实验一植物分生区细胞染色体制片与有丝分裂过程的观察 - 植物生产.doc

《实验一植物分生区细胞染色体制片与有丝分裂过程的观察 - 植物生产.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验一植物分生区细胞染色体制片与有丝分裂过程的观察 - 植物生产.doc（40页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、目 录实验室工作规程1实验一 植物分生区细胞染色体制片与有丝分裂过程的观察4实验二 核型分析10实验三 植物同源多倍体的人工诱发与鉴定12实验四 植物性状遗传率估算17实验五 性状杂种优势与显性程度估算19实验六 控制性状最少基因数目估算21实验七 过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳23附 录32附录常用试剂的配制32附录 常用染色液的配制35附录 常用缓冲液的配制38附录 X2值表39实验室工作规程为保证遗传学实验能正常进行并获得理想的实验结果，防止在实验中发生过失和意外事故，实验操作者必须严格遵守实验室规那么，认真做好实验前后和实验过程中的各项工作。一、根本规那么1实验前必须预习，明确本次

2、实验的目的、原理、内容和方法。实验时须保持安静，按实验教材和指导教师的要求进行操作，并详实记录实验中出现的情况和获得的实验结果，对资料进行整理分析，得出结论，写出实验报告。2实验室、工作台、各种仪器、用具、玻璃器皿等必须保持清洁整齐，工作台要严防酸、碱腐蚀。各种化学药品、试剂等必须贴上标签，分门别类，放置一定位置，便于取用。3正确使用显微镜及各种仪器，切勿使染料或试剂沾污镜头、镜台和所用仪器。如有沾污，须立即用镜头纸擦拭干净。4取用药品时，所用各类量具必须分开，严禁混用，用后须立即冲洗干净。称量固体药品时，必须在秤盘上铺垫清洁白纸或蜡光纸，调试平衡后再称，以防药品腐蚀秤具。称量纸要做到一称一换

3、，以防药品混杂，导致所配试剂不纯。5遵守化学实验的操作要求，注意药品配制和使用时的平安。6实验完毕，须做好清洁整理工作，所用仪器、物品应放复原处。实验过程中如有损坏或丧失仪器用具，应如实填写报告单，视情况进行相应处理。7全班实验结束后，值日生安排整个实验室的全面清理清扫。离开实验室前，必须关闭所用仪器和灯具的电源，关紧水龙头和门窗。二、显微镜的清洁和保养显微镜是遗传学实验的重要仪器，使用时必须防尘、防高温、防湿、防药品侵蚀，在清洁保养中要做到以下几点：1取镜时必须一手提镜臂，一手托镜底，防止显微镜滑落损坏。2取出显微镜后，先用软毛刷、纱布拂擦镜身的防尘污物，用洗耳球吹去缝隙及镜头上的灰尘和纤维

4、等物，再用镜头纸擦拭物镜和目镜，最后用细白丝绸把镜头再擦一次。3镜检时物镜只能由低倍镜到高倍镜，在高倍镜下只能用微调螺旋调焦，细心操作，以防压碎玻片，损坏镜头。4假设发现镜头被药物或脏物污染，立即用擦镜纸醮少许二甲苯以刚湿润纸为度擦掉污物，再用擦镜纸擦干。5用完显微镜后进行清洁整理，将载物台放至最低处，转动物镜使之不要对着聚光镜，将显微镜放回原处。6严禁将显微镜与化学药品混藏。三、玻璃器皿的清洁 实验室所用玻璃器皿的清洁与否直接影响实验结果，实验前必须对玻璃器皿彻底清洗。一初用玻璃器皿的清洗 1新购置的玻璃器皿外表常附有游离的碱性物质，可先用肥皂水或去污粉洗刷，再用清水冲洗干净，然后用12的盐

5、酸浸泡4h以上，再用清水冲洗后用蒸馏水冲洗23次，100130烘干备用。2新载玻片和盖玻片分别在盐酸乙醇7095工业乙醇C2H5OH100ml加浓盐酸HCl2ml中浸泡4h，流水冲净，蒸馏水荡涤、晾干，置95乙醇中加盖，以便随时取用。二使用过的玻璃器皿的清洗1使用过的器皿应在未干前洗涤，如不能及时清洗，应浸在凉水中。洗涤方法：放入洗衣粉水中煮沸半小时，刷洗，清水冲净，蒸馏水荡涤，晾干或烘干；或在洗涤液中浸泡半小时，清水冲洗，蒸馏水荡涤，晾干或烘干。2对移液管、滴定管、量筒、量器等，使用后应立即浸泡于凉水中，防止残留的溶液干涸，难以清洗。工作完毕后用流水冲洗，除去附着的试剂、蛋白质等物质，晾干后

