生物药物的分离纯化教学提纲.ppt

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1、生物药物的分离纯化5.5.糖类药物的分离纯化方法糖类药物的分离纯化方法6.6.脂类药物的分离纯化方法脂类药物的分离纯化方法7.7.氨基酸类药物的分离纯化方法氨基酸类药物的分离纯化方法1.1 1.1 生物药物原料的选择生物药物原料的选择生物药物生产原料的选择原则主要是：(1)有有效效成成分分含含量量高高，原原料料新新鲜鲜；(2)原原料料来来源源丰丰富富，易易得得，原原料料产产地地较较近近；(3)原原料料中中杂杂质质含含量量少少；(4)原原料料成成本本低低等等。但是，同时具备这4种有利因素的原料不多，生产研究者可酌情选择，但第一条是最重要的。原原料料的的选选择择还还要要注注意意如如下下事事项项：植

2、植物物原原料料要要注注意意植植物物生生长长的的季季节节性性，选选择择最最佳佳采采集集时时间间；微微生生物物原原料料要要注注意意微微生生物物生生长长的的对对数数期期长长短短；动动物物原原料料有有的的要要注注意意动动物物的的类类别别、年龄年龄与与性别性别。也应注意原料的也应注意原料的采集地采集地和和批次批次。1.2 1.2 原料的预处理与保存原料的预处理与保存 动动物物原原料料采采集集后后要要立立即即处处理理，去去除除结结缔缔组组织织、脂脂肪肪组组织织等等，并并迅迅速速冷冷冻冻贮贮存存；植植物物原原料料确确定定后后，要要择择时时采采集集并并就就地地除除去去没没有有用用的的部部分分，将将有有用用部部

3、分分保保鲜鲜处处理理；收收集集微微生生物物原原料料时时，要要及及时时将将菌菌体体细细胞胞与与培培养养液液分开，进行保鲜处理。分开，进行保鲜处理。原原料料的的保保存存方方法法主主要要有有：冷冷冻冻法法。该该方方法法适适用用于于所所有有生生物物原原料料。常常用用-40-40速速冻冻。有有机机溶溶剂剂脱脱水水法法。常常用用的的有有机机溶溶剂剂是是丙丙酮酮。该该法法适适用用于于原原料料少少而而价价值值高高、有有机机溶溶剂剂对对活活性性物物质质没没有有破破坏坏作作用用的的原原料料，如如脑脑垂垂体体等等。防防腐腐剂剂保保鲜鲜。常常用用乙乙醇醇、苯苯酚酚等等。该该法法适适用用于于液液体体原原料料，如发酵液、

4、提取液等。如发酵液、提取液等。2.2.生物药物的提取生物药物的提取(1)(1)生物组织与细胞的破碎生物组织与细胞的破碎 (2)(2)生物组织细胞破碎后立即进行提取生物组织细胞破碎后立即进行提取生物组织与细胞的破碎生物组织与细胞的破碎 生生物物药药物物大大部部分分存存在在于于生生物物组组织织或或细细胞胞中中，要要提提高高提提取取率率，对对生生物物组组织织与与细细胞胞的的破破碎碎过程是非常重要的过程是非常重要的。常用的破碎方法有5种：A.A.磨磨切切法法，该该法法属属于于机机械械破破碎碎方方法法，使使用用的的设设备备有有组组织织捣捣碎碎机机、胶胶体体磨磨、匀匀浆浆器器、匀质机、球磨机、乳钵等。匀质

5、机、球磨机、乳钵等。B.B.压压力力法法，这这类类方方法法有有加加压压与与减减压压两两种种，常用的常用的法兰西压釜法兰西压釜使用效果良好。使用效果良好。C.反反复复冻冻融融法法，该方法设备简便，活性保持好，但用时较长。D.超超声声波波振振荡荡破破碎碎法法，该方法破碎效果较好，但由于局部发热，对活性有损失。E.自溶法或酶解法自溶法或酶解法，用得较少。生生物物组组织织活活性性物物质质的的提提取取要要在在细细胞胞破破碎碎后后立即进行。立即进行。提取过程中提取过程中（1 1）要要根根据据活活性性物物质质的的性性质质，选选择择提提取取试试剂剂。提提取取试试剂剂主主要要有有：水水、缓缓冲冲溶溶液液、盐盐溶

