[微生物来源的透明质酸酶] 乳中微生物的来源.docx

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1、微生物来源的透明质酸酶 乳中微生物的来源 摘要：对微生物来源的透亮质酸酶的结构、降解机制、分子生物学与应用等探讨现状进行综述。 关键词：透亮质酸酶；作用机制；基因；微生物 中图分类号：Q556文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)09-0040-05 透亮质酸酶（hyaluronidase）是对催化降解透亮质酸酶的通称。两项探讨导致了透亮质酸酶的发觉1，一是1928年Duran-Reynals在探讨哺乳动物睾丸及其他组织提取物时发觉了一种“扩散因子”，可以促进皮下注射的疫苗、染料、毒素等更好地扩散。二是1937年Meyer发觉型肺炎链球菌可降解透亮质酸（hyaluronic a

2、cid，HA）。随后，前面提到的“扩散因子”也被鉴定是透亮质酸酶。此后，人们在蛇毒、蜂毒、蝎毒以及蜘蛛等的毒液中都检测到了透亮质酸酶。在人体组织及体液中也发觉广泛存在着透亮质酸酶。此外，一些细菌、真菌以及非脊椎动物如水蛭、甲壳类动物等也产生透亮质酸酶。透亮质酸酶分布虽广，但在过去很长一段时间里由于分别纯化困难而且好像探讨意义不大，并没有得到很好地探讨，是一类被忽视的酶。最近十几年来，人们对HA和透亮质酸酶显示出了深厚的爱好，试图探求它们在众多生物学过程中的作用。 1透亮质酸酶的分类 1971年，Meyer依据透亮质酸酶作用机制的不同，将它分为3类（图1）：(1) 内切-N-乙酰氨基葡糖苷酶（E

3、C 3.2.1.35）为水解酶，作用于-1,4糖苷键，终产物主要为四糖，也可作用于软骨素或硫酸软骨素，并有转糖苷酶活性。哺乳动物来源的以及动物毒液来源的属于此类。探讨最多的是睾丸、蜂毒以及溶酶体透亮质酸酶；(2) 水蛭、十二指肠虫来源的透亮质酸酶，为内切-葡糖苷酸酶（EC 3.2.1.36），作用于-1,3糖苷键，也是水解酶，主要降解产物是四糖，特异性降解HA；( 3) 细菌透亮质酸酶（EC 4.2.2.1），也称为透亮质酸裂解酶（hyaluronate lyase），作用于-1,4 糖苷键，通过-消去机制得到4,5-不饱和双糖。 随着分子技术的发展，依据氨基酸序列的同源性，透亮质酸酶也可分为

4、两大类：原核生物透亮质酸酶和真核生物透亮质酸酶。 2底物特异性 大多数透亮质酸酶不具有底物特异性，也能降解软骨素（chondroitin，Ch）和硫酸软骨素（chondroitin sulfate，Chs）。进化学探讨表明2，肝素是最早出现的黏多糖，而后是软骨素， HA则晚得多。透亮质酸酶很可能是从硫酸软骨素酶发展而来。 3降解产物 链球菌等致病菌可利用透亮质酸酶降解宿主细胞外间质的主要成分HA，破坏宿主的防卫系统，促进入侵。细菌透亮质酸酶以不饱和双糖为终产物，一些其他的酶可将这些双糖降解为单糖作为碳源和能源被细菌利用。 为细菌供应碳源和能源可能是HA被降解为不饱和双糖的缘由3。因为双糖分子小

5、，便于运输以及进一步降解，而导入的不饱和双键比起水解产物中的单键更便于进一步发生化学反应，利于降解。不饱和双糖与饱和双糖的构象显著不同，更利于反应。 4活性测定 在几十年的探讨过程中，曾经运用许多方法测定透亮质酸酶尤其是水解型透亮质酸酶的酶活性，不过许多方法现在都基本不用了。1994年Hynes将这些方法分为分光光度法、放射学法、荧光法、酶谱法、平板法以及化学法、物理化学法等。此后又有许多新技术、新方法出现。这些方法中比较经典和常用的有浊度法和Morgan-Elson比色法4。此外，还可用紫外微分光谱法检测细菌透亮质酸酶不饱和键的汲取。 5酶的结构 近年起先用X-射线晶体衍射法探讨透亮质酸酶的

6、结构和作用机制。目前见到报道的有Streptococcus pneumoniae和S. agalactiae（Group B streptococcus，GBS）透亮质酸酶。 完整的细菌透亮质酸酶包含4个结构域：N末端的糖结合域，间隔域，催化反应域，最终是C末端调整域，两个末端结构域与相邻结构域间由一段连接多肽相连（图2）5,6。然而，从重组的Escherichia coli得到的完整长度的透亮质酸酶不稳定，会发生自动水解。稳定状态的酶由C末端的两个结构域构成，其中催化反应域由-螺旋结构构成，一般称为-结构域， C末端调整域则由-片层结构构成，一般称为-结构域。 -结构域有一个带正电荷的疏水性