6、浸泡在铬酸洗液中46h或过夜，再用清水充分冲洗，最后用蒸馏水冲洗24次，风干后备用。注：铬酸洗液配制方法 重铬酸钾K2Cr2O7 20g，浓硫酸H2SO4，工业用，比重1.84或废硫酸100ml，清水100ml。先将重铬酸钾溶于温水，冷却后徐徐参加浓硫酸，防止发热。此液呈红色，加盖防氧化变质，反复使用至变蓝黑色为止。器皿玻片洗净后再用此液浸泡，可延长其使用时间。3陈旧或用过的永久制片的玻片，可先在肥皂水中煮沸510min，或将玻片微热后浸入二甲苯中脱胶，洗去残留的树胶和浆糊，并用清水冲洗干净。然后放入洗液中浸泡30min，再用清水冲洗掉残留的洗液，最后用蒸馏水洗净，置95乙醇中保存备用。四、玻

7、璃器皿的枯燥和灭菌遗传学实验中以微生物为实验材料时，实验所用的玻璃器皿必须枯燥和高温灭菌，防止杂菌污染。一枯燥枯燥的方法有自然晾干和烘干两种。自然晾干所需时间长，但器皿上无水渍。烘干是将器皿及其它用具置6080烘箱中枯燥，但器皿上可能留有水渍，因此，在枯燥之前应尽可能除去器皿上的水滴。二灭菌因高温能使微生物蛋白质变性，所以高温处理能到达灭菌的目的。高温灭菌的方法有干热灭菌法和湿热高压灭菌法两种。1干热灭菌法 将器皿及用具置160 2h，即可利用热空气杀死所有微生物及芽孢。在干热灭菌过程中要注意：1烘箱内忌放易燃、易挥发物品，物品不能装得太满，棉塞等物品不能接触烘箱壁，以免发生燃烧事故。2烘箱温

8、度达100以上后，切忌翻开烘箱玻璃门，否那么新鲜空气进入会引起燃烧，或因剧烈的冷热变化而使玻璃器皿爆裂。2湿热高压灭菌法此法高温与高压结合，蒸汽传热均匀，灭菌时间短，效果好。常用各种高压蒸汽灭菌锅进行灭菌。一般当蒸汽压力达1520 lb/in2、温度达121125时，保持2040min即可到达满意的效果。用此法灭菌应注意：1灭菌锅内水量要适当，过少会烧干而发生事故，过多会导致消毒物品水湿。2灭菌开始时翻开放气阀，加热使蒸汽将锅内的冷气排出，然后再关上放气阀继续加热。否那么灭菌效果不好。3灭菌加热时要随时注意压力变化，如压力指针超过红色警戒线而平安阀仍未放气，那么可能是平安阀失灵，应立即停止加热

9、，以防爆炸。4溶液或培养基灭菌后不能立即放气， 以免器皿炸裂或溶液喷出，需待其自然冷却，压力降至零时才可翻开放气阀，揭开锅盖。实验一 植物分生区细胞染色体制片与有丝分裂过程的观察实验目的1. 学习并掌握根尖或叶片材料处理、染色、压片及制片观察的方法。2. 观察有丝分裂各时期染色体的形态变化，了解有丝分裂全过程。实验原理熟悉有丝分裂过程、掌握有丝分裂染色体制片方法与技术是研究染色体形态结构、检查染色体数目、进行核型分析与带型分析的根底。高等植物有丝分裂主要发生在根尖、茎尖生长点及幼叶等器官的分生组织(分生区)，这些分生组织均可以用作制片材料；另外愈伤组织、悬浮培养物等分生组织也可用作制片材料。其

10、中根尖是最常用的材料，其原因有以下几个方面：根尖取材容易，操作和鉴定也比其它器官与组织方便；实验室内采用种子萌发后所长出的新鲜幼嫩根尖，不受植物生长季节的影响和限制，并且可以大量获得；对于某些珍贵而又稀少的试验材料，取用自然条件下生长植株的根尖，比取用茎尖、花器等对材料的伤害要小得多；采用实验室内种子发根，切取根尖后的种苗通常还可以进行正常种植，利于后续研究进行。对于特别珍稀的材料，如转基因植株花药或花粉培养诱导出的花粉植株、孤雌生殖植株，以及通过克服远缘杂交的不亲和性和远缘杂种的不育性所获得的珍贵材料，没有种子或种子数目非常稀少，有时剪取幼根也会影响植株的生活力。另外，有些植物根尖小、取材不

11、方便或根尖压片较难(如高梁)。这些情况下采用叶片压片法对材料的伤害是最小的，取材也非常方便，而且可以免去实验室发根工作。有丝分裂期在整个细胞周期中所占的时间相对较短，有丝分裂制片的主要目的是进行染色体鉴定，希望观察到更多分裂相,尤其是分裂中期相，通常要对材料进行不同的预处理。预处理主要通过抑制和破坏纺锤丝的形成来获得更多的中期分裂相；同时，预处理还可改变细胞质的粘度，促使染色体缩短和分散，便于压片和观察。常用的预处理有物理法、化学法、混合处理法等。植物细胞的细胞壁对细胞形态和结构起支撑和保护作用，分生组织的细胞壁结构将分生细胞结合成一个整体，因此在压片之前需要采用适当方法软化或局部分解细胞壁使

