高度时，部

35、分旋松螺旋夹，让溶液缓慢流出去，注意此时的让溶液缓慢流出去，注意此时的流速要比正常洗脱时的流速慢，流速要比正常洗脱时的流速慢，陆续加入较多的浆液，直至达到陆续加入较多的浆液，直至达到高高10cm10cm以上的柱床体积。以上的柱床体积。层析柱3、平衡平衡 当全部交换剂装入柱中后，用上柱起始当全部交换剂装入柱中后，用上柱起始缓缓 冲液进行平衡。流速可维持在冲液进行平衡。流速可维持在4mL/15min4mL/15min，直至流出液的，直至流出液的pHpH与上柱缓冲液与上柱缓冲液完全相同。（一般要平衡完全相同。（一般要平衡8h8h以上或过夜。）以上或过夜。）4、层析 用毛细吸管小心吸去交换剂上面大部分

36、液体，打开出口使缓冲液恰流到表面，关闭出口。用毛细吸管小心地沿柱壁四周缓缓加入SOD粗酶液，打开出口，使样品溶液进入纤维素内，至几乎露出床面时，柱壁用少量缓冲液小心洗涤23次，然后装入缓冲液，使液面高出创面23 cm左右。5、洗脱、洗脱（1）按图）按图8-9将梯度洗脱器和将梯度洗脱器和层析柱连接好。层析柱连接好。（2）在洗脱瓶）在洗脱瓶A（贮存器）和（贮存器）和洗脱瓶洗脱瓶B（混合器）内各装入（混合器）内各装入100mL缓冲液缓冲液和缓冲液和缓冲液，注，注意两洗脱瓶，特别是液面应处于意两洗脱瓶，特别是液面应处于同一水平面，同时应排除连接管同一水平面，同时应排除连接管内气泡。内气泡。（3）开动电

37、磁搅拌器开关，调）开动电磁搅拌器开关，调节搅拌速度，以混合器内缓冲液节搅拌速度，以混合器内缓冲液旋转而无明显旋涡为宜。旋转而无明显旋涡为宜。（4）将两瓶和柱上下连接管道）将两瓶和柱上下连接管道打开，开始收集洗脱流出液，控打开，开始收集洗脱流出液，控制流速在制流速在1.5mLmin。收集液收集液测定蛋白质浓度和酶活性。测定蛋白质浓度和酶活性。（5）收集合并具有）收集合并具有SOD活性部活性部分的洗脱液，透析浓缩后冷冻干分的洗脱液，透析浓缩后冷冻干燥即得纯化燥即得纯化SOD（淡蓝绿色产品）（淡蓝绿色产品）。1.SOD等电点的测定（一）SOD等电点的测定（1）取同样规格的试管4支，加入各试剂，然后混

38、匀。此时 4个管的pH依次为5.9、5.5、4.7、3.5。（2）各加SOD的醋酸钠溶液1mL，加一管，摇匀一管。观察其混浊度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一管pH即为酪蛋白的等电点。（二）蛋白质的沉淀及变性1、蛋白质的盐析 蛋白质的盐析:无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。盐溶:由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。于试管中加入蛋白质溶液5mL，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。

39、倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？将管内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止。此时析出沉淀为清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。点样点样加样加样样品迁样品迁移方向移方向电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。混合样品混合样品带孔胶带孔胶 按分子按分子大小分离大小分离电泳方向电泳方向 电泳电泳 小分子小分子大分子大分子此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