分子标记技术及其在植物育种中的应用 基因工程在观赏类植物育种中的应用.docx

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1、分子标记技术及其在植物育种中的应用 基因工程在观赏类植物育种中的应用 摘要：概述各种常用分子标记技术RFLP，RAPD，AFLP，SSR，ISSR，SCAR，STS，CAPs的原理，并从种质资源的鉴别、基因定位、基因累加、异源目的基因的筛选、遗传图谱的构建等方面综述了分子标记技术在植物育种中的应用。 关键词：分子标记；植物育种 中图分类号：TS202.3文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)10-0043-04 Molecular Marker Technology and Its Application in Plant Breeding XU Li-fang1,Chen J

2、i-yan2,LUO Guang-ming1* (1. Department of Chinese Materia Medica, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330006, China; 2. Department of Pharmacy, Yunyang MedicalCollege, Shiyan 442000, China) Abstract：The principals of several commonly used molecular markers including RFLP, RA

3、PD, AFLP, SSR,ISSR, SCAR, STS and CAPs, are introduced and the applications of molecular markers in plant breeding are summarized from the aspects of varieties identification, gene localization, gene accumulation, selection of foreign gene, construction of genetic map. Key words：molecular marker; pl

4、ant breeding 近年，随着生物技术的快速发展，分子标记技术在诸多领域得到应用，尤以农业、医药业、畜牧业等行业应用得最多。目前，分子标记种类较多，用于植物育种的主要有 RFLP，RAPD，AFLP，SSR，ISSR，SCAR，STS，CAPs。现分别介绍其原理及在植物育种上的应用。 1分子标记的原理 1.1限制性内切酶片段长度多态性（restriction frag-ment length polymorphism，RFLP，简称限制片段长度多态性） RFLP是以分子杂交技术为基础的标记技术，其原理是碱基的突变、缺失、重排或是一段DNA的重排或插入，导致限制性内切核苷酸酶的酶切位点分布

5、发生变更，得到的切割片段在数量和长度上不同，从而产生多态性。用限制性内切酶切割基因得到不同片段，然后经琼脂糖凝胶电泳分别，印迹到尼龙膜或硝酸纤维膜上，再用DNA探针与同源序列杂交，经放射自显影或酶学检测。RFLP的优点是检测到的等位基因具有共显性，能区分纯合子和杂合子，能稳定遗传。 1.2随机扩增多态性DNA（random amplification polymorphism DNA，RAPD） RAPD以DNA聚合酶链式反应（PCR）为基础，它的引物是一段随意寡聚脱氧核糖核苷酸单链片段（长度通常为810 bp），在基因组DNA上随机引物都有特定的结合位点区域。一旦此区域的碱基突变或是DNA插

6、序、重排、缺失，均会引起结合位点分布的改变，从而引起PCR扩增产物在数量和长度上不同，产生多态性。加入随机引物，进行PCR扩增，得到长度不同的DNA片段，然后用凝胶电泳分别扩增片段，经染色显示相应区域内DNA的多态性。由于运用多个引物，多态性的检测可以扩大到整个基因组，因此RAPD可用于构建基因指纹图谱。它的优点是所需样品少，对DNA质量要求不高，成本相对较低，一套引物可用于分析不同的生物基因组，操作简洁，检测速度快。 1.3扩增片段长度多态性（amplification fragment length polymorphism，AFLP） AFLP是通过限制性内切酶切割DNA产生不同长度的D

7、NA片段来检测DNA的多态性。其原理是用限制性内切核苷酸酶酶切DNA，在DNA片段的两端加上带有特定序列的“接头”，然后用与接头互补的3-端带有几个随机选择的核苷酸引物进行特异PCR扩增。只有与3-端严格配对的DNA片段才能扩增。3-端的核苷酸序列确定了DNA片段的特异性。最终用高辨别率测序凝胶将扩增产物分别，用放射性自显影或银染法检测。其优点是信息量大。 1.4简洁序列重复（simple sequence repeat，SSR） SSR又称微卫星DNA，是由16个核苷酸基序串联重复组成的DNA序列。常见的是二核苷酸重复序列如（AT）n、（TG）n，这种序列广泛分布在基因组的不同位置，其重复单