12、细胞间易于别离，这一操作称为解离。同时，解离也可适当去除局部细胞质，使细胞质背景趋于透明化，便于观察染色体。常用的解离方法主要有酸解法和酶解法。酸解法步骤简便、容易掌握。根尖分生组织经过酸解和压片后，都呈单细胞，但大局部分裂细胞的染色体还包在细胞壁中间。酸解法广泛用于染色体计数、核型分析和染色体畸变的观察及相关分析。酶解法常用于染色体显带技术或姊妹染色单体交换研究。通过解离和压片，分生细胞的原生质体能够从细胞壁里压出，使染色体周围不带有细胞质或仅有少量细胞质，让后续制片处理直接作用于染色体。果树染色体的制备常用酶解法。在普通光学显微镜下观察染色体形态结构还需要对材料进行染色，通常采用染色体染色

13、效果好而细胞质着色少的碱性染料、酸性染料或孚尔根试剂染色。实验材料蚕豆(Vicia faba, 2n=2x=12)、黑麦(Secale cereale, 2n=2x=14)、大麦(Hordeum sativum, 2n=2x=14)、普通小麦(Triticum aestivum, 2n=2x=42)、玉米(Zea mays, 2n=2x=20)、豌豆(Pisum sativum, 2n=2x=14)、洋葱Aillum cepa，2n16等根尖或幼叶，红桔(Citrus reticurata，2n=2x=18)、梨Pyrus communic,2n=2x=34等的幼叶或其它分生组织。实验器具、药

14、品显微镜、恒温箱、水浴锅、计时器、培养皿、酒精灯、小烧杯、试管、载玻片、盖玻片、镊子、剪刀、刀片、解剖针、吸水纸、纱布、标签、铅笔、橡皮等常用工具。醋酸洋红、醋酸地衣红、铁矾-苏木精、改进苯酚品红等染液，秋水仙碱， 8-羟基喹啉，饱和对二氯苯溶液或饱和-溴萘，卡诺氏固定液，FAA固定液，冰乙酸，甲醇，无水乙醇，95乙醇，0.1升汞，mol/L盐酸，果胶酶与纤维素酶混合液等。实验方法一、植物根尖压片法1发根 将蚕豆、玉米、黑麦等植物种子用0.1升汞消毒10min，经流水冲洗，温水浸种浸泡12d后，置25恒温箱中发根。待主根长到2cm左右时剪去主根须根系植物的种子发出的主根不需剪掉，让其充分长出侧

15、根。待侧根长到1 2cm时，于适宜时间用蒸馏水洗净，将水吸干，剪取根尖0.5 1cm进行预处理。假设以洋葱为材料，将洋葱磷茎置于盛水的烧杯口上，使洋葱鳞茎与水相接，在25下发根。为获得尽可能多的分裂相，蚕豆根尖以上午910时剪取为宜，洋葱根尖以中午12:3013:30切取为宜。2预处理 1秋水仙碱、或饱和对二氯苯水溶液、或mol/L 8-羟基喹啉处理：将剪下的根尖立即放入秋水仙碱、或饱和对二氯苯水溶液、或mol/L 8-羟基喹啉中，以药液浸没根尖为度，处理34h。抑制和破坏纺锤丝的形成，使根尖细胞延迟其染色体的别离，增加中期分裂相，并使染色体分散于细胞中，以便观察计数。2冷处理：将根尖放入盛有

16、蒸馏水的指形管中，置04的冰箱或在冰水中处理2440h，染色体数较多的实验材料可适当延长处理时间，但需注意勿使材料结冰。此法简便、平安，效果也好，而且经冰水混合物处理后细胞破裂程度较小，染色体不致丧失；其染色体的收缩程度较小，常用于显带技术，有利于得到更细致丰富的染色体带型。3混合药剂处理：在某些情况下，采用混合药剂处理可取得更好的效果。如：100ml对二氯苯饱和水溶液加12滴-溴萘饱和液处理34h，0.2秋水仙碱溶液加1滴-溴代萘饱和水溶液处理12h等。应该注意采用药剂处理时温度不能过高，以1015为宜。3固定 材料经预处理后，用流水冲洗，然后投入卡诺液3份甲醇1份冰乙酸，现配现用中固定20

17、24h，用95的乙醇洗两次，转入70乙醇中保存备用。固定的目的是将材料迅速杀死，并使染色体形态、结构尽可能保持不变和便于染色。4解离 常用酸解法：从70乙醇中取出固定好的根尖流水冲洗min吸水纸吸干放入小试管中加适量1 mol/L HCl于60水浴解离1015min(蚕豆根尖10min，玉米、黑麦、洋葱15min)。 对于玉米、黑麦和洋葱等，有时酸解后还可在25下酶解20min。5染色 针对不同材料或希望获得不同的效果，可选择适当的染液和染色方法。用于常规染色体形态结构鉴定的染色方法很多，常用的有如下几种。1 改进苯酚品红染色：假设只作临时镜检观察，对解离后材料水洗并吸干，挑取根尖乳白色分生组