7、裂口（cleft）横贯其中，带负电荷的疏水性底物HA即在此裂口中被结合、降解。催化裂口只能容纳3个双糖结构进入。酶的活性中心位于裂口中间最窄处，由Asn349，His399及Tyr408（S. pneumoniae透亮质酸酶氨基酸序列号）3个残基组成。-结构域的作用类似一扇门，调整底物（HA/Ch/Chs）到达催化部位。完整长度的酶在N末端还包括2个结构域，均为-片层结构。第1个是糖结合域，也许是加强细菌透亮质酸酶与底物间的亲和力的。第2个结构域较小，作为间隔域将-结构域与N末端糖结合域隔开。 6 降解机制 基于酶的晶体结构及酶与HA寡糖复合体晶体结构的探讨，HA结合和降解的机制称为质子施受（

8、proton acceptance and donation，PAD）7，并且表明是以-消去方式进行性（processive）降解HA 8。最初，透亮质酸酶可能随机与HA的某个部位结合，将其切为2段，其中含有不饱和双键的片段（即含有原HA还原端的片段）离开酶的活性中心，而含有原HA非还原端的片段留在催化裂口中，并移动1个双糖单位，接着进行下一轮降解。这样，每次在还原端产生1个不饱和双糖并离开，留下的非还原端片段移动1个双糖单位再接着降解，直到整个片段完全降解。 进行性降解机制最初是由Pritchard通过分析HA降解产物提出的9，并且得到了酶结构探讨的证明。但是，关于降解方向，文献中出现不同的

9、结论。对酶与底物复合物结构的探讨表明，降解是从HA链的还原端向非还原端进行，而Baker等10通过分析降解产物，认为降解是从非还原端向还原端进行。 7产透亮质酸酶的微生物 许多革兰阴性以及革兰阳性细菌都产可降解透亮质酸的酶。革兰阴性菌产生的酶存在于周质空间而不是释放到胞外，不大可能与发病机制有关，而且，这些酶类更像是软骨素酶。这些菌类有Aeromonas，Bacteroides，Fusobacterium 以及Vibrio。 产透亮质酸酶的革兰阳性菌有Streptococcus，Staphylococcus，Clostridium，Propionibacterium，Peptostreptoc

10、occus 以及Streptomyces。Clostridium perfringens，Propionibacterium acens及Peptostreptococcus均为厌氧菌，对其探讨不多。而关于链球菌透亮质酸酶的报道则许多，且深化。 其他的如Treponema pallidum 及T. pertenue产生表面缔合的透亮质酸降解酶，但似乎是水解酶，还需进一步探讨。巴西的Shimizu等发觉Candida的一些菌也产透亮质酸酶，但是没有进一步探讨，后来又报道Paracoccidioides brasiliensis也产透亮质酸酶11。 引人注目的是，这些菌株大都是致病菌，可引起人或动

11、物的黏膜或皮肤感染。这些致病菌利用产生的透亮质酸酶降解宿主体内的HA，破坏其防卫体系，降低黏度，便于入侵及到达志向的位点。这些透亮质酸酶大多也可作用于软骨素和硫酸软骨素，二者也是胞外基质的成分，从而更利于菌体入侵。但最近的一篇报道显示，HA降解可能更倾向于促进毒素扩散，而不是菌体本身扩散12。 特殊提出两类特殊的透亮质酸酶，一是链霉菌透亮质酸酶，再是噬菌体透亮质酸酶。二者都特异性降解HA，而且不是进行性降解。 链霉菌透亮质酸酶Streptomyces hyalurolyticus透亮质酸酶与链球菌透亮质酸酶不同，它不是进行性降解，而是实行随机内切的方式，产生大小不同的不饱和糖。它虽然也用-消去

12、机制，但降解产物为不饱和四糖、六糖13。而且特异性降解HA，好像不能降解软骨素。此酶的基因序列尚不清晰，有待进一步探讨。 噬菌体透亮质酸酶Streptococcus pyogenes 及S. equi的温柔噬菌体也产透亮质酸酶。噬菌体透亮质酸酶基因序列之间有很大的同源性，但与细菌透亮质酸酶序列相像性很小。细菌透亮质酸酶的相对分子质量在(912)104，为单聚体，而噬菌体透亮质酸酶只有(3.64)104，但以多聚体状态存在14。噬菌体透亮质酸酶专一性降解HA，尽管也是裂解酶，但不是进行性降解 15。当溶原性S. pyogenes与人咽细胞共同培育时，溶原性噬菌体可被诱导释放，结果是，细菌的和噬菌