8、位具有高度的可变性，其多态性来源于重复数量的不同。在不同个体中，重复序列出现的频率不同，造成了个体之间的多态性。基因组中某一特定的微卫星DNA的侧翼序列通常是保守的单一序列，通过测定侧翼序列，依据其互补序列设计引物，通过PCR扩增微卫星片段。由于核心序列重复数量不同，从而扩增出不同长度的DNA片段。最终将扩增产物进行聚丙酰胺凝胶电泳。 在SSR基础上发展起来一种简洁序列间区重复多态性（inter-simple sequence repeat polymorphismISSR）标记，是用两个相邻SSR区间的引物去扩增单拷贝序列，然后通过电泳检测。引物是由23个核苷酸作为基元，以不同重复次数再加几

9、个非重复的锚定碱基组成的随机引物，如（AC）nX、（TG）nX。它避开了SSR种间的特异性，且开发费用低、精度高，目前用于遗传作图、品种鉴定、遗传分化等领域。 1.5序列特异性扩增区域（sequence characterized amplification region，SCAR） SCAR是在RAPD技术的基础上发展起来的特异序列扩增区域标记。其原理是对基因作RAPD分析后，选取目的DNA片段克隆，对其末端测序，依据末段序列设计引物。以此引物对DNA再进行特异PCR扩增，可以鉴别与原RAPD片段相对应的单一位点。由于引物较长，具有重复性和稳定性，主要用于基因定位及遗传作图。 1.6序列标签

10、位点（sequence-tagged sites，STS） STS是用特异性引物进行PCR扩增的一类分子标记的统称。依据RFLP探针两端序列，设计合成引物进行PCR扩增，故又称为RFLP-PCR。其优点是检测到的基因是共显性遗传，还可以在不同组合的遗传图谱间进行标记比较应用。 1.7酶切扩增多态性序列（cleaved amplification polymorphism sequence tagged sites，CAPs） CAPs实质上是PCR技术与RFLP技术相结合的一种方法。PCR 引物是针对特定位点设计的，依据已知位点DNA序列资源设计的PCR 引物对特异位点的某一DNA 片段扩增，

11、接着用专一性很强的限制性内切酶切割扩增产物。经凝胶电泳、分别、染色视察其多态性。 2分子标记在植物育种上的特点 分子标记育种（molecular mark-assist selection，MAS）是借助分子标记在DNA 水平上对遗传资源或育种材料进行选择，对作物产量、品质和抗性等综合性状进行高效改良，并针对目标性状基因连锁进行优良植株筛选1，是现代分子生物学与传统遗传育种相结合的新品种选育方法，包括利用分子标记鉴定筛选优异种质，对目的基因定位，转移聚合目的基因、构建基因连锁图谱，分析遗传多样性，筛选目标性状基因等内容。 与传统育种相比分子标记的优势是：（1）传统育种通过性状间接筛选目的基因，

12、分子标记则通过干脆与目的基因连锁进行筛选，因此，后者比前者精确，特殊是在一些表现型与基因型之间对应关系较差时的筛选；（2）传统育种须要在成熟期才能筛选，分子标记筛选则可以不受植物生长发育期的限制，在苗期就可以筛选，而且不影响植株生长；（3）传统方法一次只能标记一个基因，分子标记筛选则可以同时筛选多个目的性状基因；（4）分子标记筛选利用了限制单一性状的多个等位基因，避开了传统育种通过表现型而获得不纯植株的缺陷；（5）分子标记筛选样品用量少，可以进行非破坏性筛选，从而加速育种进程，提高育种效率。 3分子标记在植物育种中的应用 3.1种质资源的鉴定 分子标记能较好地区分种内变异及亚种。俞法明等2在对