18、织于载玻片上夹碎捣烂，滴加12滴染液，染色1015min，压片。2孚尔根反响染色：将解离材料洗净或直接转入席夫试剂于室温(最好在10左右) 进行孚尔根染色反响15h或过夜，然后在漂洗液中漂洗3次，每次510min，再经流水冲洗510min，保存于45乙酸中供压片。假设材料染色缺乏，也可再用1醋酸洋红复染压片。孚尔根反响是鉴别细胞中DNA的一种组织化学方法，它仅对核及染色体中的DNA显色，颜色比拟均匀一致而清晰，细胞软化较好。染色后染色体一般比拟柔软，压片时较长的染色体容易相互纠缠而不便于分散。试验说明，蚕豆、小麦、黑麦、洋葱、葱、蒜、百合等均适合于孚尔根染色。注：孚尔根染色反响材料必需采用酸解

19、法进行解离，并且对前处理要求较高，解离时间过长，孚尔根反响会减退；减退程度还与固定剂种类有关，一般卡诺氏固定液的减退作用比FAA固定液明显。因此孚尔根反响染色可采用FAA固定材料，然后将固定材料经过50乙醇转入水中，再转入1mol/L HCl中，于60水浴中解离515min，并迅速换入1mol/L 冷HCl中。解离材料经水洗12次或直接进行孚尔根反响。31醋酸洋红染色：假设只作临时镜检观察，将解离水洗后的材料吸干，挑取根尖乳白色分生组织于载玻片上夹碎捣烂，滴加12滴染液，染色1020min，压片。4醋酸地衣红染色：将材料置盛染液的试管中，在酒精灯上加热35s，反复23次，静置1030min或更

20、长时间。取出材料用染液压片，可在压片后稍加热以加深染色。注：由于醋酸地衣红易溶于乙醇，因此70乙醇保存材料取出后应当充分洗净后浸入45乙酸中再进行染色。5铁矾-苏木精染色：经HCl解离后的材料用流水彻底冲洗后，转入新鲜配制的4铁矾溶液媒染24h如加温至3040媒染，那么可缩短至1h左右，再用水冲洗2025min，务必将残留的铁矾洗净。媒染后材料转入0.5苏木精中染色24h或更长时间如参加苏木精后，染液很快混浊、发黑，那么表示铁矾未洗净，需重新冲洗，再行染色，染色后用水冲洗510min，置45乙酸内分色、软化1020min可再经1氨水处理1min，使材料充分软化，压片假设染色后暂时不压片，可将材

21、料转入70乙醇或蒸馏水保存于4冰箱中。注：经染色后，除染色体能染上极深的蓝色外，细胞壁及细胞质也都能不同程度地着色；同时由于染色体吸附有媒染剂的金属离子，易变坚硬，压片后易分散。因此必需用45乙酸处理，以使染色体呈深蓝色，而细胞质退淡，染色体软化。此法对各种植物的染色体均可染上较深的颜色、反差大、分色清晰，利于摄影和制片标本长期保存，为其他染色方法所不及。6压片 在经染色的材料上加一滴染液，盖上盖玻片，覆一层吸水纸，用带橡皮头的铅笔垂直敲打，或以拇指垂直紧压盖片(注意勿使盖片搓动)，使材料分散压平，便于观察。7镜检 通常染色清晰而又分散得很好的分裂相只是少数，因此压片后要认真仔细地进行镜检。先

22、在低倍镜下寻找有分裂相的视野，再用高倍镜或油镜仔细观察、记数或拍照。调节可变光栏与反光镜，使光线明暗适宜，视场亮度适中。注意观察有丝分裂全过程的染色体形态变化，找出染色体分散好的中期细胞进行染色体计数，对好的分裂图像作上标记，以便再观察。8临时封片保存制片短时间保存要防止玻片间的溶液干涸，空气进入，无法观察。临时片保存可在盖片周围滴上45乙酸或染液，放入有湿滤纸的培养皿内，加盖后可保存数小时到一天。如制片标本符合要求，而又只需要短期(一般在一周以内)保存，可采用石蜡临时封片。用烧红解剖针挑取少量石蜡(或石蜡与凡士林等体积混合物)沿盖片周围封闭。制作完成的制片标本要贴上标签，注明材料名称、可观察