6、溶液液、乙乙醇醇、其其他他有有机机溶溶剂剂(如如氯氯仿仿、丙丙酮等酮等)。（2 2）考考虑虑提提取取溶溶剂剂的的用用量量（料料液液比比）及及提取次数、提取时间。提取次数、提取时间。（3 3）注注意意提提取取的的温温度度、pHpH、变变性性剂剂等等因因素素。这这样样才才可可以以保保证证活活性性物物质质提提取取充充分而且不变性。分而且不变性。3.3.蛋白质类药物的分离纯化方法蛋白质类药物的分离纯化方法蛋蛋白白质质类类药药物物主主要要包包括括蛋蛋白白质质、多多肽肽和和酶酶类等药物。它们的分离纯化方法有：类等药物。它们的分离纯化方法有：(1)(1)沉淀法沉淀法(2)(2)按按分子大小分离分子大小分离的

7、方法的方法(3)(3)按按分子所带电荷分子所带电荷进行分离的方法进行分离的方法(4)(4)亲和层析法亲和层析法(1)(1)沉淀法沉淀法 蛋蛋白白质质、酶酶的的初初步步纯纯化化往往往往用用沉沉淀淀法法。该该法法的的原原理理是是使使蛋蛋白白质质胶胶体体颗颗粒粒破破坏坏，从从而而沉沉淀淀蛋蛋白白质质。常常用用的的有有盐盐析析法法、有有机机溶溶剂剂沉沉淀淀法法、等等电电点点沉沉淀淀法法、与与靶靶物物质质结结合合沉沉淀法淀法(如抗体一抗原如抗体一抗原)等。等。(2)(2)按分子大小分离的方法按分子大小分离的方法 这这类类方方法法有有超超滤滤法法和和透透析析法法(即即膜膜分分离离方方法法)、凝凝胶胶层层析

8、析法法、超超速速离离心心法法等等。其其中中膜膜分分离离法法可可用用于于生生物物大大分分子子物物质质的的浓浓缩缩、分分级级和和脱盐。脱盐。(3)(3)按分子所带电荷进行分离的方法按分子所带电荷进行分离的方法 氨氨基基酸酸、多多肽肽、蛋蛋白白质质、酶酶均均为为两两性性电电解解质质。它它们们具具有有等等电电点点，在在离离开开等等电电点点的的pHpH时时便便会会带带正正或或负负电电荷荷。例例如如某某蛋蛋白白质质等等电电点点为为7.07.0，当当溶溶液液pHpH为为4.04.0时时，分分子子则则带带有有正正电电荷荷。由由于于具具有有该该性性质质，利利用用带带电电性性质质进行分离是极其有效的方法。进行分离

9、是极其有效的方法。利用蛋白质带电性质行分离的方法有：利用蛋白质带电性质行分离的方法有：离子交换柱层析法离子交换柱层析法；电泳法电泳法；等电聚焦法等电聚焦法。（4 4）亲和层析法）亲和层析法 大大部部分分生生物物活活性性物物质质都都有有其其作作用用的的靶靶物物质质，如如酶酶与与底底物物(或或抑抑制制剂剂)、抗抗原原与与抗抗体体、激激素素与与受受体体等等，它它们们之之间间有有特特异异的的亲亲合合作作用用，利利用用该该性性质质设设计计的的特特异异层层析析分分离离技技术术称称为为亲亲和和层层析析。亲亲和和层层析析分分离离专专一一性性强强，操操作作简便，是当前应用很广泛的分离方法之一。简便，是当前应用很

10、广泛的分离方法之一。亲亲和和层层析析法法主主要要包包括括：疏疏水水反反应应层层析析、金金属属螯螯合合层层析析、免免疫疫亲亲和和层层析析、共共价价亲亲和和层层析析、固固定定化化染染料料亲亲和和层层析析、特特殊殊基基团团亲亲和和层层析析等等。亲亲和和层层析析技技术术大大量量应应用用于于蛋蛋白白质质分离和纯化。分离和纯化。4.4.核酸类药物的分离纯化方法核酸类药物的分离纯化方法核核酸酸类类药药物物生生产产方方法法主主要要有有提提取取法法和和发发酵酵法法。提提取取法法生生产产DNADNA和和RNARNA的的主主要要技技术术是是，先先提提取取核核酸酸和和蛋蛋白白质质复复合合物物，再再解解离离核核酸酸与与

11、蛋白质，然后分离蛋白质，然后分离RNARNA与与DNADNA。发酵法发酵法主要用于生产单核苷酸。主要用于生产单核苷酸。5 5糖类药物的分离纯化方法糖类药物的分离纯化方法由由于于各各种种糖糖类类药药物物的的性性质质和和原原料料来来源源不不同同，没没有有统统一一规规范范的的提提取取和和纯纯化化工工艺艺。这这里里只只介绍介绍多糖多糖和和粘多糖粘多糖的一般分离纯化方法。的一般分离纯化方法。提取方法提取方法 非非降降解解法法：适适用用于于从从含含一一种种粘粘多多糖糖的的动动物物组组织织中中提提取取粘粘多多糖糖，提提取取采采用用的的溶溶剂剂是是水水或或盐盐溶液。溶液。降降解解法法：适适用用于于从从组组织织