13、体的毒素共同释放 16，噬菌体透亮质酸酶因此也参加降解人体内的HA。不过噬菌体产透亮质酸酶的目的不在于此。由于S. pyogene有HA荚膜，可能会遮盖噬菌体受体，而噬菌体携带透亮质酸酶就可穿透荚膜，到达受体部位，进而感染细菌17。 8基因的克隆、测序及表达 1989年Hynes和Walton绘制了Streptococcus pyogenes 噬菌体H4489A透亮质酸酶的基因序列。此后，在20世纪90年头中后期，众多探讨者对其他一些菌株的透亮质酸酶基因进行了克隆、表达及序列分析的探讨。2000年Hynes和Walton分析了当时已确立的10个透亮质酸酶基因序列（2个噬菌体透亮质酸酶序列，2个

14、革兰阴性菌透亮质酸酶序列，6个革兰阳性菌透亮质酸酶序列），绘制了系统发生树图谱（图3）18。由图3可见很明显的3个大组，革兰阳性组（Clostridium perfringens除外）、革兰阴性组和噬菌体组。 随后，Hynes等19分析了S. pyogenes ATCC 10403自身编码的透亮质酸酶基因。2003年Takao 报道了S. intermedius 及 S. constellatus subsp. constellatus 透亮质酸酶基因序列20。 利用已知的基因序列，探讨者构建了基因工程菌，表达并分别纯化透亮质酸酶，利用得到的足够数量的透亮质酸酶，人们可以用X-射线晶体衍射法探

15、讨酶的结构及作用机制，以及进行其他的探讨。 9种群基因探讨 许久以来人们始终在探讨致病菌的致病机制。自从发觉透亮质酸酶后就有人探讨透亮质酸酶与致病性的关系。分子生物学发展起来之后，人们更是从基因水平探讨各毒素基因在种群中的分布。 最近10多年来，对许多人畜致病菌进行了种群基因探讨，对理解这些细菌的生态学、病原性及流行性构建了极有价值的框架。而且，通过分析这些数据，人们可以了解它们的演化史及重组对个体种和单基因位点的影响。目前探讨的透亮质酸酶基因分布有S. pyogenes自身透亮质酸酶基因hylA19及其噬菌体透亮质酸酶基因hylP、hylP221, 22的分布，S. agalactiae透亮

16、质酸酶基因hylB及插入因子IS1548的分布23，以及Streptococcus suis透亮质酸酶基因的分布24。这些基因都普遍存在，但表达酶活性的菌株很少。基因序列长度不同，存在等位基因甚至复等位基因。 10透亮质酸酶的应用 透亮质酸酶可通过降解组织中的HA，增加膜的通透性，降低黏度，促进注射液的扩散，这些现象称为透亮质酸酶的扩散作用。基于这一性质，透亮质酸酶可应用于治疗过程，以加快汲取速度，促进注射液汲取25，提高局麻效果，并且防止皮下及肌肉注射后组织的破坏。事实上，透亮质酸酶特殊是牛睾丸透亮质酸酶（BTH）制剂，已广泛用于许多领域。由于疯牛病的影响，BTH制剂的应用受到限制，人们希望

17、用微生物来源的透亮质酸酶制剂替代BTH。 在基础探讨方面，透亮质酸酶以及其他的多糖水解酶也是很好的工具酶，可用于多糖的探讨以及用来制备寡聚多糖26。随着人们对HA、低分子HA及HA寡糖生物学意义重要性相识的不断深化，越来越多的证据表明，低相对分子质量HA及HA寡糖的生物活性与HA显著不同，近年许多探讨人员都起先进行酶法降解HA制备寡糖的探讨，分别纯化出单一的寡糖，从而可以进一步对其生物学意义进行探讨。此外，由于透亮质酸酶降解硫酸软骨素时对硫酸基的位置有肯定要求，可用于探讨硫酸软骨素的结构10, 27。 由于S. pyogenes 噬菌体H4489A透亮质酸酶特异性降解HA，且降解速度很快，李振

18、纲等28试图将其用于测定HA样品的含量。通过测定酶解产物在232 nm处的特异性汲取来确定HA含量。结果表明，此方法简便易行、特异性高、价格低廉、作用快速，其精度、灵敏度与常规咔唑法相同，并且检测结果不受HA相对分子质量的影响。 参考文献 1Akhtar M S, Bhakuni V. Streptococcus pneumoniae hyaluronate lyase contains two non-cooperative independent folding/unfolding structural domains: characterization of functional dom

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