23、到的有丝分裂典型时期、制片时间、制作者等信息。二、植物叶片染色体压片法1取材 为排除叶绿素可能造成的干扰，又能取得叶片分生组织局部，各种植物均以取幼嫩的心叶或幼嫩的小叶为佳。取材时间一般于上午9:0011:00(随植物种类而异)。以麦类植物为例，在分蘖期取未拔节分蘖心叶，上午10:00左右逐层剥除外层绿色叶片，留下成筒状尚未伸展也无明显叶鞘结构的心叶和次心叶。剪去有叶绿素的局部，留下一段5 mm10mm幼嫩的基部基部为叶片分生组织区，细胞分裂活动旺盛。为了便于区分材料的上下部位，要把两个断头剪成不同的形状，如上尖下齐。2预处理 取得叶片材料可采用下述方法之一进行预处理：(1) 将材料放入蒸馏水

24、中，置14冰箱内20hmol/L 8-羟基喹啉溶液内3h，然后用水冲洗；(3) 将材料放入0.2秋水仙碱溶液内2h，然后用水冲洗。3固定 经预处理以后的材料洗净后投入卡诺氏液，固定1220h。快速固定可在60 条件下，在1560min内完成。也可采用FAA固定液进行固定。固定后用梯度浓度乙醇换洗，保存于70乙醇中备用。4解离 一般叶片采用酸解法即可到达很好的解离效果，以下解离方法效果相当，可任选一种进行处理：(1) 1mol/L HCl，于60水浴中内处理815min；(2) 5mol/L HCl，于室温(25)处理815min；(3) 95乙醇和浓盐酸(3:1)解离液，于室温(25)处理51

25、0min，解离后流水冲洗材料。5染色 凡适用于根尖的染色方法均适用于叶片， 常用染色法有(1) 醋酸洋红染色；(2) 改进苯酚品红染色；(3) 铁矾-苏木精染色。通常直接用前两种染液之一进行压片即可到达较好的染色效果。采用醋酸洋红染色时可用酒精灯轻微加热来加快染色，并软化组织；如果染色缺乏，可在盖片四周加一滴染液，待其渗透后重新压片。采用铁矾-苏木精染色时，材料需经流水反复冲洗后，用4铁矾溶液媒染约20min，再用流水反复冲洗后，用0.5苏木精溶液染色12h，用水冲洗，保存于蒸馏水中即可压片。6压片 切取幼叶基部(材料齐头方)左右，置于载玻片上用刀片切碎，加一滴染液(在用铁矾-苏木精染色时应滴

26、加45的乙酸)，加盖片，压片。7镜检 先在低倍镜下寻找有分裂相的视野，再用高倍镜仔细观察。8临时封片保存 同根尖压片。考前须知本实验中使用的预处理化学试剂具有强烈的致癌作用，在使用过程中应严格按实验室平安规那么进行操作，废液应经专门回收处理以免造成环境污染。作业制作细胞有丝分裂前、中、后、末各期的制片一张，中期应能数清染色体数。贴上标签，注明材料名称，染色方法，制片日期和制作者姓名。2绘制所观察到有丝分裂典型时期的染色体图像，并简要说明各时期染色体的行为变化和特征。实验二 核型分析实验目的1学习和掌握核型分析的方法。2进一步了解染色体形态特征、在细胞分裂中的联会形象以及染色体组、核型及染色体数

27、目、结构变异与生物进化的关系。实验原理 因为核型分析能明确识别各个染色体的特征，通过核型分析可以了解不同物种、同一物种不同亚种、或家畜不同品种甚至同一品种不同个体之间染色体结构的差异，有助于基因定位及其它遗传分析。实验材料动、植物有丝分裂中期染色体相片。实验器具、药品 不锈钢尺，小剪刀，小镊子，绘图纸，粘剂，座标纸等。实验方法1准备染色体标本的相片 将制作的细胞轮廓清楚，染色体集中而不重叠，主、次缢痕和随体清晰，染色体长度适中而不弯曲的染色体标本，通过显微摄影或描绘、冲洗、放大成染色体相片。2染色体测量 目测相片上每条染色体长度，按长短顺序初步编号，写在每条染色体相片反面，用钢尺逐个测量每条染

28、色体长度长臂长、短臂长，根据相片的放大倍数放大倍数某染色体相片上长度m/ 某染色体实际长度m换算出各条染色体的实际绝对长度、相对长度、臂比及着丝粒位置，有随体的染色体，其随体长度和次缢痕长度可计入全长，也可不计入，但必须加以说明。将测量和计算的数据分别记录如表8-2和表8-3。3排列核型图 按上述标准及计算结果，将照片上的染色体剪贴配对，重新编号。着丝粒排在同一水平线上，短臂在上，长臂在下。排列好后进行分析比拟，确定其核型是否正常。假设要准确细致分析，必须进一步运用染色体显带技术。4绘制核型模式图 根据前面的计算结果和排列的核型图，用绘图纸和座标纸座标纸放在绘图纸下面绘制核型模式图。横座标为染