12、中中提提取取结结合合比比较较牢牢固固的的粘粘多多糖糖。例例如如从从软软骨骨中中分分离离提提取取硫硫酸酸软软骨骨素素，就就是是用用碱碱处处理理进进行行降降解解，又又如如用用酶处理法可提取与蛋白质结合的多糖。酶处理法可提取与蛋白质结合的多糖。(2)(2)分离方法分离方法常常用用的的分分离离纯纯化化多多糖糖的的方方法法是是乙乙醇醇沉沉淀淀法法和和离子交换层析法离子交换层析法。乙乙醇醇沉沉淀淀法法是是从从提提取取液液中中沉沉淀淀多多糖糖的的最最简简易易方方法法，也也适适用用于于分分级级分分离离。用用4 45 5倍倍体体积积的的乙乙醇醇可可以以使使任任何何结结缔缔组组织织中中的的粘粘多多糖糖完完全全沉沉

13、淀。淀。季季铵铵化化合合物物也也可可用用于于沉沉淀淀粘粘多多糖糖,其其原原理理是是粘粘多多糖糖的的聚聚阴阴离离子子能能与与某某些些阳阳离离子子表表面面活活性性剂剂结结合合成成不不溶溶于于水水的的盐盐，如如十十六六烷烷基基三三甲甲基基铵铵(CTA)(CTA)等。等。离离子子交交换换层层析析法法：粘粘多多糖糖的的聚聚阴阴离离子子能能够够很很好好地地被被阴阴离离子子交交换换剂剂吸吸附附和和分分离离，如如Dowex-I-X2Dowex-I-X2离离子子交交换换树树脂脂、DEAE-DEAE-离离子子交交换换纤纤维维素素*等等。洗洗脱脱可可用用NaClNaCl溶溶液液进进行行梯度洗脱。梯度洗脱。注注意意从

14、从粗粗多多糖糖中中除除去去蛋蛋白白常常用用的的方方法法有有：SevagSevag法法、三氯乙酸法三氯乙酸法和和蛋白酶解法蛋白酶解法。*二乙氨基乙基纤维素二乙氨基乙基纤维素6.6.脂类药物的分离纯化方法脂类药物的分离纯化方法(1)(1)提提取取方方法法 脂脂类类自自然然状状态态下下是是以以结结合合形形式式存存在在的的。非非极极性性脂脂是是与与其其他他脂脂质质分分子子或或蛋蛋白白质质分分子子的的疏疏水水区区相相结结合合的的。因因此此，提提取取脂脂质质药药物物就就是是要要选选择择适适当当的的溶溶剂剂来来破破坏坏这这种种结结合合键键，将将脂脂质质溶溶解解出出来来。常常用用的的溶溶剂剂有有组组合合溶溶剂

15、剂，醇醇是是其其中中的的主主要要成成分分，此此外还有氯仿、甲醇、水等。外还有氯仿、甲醇、水等。(2)(2)纯化方法纯化方法沉沉淀淀法法：由由于于不不同同脂脂质质在在丙丙酮酮中中溶溶解解度度不同，故常用它进行沉淀。不同，故常用它进行沉淀。吸吸附附层层析析法法：常常用用吸吸附附剂剂有有硅硅胶胶、氧氧化化铝铝等等。它它是是通通过过极极性性和和离离子子键键力力等等把把各各种种化化合合物物结结合合到到固固体体吸吸附附剂剂上上。一一般般是是采采用用极极性性逐逐渐渐增增大大的的洗洗脱脱液液来来进进行行，非非极性组分先流出，极性组分后流出。极性组分先流出，极性组分后流出。离离子子交交换换层层析析法法：脂脂质质

16、分分子子的的存存在在有有非非解解离离和和酸酸式式解解离离两两种种状状态态。根根据据它它们们在在一一定定pHpH条条件件下下的的解解离离情情况况，选选择择适适当当的的离离子子交交换换剂剂可可将将它它们们提提纯纯。如如TEAE-TEAE-纤纤维维素素*对分离脂肪酸和胆汁酸等特别有效。对分离脂肪酸和胆汁酸等特别有效。三乙氨基乙基纤维素三乙氨基乙基纤维素7.7.氨基酸类药物的分离纯化方法氨基酸类药物的分离纯化方法氨基酸的生产方法：氨基酸的生产方法：蛋白质水解法蛋白质水解法 发酵法发酵法化学合成与酶促合成法化学合成与酶促合成法 蛋蛋白白质质水水解解法法：水水解解法法有有酸酸水水解解、碱碱水水解解和和酶酶