13、早籼稻浙106与近缘系的遗传鉴别方法中，用SSR分析DNA扩增产物。他们从采纳的31对引物中选出13对作为最终扩增引物，每对扩增产物平均为23条DNA条带，共得到30条扩增产物。他们证明用SSR分子标记结合形态标记对浙106和近缘系间进行品种鉴别较为合适。Tams等3用AFLP标记评价了欧洲冬黑小麦种质资源的多样性。 3.2基因定位 基因定位就是确定基因在染色体上的位置及与之相连锁的分子标记。蒲宗君等4在对小麦材料PI31抗条锈性鉴定及其抗性基因SSR标记中，采纳分组分析法（BSA）筛选到1个位于1BS（spelta染色体）的SSR标记WMS112193bp片段与Yr2XU（抗条锈病基因）紧密

14、连锁,将Yr2XU定位于小麦1BS上；对F2分别群体142个单株分析结果表明，Yr2XU与WMS112193 bp的遗传距离为2.1 cM，可将此标记用于小麦抗条锈病分子标记协助育种。Hittalmani等5通过分子标记将稻瘟病的3个抗性基因（Pil，Piz-5，Pita）分别定位在了水稻的第11，6，12号染色体上。 Murakami等6揭示了与修复雄性不孕染色体msml和msm2的基因Rfml连锁的3个AFLP标记e34m2，e46m19和e49m17，最近的连锁标记e34m2的遗传距离是1.0 cM，e46m19遗传距离是1.1 cM。这3个AFLP标记在选育含Rfml基因的植株中精确、

15、快速。Minamiyama等7基于胡椒无辣味是被隐性基因c限制，采纳RAPD技术合并分组分析法得到了2个RAPD标记OPD20-800和OPYO9-800，这两者之中连锁更为紧密的标记OPYO9-800转化成共显性CAPs，这个标记与c位点连锁在F2代中遗传距离为3.6 cM。这个标记在盲交和子代测交中有助于传统育种选择含c基因的植株。李磊等8在用SSR构建陆地棉分子遗传图谱中，首次把N1211标记定位在A01染色体上,将N1187标记定位在D08染色体上。 3.3基因累加或聚合 通过多次回交或杂交把不同基因聚集在一个材料中。易懋升等9利用4类粳型亲籼系与携带有2个复原基因、Rf4和4个抗白叶

16、枯病基因Xa4、xa5、xal3和Xa21的品系构建回交群体，应用与目标基因紧密连锁的以PCR为基础的分子标记进行协助选择（MAS）。在BC1F1（回交1个世代）选择到2个复原基因和4个抗白叶枯病基因全杂合的植株19个。在BC1F2（回交2个世代）对19个当选株系进行MAS，共选择到28株至少含有4个纯合目标基因的单株，其中3个单株在6个目标基因座位上均带有纯合目标基因型。测交结果表明，选取的2个具有6个纯合目标基因的单株对野败型细胞质雄性不育系有良好的复原力。Hittalmani等5用3个具有相同遗传背景并分别带有不同来源的单一抗性基因的近等基因系（Pil，Piz-5，Pita）两两杂交，利

17、用分子标记筛选带有2个基因的纯合单株，然后再两两杂交，再用MAS筛选具有3个抗性基因的纯合单株。 3.4异源目的基因的筛选和鉴定 李进波等10对含有Bph14和Bph15的抗褐飞虱基因的5种野生衍生水稻品系，分别利用与Bph14和Bph15紧密连锁的SSR 标记MRG2329和MS5，在分别群体中进行分子标记协助选择。在辅选材料中，单株（占92.31%）在抗性水平上达到了中抗，单株和聚合株的纯合体全都显示出高抗。表明这2种分子标记在抗褐飞虱选育中是精确有效的。李希臣等11对用花粉管通道技术育成的第一个大豆品种黑生101，利用132个随机引物对黑生101及其供体、受体的DNA进行RAPD扩增，其

18、中3个单引物和2个双引物相组合，均能在后代黑生101中扩增出与供体相同而与受体不同的DNA片段，证明黑生101中确有供体DNA片段导入。Chen等12将IRBB21（携带有Xa21抗性基因品种）中白叶枯基因（Xa21）利用分子标记导入到优良复原系“明恢63”中，首次对IRBB21中Xa21进行了基因定位分析。 3.5遗传图谱的构建 遗传图谱是指对基因组内基因以及专一的多态性DNA标记相对位置的图谱。李磊等8利用SSR引物对具有抗黄萎病性状的陆地棉F2群体进行分子遗传图谱构建探讨。结果表明，在对新陆中10号和军棉1号的多态性筛选中，共筛选到73个稳定的SSR多态性位点。对73个多态性位点在F2群