29、色体序号，纵座标为染色体臂的相对长度，“0”为长、短臂的分界线，长臂在下，短臂在上。作业1制作染色体核型图，并绘制染色体模式图。2简要描述实验所测核型的分析结果。表2-2 核型分析实测记录表序号条实测长度mm序号条实测长度mm长臂短臂臂比长臂短臂臂比123456789101112131415161718192021222324.表2-3 核型分析计算表序 号对实测长度mm相对长度臂比染色体类 型长臂短臂全长长臂短臂全长123456789101112.总 和实验三 植物同源多倍体的人工诱发与鉴定实验目的1. 了解人工诱发同源多倍体植物的原理，初步掌握秋水仙碱诱发多倍体的方法。2. 观察同源多倍体

30、植物植株(器官)形态特征与细胞学特点，了解同源多倍体鉴定方法。3. 了解同源多倍体在生物进化与植物育种上的意义。实验原理植物同源多倍性变异可能通过减数分裂与有丝分裂产生。前者可能是自然界中多倍体形成的主要途径，而人工诱发植物多倍体主要通过有丝分裂过程加倍获得，秋水仙碱是最为常用而有效的处理药剂。秋水仙碱是从百合科秋水仙属的一个种秋水仙(Colchicum autumnala L.)的器官和种子中提练出来的一种植物碱，化学分子式为C22H25O6N。纺锤丝主要化学成分为蛋白质，而蛋白质分子之间由硫氢基形成二硫键聚合。秋水仙碱能抑制硫氢基，同时保持细胞活性，因此它能阻止蛋白质分子聚合，或使已构成纺

31、锤丝的蛋白质分子间发生解聚，从而阻止分裂细胞形成纺锤丝或破坏纺锤丝。常用的有效浓度为0.01-1.0% ，木本植物采用的浓度相对较高，可达1.5% ，而蔬菜或处理幼嫩材料等适用的浓度那么较低，一般不超过0.5% 。处理方法可用水溶液浸渍、涂抹或点滴植物的分生组织，使每个复制为二的染色体不能向两极分开，同时细胞也不能分裂成两个子细胞，每个细胞内染色体增加一倍，形成多倍体细胞。经加倍的细胞，如无药剂作用，仍然能进行正常的有丝分裂，由此而产生的子细胞，一般说都是多倍性细胞。从这种细胞分化出来的植株就是多倍体。由于同一组织的不同细胞有丝分裂并不同步，如果已加倍的细胞在下一次细胞分裂时再次加倍可产生更高

32、倍数的细胞，而出现混倍性现象。由多倍体的组织分化产生的性母细胞，经减数分裂和受精结合仍产生多倍性后代。人工诱发的同源多倍体植物主要特征为：器官和细胞的增大，如气孔、花器、花粉粒、种子、果实等局部明显增大；气孔数目减少而密度变稀；气孔内叶绿体数目增加。减数分裂过程中染色体联会别离不正常、分配不平衡，配子育性降低。鉴定多倍体植株的方法有形态学鉴定和细胞学鉴定两种。形态学鉴定是观测叶片气孔保卫细胞、花、果实、种子的形态、花粉粒大小及育性等性状的变异进行间接鉴定。细胞学鉴定观测根尖、茎尖分生组织或花粉母细胞的染色体数目，直接鉴定。在显微镜下观测细胞或其内含物的大小时，通常需借助于目镜测微尺和镜台测微尺

33、。一般目镜测微尺的刻度全长为5mm，分成50格或100格。镜台测微尺的刻度全长1mm，分为100格，每小格长度为0.01mm。由于使用的显微镜放大倍数不同，目镜测微尺所代表的实际长度也不同，故使用前必须先求出目镜测微尺和镜台测微尺两者刻度间的换算值。具体方法是：在显微镜下把目镜中的目镜测微尺与放在载物台上的镜台测微尺两者的刻度线对准并重合，计数二者重合刻度线间的格数，然后按下式计算目镜测微尺每格的实际长度(m)。在使用显微镜观测标本时，即移去镜台测微尺，根据目镜测微尺量出被测物体的格数，乘以换算值，即得实际长度(m)。当变换显微镜的目镜或物镜放大倍数时，须重新计算换算值。注意不同的显微镜即使放

34、大倍数相同，或同一显微镜非同一次使用，也必须分别测算其换算值。实验材料1. 玉米(Zea mays, 2n=20)、大麦(Hordeum vulgare，2n=14)、黑麦(Secale cereale, 2n=14)、西瓜(Citrullus vulgaris，2n=22)、蚕豆(Vicia faba，2n=12)、亚洲棉(Gossypium arboreum，2n=26)等植物种子。2. 水稻(Oryza sativa, 2n=24)、大麦(H. vulgare)、西瓜(C. vulgaris)等植物幼苗(或种子)，葡萄等植物植株或插条。3. 水稻(O. sativa)、大麦(H. vul