17、水水解解三三种种。用用盐盐酸酸水水解解为为常常用用方方法法，其其优优点点是是水水解解迅迅速速、完完全全，产产物物全全部部是是L-L-型型氨氨基基酸酸，缺缺点点是是色色氨氨酸酸全全部部被被破破坏坏，丝丝氨氨酸酸等等部部分分被被破破坏坏。碱碱水水解解法法易易产产生生消消旋旋作作用用，较较少少应应用用。酶酶水水解解法法水解不够完全。水解不够完全。发发酵酵法法：发发酵酵法法主主要要是是选选育育特特异异产产生生某某种种氨氨基基酸酸的的菌菌株株，经经过过发发酵酵后后，从从培培养养液中提纯氨基酸。液中提纯氨基酸。化化学学合合成成与与酶酶促促合合成成法法：化化学学合合成成法法一一般般得得到到的的是是D/L-D

18、/L-型型氨氨基基酸酸，需需要要对对这这些些异异构构体体拆拆分分；酶酶促促合合成成法法也也是是酶酶工工程程在在医医药药工工业业上上应应用用的的一一个个内内容容，优优点点是是技技术术工工艺艺简简单，转化率高，副产物少和易提纯等。单，转化率高，副产物少和易提纯等。氨基酸的分离方法：氨基酸的分离方法：沉淀法沉淀法吸附法吸附法离子交换法离子交换法 沉沉淀淀法法：根根据据形形成成沉沉淀淀的的原原理理不不同同分分为为两两种种：一一种种是是依依据据不不同同氨氨基基酸酸在在水水中中或或其其他他溶溶剂剂中中的的溶溶解解度度差差异异进进行行沉沉淀淀分分离离。另另一一是是用用特特殊殊试试剂剂沉沉淀淀某某种种氨氨基基

19、酸酸，如如用用邻邻二二甲甲苯苯-4-4-磺磺酸酸与与亮亮氨氨酸酸形形成成不不溶溶性性盐盐沉沉淀淀，再再用用氨氨水水分分解解，使使亮亮氨氨酸酸游游离离出来。出来。吸吸附附法法：这这是是利利用用吸吸附附剂剂根根据据氨氨基基酸酸吸吸附附力力的的差差异异进进行行氨氨基基酸酸分分离离的的方方法法。苯苯丙丙氨氨酸酸、酪酪氨氨酸酸、色色氨氨酸酸的的分分离离就就是是利利用活性炭对其吸附的原理。用活性炭对其吸附的原理。离离子子交交换换法法：氨氨基基酸酸是是两两性性电电解解质质，在在一一定定pHpH条条件件下下，不不同同氨氨基基酸酸带带电电性性质质及及解解离离状状态态是是不不相相同同的的，因因此此在在离离子子交交

20、换换剂剂上上被被吸吸附附的的强强度度不不同同。常常用用的的离离子子交交换换剂剂为为强强酸酸型型阳阳离离子子交交换换树树脂脂，洗洗脱脱主主要用要用pHpH梯度洗脱。梯度洗脱。高效分离纯化系统的采用高效分离纯化系统的采用 主要是蛋白质分离（1 1）固相化金属亲和层析）固相化金属亲和层析(IMAC)(IMAC)IMACIMAC是是近近十十年年来来发发展展起起来来的的一一种种亲亲和和层层析析技技术术。其其原原理理是是利利用用蛋蛋白白质质分分子子中中的的咪咪唑唑基基和和巯巯基基与与一一些些金金属属元元素素(Cu(Cu2+2+、ZnZn2+2+等等)配配位位结结合合，使使蛋蛋白白质质得得到到分分离离纯纯化

21、化。该该法法比比传传统统的的凝凝胶胶过过滤滤一一离离子子交交换换法法简简单单、省省时时，适适于于实验室规模纯化。实验室规模纯化。（2 2）超扩散层析）超扩散层析 这这种种层层析析所所用用介介质质是是BiosepraBiosepra公公司司生生产产的的Hyper-DHyper-D。该该层层析析介介质质的的颗颗粒粒由由刚刚性性框框架架结结构构中中填填充充官官能能化化的的软软凝凝胶胶组组成成。它它兼兼备备了了软软凝凝胶胶的的高高上上样样量量和和普普通通刚刚性性介介质质的的高高流速流速。这这种种结结构构可可使使层层析析操操作作在在高高流流速速下下进进行行而而保保证证高高上上样样量量和和高高分分辨辨率率