19、体中进行验证，67个标记符合卡方检验，其中共显性标记61个，显性标记6个。其中47个标记位点安排到14个不同的连锁群上；14个连锁群的总长度为542.7 cM，覆盖棉花基因组的12.2%。Lin等13总共用238个SRAP引物复合物，308对SSR引物，600个RAPD引物，揭示了749个多态位点（437个SRAPs，205个SSRs，107个RAPDs），其中566个位点集中在41个不同的连锁群上。通过SSR标记，表明28个连锁群在对应染色体上。 4结语 目前分子标记技术在植物育种中主要起协助性作用。分子标记主要是用于一些表现型与基因型相关性不是很大的植株的筛选。大部分是先在构建好遗传图谱的

20、基础上，找寻与目标基因紧密连锁的分子标记，然后从杂交子代中检测分子标记是否存在。检测到了分子标记的植株，表明含有目的基因，可以进一步优化和筛选。与传统育种相比，分子标记育种更快、更节约人力、节约时间、提高效率。 分子标记在协助育种中主要用在种质资源的鉴定及评价、遗传图谱的构建、基因的定位、外来染色体的鉴定、基因的累加等方面。但目前，与主要农艺性状基因紧密连锁的分子标记还比较少，且分子标记的成本高，因此，降低应用成本是分子标记广泛应用的关键。 参考文献 1张献龙，唐克轩. 植物生物技术M. 北京：北京高校出版社，2004，509-515. 2俞法明，严文潮，刘庆龙，等. 早籼稻浙106与近缘系的

21、主要遗传鉴别方法探讨J. 种子，2006，25（6）：6-9. 3Tams S H, Melchinger A E, Bauer E. Genetic similarity among European winter triticale elite germplasms assessed with AFLP and comparisons with SSR and pedigree dataJ. Plant Breeding, 2005, 124: 154-160 . 4蒲宗君，颜泽洪，魏育明，等. 小麦材料PI31抗条锈性鉴定及其抗性基因SSR标记J. 植物病理学报，2006，36（4）：3

22、42-346. 5Hittalmani S, Foolad M R, Rodriquez R L, et al. Development of PCR based marker to identify rice blast resistance gene, Pi-2(t)in a segregating populationJ. Theor Appl Genet., 1995, 91: 9-14 6Murakami S, Matsui K , Komatsuda T, et.al. AFLP-based STS markers closely linked to a fertility res

23、toration locus (Rfm1) for cytoplasmic male sterility in barleyJ. Plant Breeding, 2005, 124: 133-136. 7Minamiyama Y, Kinoshita S, Inaba K, et.al. Development of a cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) marker linked to pungency in pepperJ. Plant Breeding, 2005, 124: 288-291. 8李磊，王沛政，秦利，等. 陆地棉分

24、子遗传图谱的构建J. 新疆农业科学，2006，43（4）：306-309. 9易懋升，丁效华，张泽民，等. 水稻抗白叶枯病复原系的分子育种J. 华南农业高校学报，2006，27（2）：1-4. 10 李进波，夏明元，戚华雄，等. 水稻抗褐飞虱基因Bph14和Bph15的分子标记协助选择J. 中国农业科学，2006，39（10）：2132-2137. 11 李希臣，雷勃钧，卢翠华，等. 外源DNA导入的大豆品种“黑豆101”APD初探J. 大豆科学，1999，16（3）：230-235. 12 Chen S, Lin X H, Xu C G, et al. Marker-assisted sel

25、ection to improve bacterial blight resistance of Minghui 63, an elite restorer of hybrid riceC. Eighteenth international congress of genetics (Abstracts). Beijing, Chinese Academy of Sciences. 1998, 158. 13 Lin Z, He D, Zhang X, et.al. Linkage map construction and mapping QTL for cotton fibre quality using SRAP, SSR and RAPDJ. Plant Breeding, 2005, 124: 180-187. 注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”