35、gare)、黑麦(S. cereale)等植物二倍体和同源多倍体的种子、叶片等植株、器官新鲜材料、标本或照片。实验器具、药品普通显微镜，目镜测微尺，镜台测微尺；剪刀，镊子，刀片，解剖针，载玻片，盖玻片；烧杯，广口瓶，培养皿，吸水纸，恒温箱，纱布，吸水纸等。0.05%0.1% 秋水仙碱溶液，无水乙醇，冰乙酸，1% I-KI溶液，1mol/L盐酸；改进苯酚品红染色液，苏木精-醋酸龙胆紫(或结晶紫)；0.1%0.2% AgNO3等。实验方法一、植物根尖多倍体的诱发1.将玉米、大麦、蚕豆、黑麦、西瓜等种子洗净后用水浸泡12d，然后摆放在铺有湿润滤纸(或纱布)的培养皿中置于2528条件下发芽，芽越壮越好

36、。当根长到1cm以上时取出洗净，将水吸干。2.移至%0.2% 的秋水仙素溶液中，使根部浸在药液中，根尖朝下，25条件下处理直到明显膨大为止(24h左右以至36h)；另设一清水处理对照。处理过程中注意勿使药液干涸。注：在处理洋葱时，必须先剪去老根，然后置于盛满水的瓶口上，待长出新的不定根后，再行处理。3.取出材料洗净，用卡诺氏液固定1h，以备镜检。二、多倍体植物的诱发(参见表3-1)表3-1用秋水仙碱处理局部植物诱发多倍体的技术材 料处理部位药剂浓度(%)处理时间温度()处 理 方 法黑 麦萌芽种子35h27用刚张口的麦芽种子浸种。小麦黑麦幼 株45d分蘖期中掘起幼苗，洗净根部浸于药剂中。籼稻粳

37、稻幼 株1011d56片叶时洗净细根，在茎基用刀割一切口，不要损伤生长点。油 菜幼 苗10d子叶初张时滴药液于顶芽，每天23次。棉 花种 苗6h2326将种子水浸24h之后，去掉种皮催芽4d，把种芽倒转幼根向上而嫩茎浸入药液。幼 株6h2326将种子播于纸制营养钵中，23片真叶时，将钵倒转使茎尖侵入药液。西 瓜幼 苗0.20.627d将药液滴在幼苗生长点上。马铃薯种 子将种子放在灭过菌的盛有秋水仙碱溶液与2% 琼脂等量混合物的培养皿中发芽，种子萌发后洗净并移植。苹 果幼 枝顶 芽盆栽幼枝约高25cm时，去掉小叶暴露顶芽，将秋水仙碱和入0.65% 琼脂内，涂到芽上，保持湿润，下部副芽要去掉。甜

38、橙萌芽种子7296h1.种子处理(1) 取蚕豆、亚洲棉等植物种子置%0.1% 秋水仙素溶液中(2025)浸种24h，取出种子用自来水冲洗23次。(2) 将种子移至放有被0.025% 秋水仙素溶液润湿下的吸水纸的培养皿中加盖，放入20培养箱内发芽，一般处理两天就可长出幼苗。对枯燥种子比浸过种的种子要多处理1天，种皮厚发芽慢的种子应先催芽后进行处理。由于秋水仙素能阻碍根系发育，所以对已发芽的种子应用较低的秋水仙素溶液处理较短的时间。(3) 处理后取出幼苗，用自来水缓慢冲洗以免损伤，然后将幼苗移栽到大田或盆钵内，同时播种未经处理的种子幼苗作为对照。2.幼苗处理(1) 水稻、大麦取已有56片叶的水稻或

39、大麦幼苗，洗净根部，用刀片在分蘖处割一浅伤口，然后浸入0.05% 秋水仙碱溶液中，在2025条件下处理45d，并保持足够的光线。处理后用水洗净幼苗进行盆栽，以便与对照观察比拟。(2) 西瓜先将二倍体西瓜种子浸种催芽，当胚根长到1cm时，将胚根倒置于0.2%0.4% 秋水仙素溶液的培养皿中置25温度下浸渍2024h，注意处理时需要用湿滤纸将根盖好，防止失水。处理后的幼苗，经水洗进行栽种或砂培。另外也可以采用田间处理幼苗的方法，即当幼苗子叶展平时，每天早晚用0.25% 或0.4% 秋水仙素溶液滴浸生长点各一次，每次12滴，连续处理4d，遮阴保持湿度。以上两种方法获得四倍体西瓜，用四倍体作母本与二倍

40、体西瓜杂交，在四倍体植株上就结出三倍体种子(3n=33)。为了保证所结的种子是三倍体，常用具有黑条纹瓜皮色显性基因作为标记性状的2n品种作为父本，这样在4n2n的后代中，但凡长出黑条纹瓜的都是3n植株，以区别4n株间偶然授粉产生4n西瓜。3.芽处理选用葡萄植株或插条等果树的顶芽或腋芽生长点进行处理。将芽部固定一个蘸有0.5%0.7% 的秋水仙素棉球(最好外罩一塑料袋防止蒸发)连续处理23d(也可将蘸有秋水仙素的棉球涂抹生长点)，处理后反复用清水冲洗生长点。待进一步生长后，再进行观察和鉴定。三、多倍体鉴定观察比拟水稻、大麦、黑麦等植物二倍体和同源多倍体植株、穗、种子等标本或照片；比拟鉴定二倍体和