22、，并并且且无无反反压压产产生生。Hyper-DHyper-D具具有有化化学学隋隋性性。可可用用酸酸碱碱进进行行再再生生和和杀杀菌菌，可可用用于于纯纯化化免免疫疫球球蛋蛋白白、白白蛋蛋白白、激激素素、酶酶、细细胞胞培培养养或或发发酵酵产产生生的的蛋蛋白白质质。适适用用于于实实验验室室小小试试直直至至工工业业化化大生产。大生产。(3)(3)灌注层析灌注层析 19871987年年由由RegnierRegnier等等人人发发明明的的灌灌注注填填料料技技术术使使快快速速分分离离纯纯化化生生物物大大分分子子得得以以实实现现。19891989年年与与之之相相配配套套的的灌灌注注系系统统(BioCAD(Bio

23、CAD workstation)workstation)问问世世，给给微微生生物物制制药药领领域域的的科科学学家家提提供供了了强强有有力力的的工工具具，给给生生物物制制药药业带来了突破性的进展。业带来了突破性的进展。它它所所采采用用的的POROUSPOROUS介介质质以以苯苯乙乙烯烯基基二二乙乙烯烯基基苯苯的的聚聚合合物物构构成成，为为双双模模式式孔孔结结构构，在在介介质质上上有有8080150nm150nm的的扩扩散散孔孔和和600600800nm800nm的的贯贯穿穿孔孔。它它允允许许液液体体对对流流到到分分离离介介质质的的内内表表面面，从从而而大大大大加加快快了了分分离离速速度度。灌灌注

24、注层层析析系系统统可可有有效效、快快速速地地纯纯化化各各种种蛋蛋白质、多肽、核酸等生物大分子。白质、多肽、核酸等生物大分子。它它比比传传统统柱柱快快l0l0100100倍倍，分分析析一一个个样样品品只只需需要要0.50.53min3min。日日本本制制药药公公司司OtsukaOtsuka使使用用博博大大生生物物技技术术公公司司的的POROS-50POROS-50介介质质和和大大生生产产规规模模系系统统(autopilot)(autopilot)生生产产单单克克隆隆抗抗体体，从从320L320L样样品品中中纯纯化化出出13g13g抗抗体体只只花花了了80min80min，收率，收率9595。(4

25、)(4)其他快速分离纯化系统其他快速分离纯化系统 streamlinestreamline扩扩张张柱柱床床吸吸附附技技术术：已已广广泛泛应应用用于于E Ecolicoli如如包包涵涵体体、胞胞内内、细细胞胞膜膜、胞胞外外分分泌泌和和酵酵母母、动动物物、杂杂交交瘤瘤细细胞胞、昆昆虫虫细细胞胞等等表表达达的的重重组组蛋蛋白白的的纯纯化化，也也被被用用于单抗及天然酶的纯化。于单抗及天然酶的纯化。AKTA AKTA explorerexplorer快快速速纯纯化化开开拓拓系系统统：能能高高效效地地纯纯化化各各种种蛋蛋白白质质、肽肽、寡寡核核苷苷酸酸和和核核酸酸等等。系系统统有有预预编编程程序序，放放好

26、好样样品品，按按启启动动按按钮钮，系系统统就就会会完完成成余余下下的的工工作作，如如自自动动取取样样、制制备备适适当当pHpH缓缓冲冲液液、选选择择适适当当的的柱柱、再再现现显显示示分分离离流流程程和和检检测测状状况况、收收集集峰峰、自自动动进进行行数数据据处处理理并并打打印印纯纯化化报报告告。设设置置的的预预编编程程序序可可从从分分析析到到小小试试摸摸索索至至中中试生产。试生产。快快速速蛋蛋白白液液相相色色谱谱(FPLC)(FPLC)：已已用用于于蛋蛋白白质质、多多肽肽、核核酸酸等等400400余余种种生生物物分分子子的的纯纯化化。利利用用FPLCFPLC发发展展的的纯纯化化流流程程可可直直接接放放大大到到中中试或大规模生产。试或大规模生产。biological biological systemsystem：它它视视为为高高分分辨辨生生物物分分子子纯纯化化而而设设计计的的层层析析系系统统。其其软软件件充充分分利利用用了了微微软软视视窗窗操操作作系系统统的的优优良良图图形形界界面面，加加速速了了开开发发和和优优化化生生物物分分子子分分离离流流程程的方案。的方案。谢谢！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