41、多倍体在形态上的主要区别。(1) 保卫细胞测量仔细撕取二倍体和同源多倍体植株的叶片下表皮，置于载玻片上，并加12滴1% I-KI，盖上盖玻片。在高倍镜下用测微尺测量气孔保卫细胞的大小，分别测量10个保卫细胞的长度和宽度，求其平均值。保卫细胞的形态因物种而异，双子叶植物的保卫细胞多呈肾形，单子叶植物的保卫细胞多呈哑铃形。(2) 气孔密度测定将叶片表皮制片于显微镜下检查，计算每个视野气孔数，转换视野重复10次，求出平均值。视野面积的计算，用目镜测微尺量出视野直径，按公式S=r2求视野面积，得每平方毫米叶面积的气孔数。(3) 保卫细胞内叶绿体数目测定取叶片下表皮于载玻片上，滴加AgNO3溶液，数秒后

42、加盖玻片，在显微镜下观测保卫细胞内的叶绿体数目。取新鲜或已固定的二倍体和同源多倍体植株花蕾或颖花，以花粉涂抹于载玻片上，加12滴1% I-KI，盖上盖玻片。镜检观察花粉粒的形态和大小是否整齐，有无畸形。测量1020个花粉粒直径的数值，求其平均值。将秋水仙碱处理和对照材料的根尖固定，按根尖压片法(参见根尖压片法实验)进行解离、染色、制片。镜检进行染色体数目鉴定。取二倍体和同源多倍体植株的花蕾或幼穗分别固定(或取已固定材料)，采用压片或涂抹制片(参见花粉母细胞涂抹片制作)。镜检进行染色体计数及染色体联会配对行为的观察。考前须知秋水仙碱属剧毒药品，具麻醉作用，操作时切勿使药液接触皮肤和溅入眼内。作业

43、1. 观察比拟二倍体与多倍体在植株(器官)形态特征上的主要区别。2. 观察比拟多倍体和正常二倍体保卫细胞大小、气孔密度、保卫细胞内叶绿体数目以及花粉粒大小等特征。3. 观察蚕豆根尖中期分裂细胞(1520个/人)，记载其中染色体加倍及未加倍的细胞数目，综合全班(组)结果，测算秋水仙碱诱发多倍体细胞的频率。4.绘制你所观察到的能够计数染色体数目的多倍性细胞图象。5.秋水仙碱处理为什么会产生组织中细胞的混倍性(或细胞嵌合)现象?由此，秋水仙碱处理应注意些什么?实验四 植物性状遗传率估算实验目的1. 学习数量性状遗传试验资料整理与根本统计参数计算方法。2. 掌握植物性状遗传率估算的原理、方法。3. 了

44、解遗传率在育种实践上的应用。实验原理遗传率是性状遗传方差占总方差的比率，用以度量遗传因素与环境因素对性状形成的影响程度，是对杂种后代性状进行选择的重要指标。植物数量遗传研究时，常用杂交亲本及杂种后代各世代群体方差估算性状的遗传率，并将遗传率分为广义遗传率和狭义遗传率。广义遗传率(hB2)指基因型方差占表现型方差的比值；狭义遗传率(hN2)指加性方差占表现型方差的比值。1. 广义遗传率(hB2)广义遗传率(hB2)的定义公式及其估算为：如供试材料为无性繁殖作物，由于个体的异质杂合性的特点，常用营养系方差(VS0)估计环境方差，以自交一代的方差(VS1)估计总方差，其基因型方差VGVS1-VS0，

45、遗传率可用下式估算：2. 狭义遗传率(hN2)F2代性状狭义遗传率(hB2)的定义公式及其估算为：实验材料植物(玉米、水稻、棉花等)杂交组合六个世代同年种植的田间群体、植株(器官)标本或其遗传试验资料，如表4-1, 4-2, 4-3。实验用具米尺或钢卷尺等；计算器。实验方法1. 性状考察与数据整理分组考察各世代田间试验群体、植株(器官)标本试验性状，如：玉米果穗长度、株高，水稻生育期，小麦株高，棉花纤维长度等。综合全班获得试验资料，并可整理成次数分布资料。2. 根本参数估算分别估算各世代各性状的根本统计参数平均值、方差与标准差。3. 遗传参数估算分别估算各性状的广义遗传率、狭义遗传率。作业1. 估算所试材料或相应遗传试验资料的性状遗传率。2. 比拟分析三个环境方差公式估算的结果及适用范围。3. 分析亲本(自交系)、F1、F2以及回交世代群体内个体间