淀粉酶菌株的选育、发酵工艺的研究和酶的纯化11744.docx
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1、淀粉酶菌菌株的选选育、发发酵工艺艺的研究究和酶的的纯化摘要:淀淀粉酶是是最早用用于工业业生产并并且迄今今仍是用用途最广广、产量量最大的的酶制剂剂产品之之一,为为了提高高淀粉酶酶的生产产水平,首先通通过淀粉粉培养基基从土壤壤中筛选选出产淀淀粉酶的的活性菌菌株,对对菌株初初步鉴定定后进行行紫外线线诱变,筛筛选出产产量高、性性状优良良的突变变菌株,再再用正交交试验的方方法对其其发酵条条件进行行优化,实验最最后采用用硫酸铵铵沉淀法法初步纯纯化发酵酵得到的的淀粉酶酶并对酶酶活性进进行了测测定。关键词:淀粉酶酶;分离离筛选;紫外线线诱变;优化;提纯1、 引言淀粉酶是是能够分分解淀粉粉糖苷键键的一类类酶的总
2、总称,包包括-淀粉酶酶、-淀淀粉酶、糖糖化酶和和异淀粉粉酶,是是最早用用于工业业生产并并且迄今今仍是用用途最广广、产量量最大的的酶制剂剂产品之之一。淀淀粉酶种种类繁多多,特点各各异,在造纸纸、印染染、酿造造、果汁汁和食品品加工、医医药、洗洗涤剂、工工业副产产品及废废料的处处理、青青贮饲料料及微生生态制剂剂等多种种领域具具有广阔阔的用途途。我国是传传统的农农业大国国,发展淀淀粉深加加工工业业是解决决当前淀淀粉生产产积压的的好出路路,而几几乎所有有淀粉深深加工工工业的基基础都是是以淀粉粉质原料料的水解解作为第第一步,因因此淀粉粉质原料料的液化化情况直直接关系系到产品品后期的的加工工工艺和产产品的质
3、量。所以,改进淀淀粉液化化工艺也也是降低低生产成成本,提提高产品品市场竞竞争能力力的一种种重要手手段。显然,改改进淀粉粉液化工工艺首要要任务就就是提高高淀粉酶酶的生产产水平。那如何提提高淀粉粉酶的生生产水平平呢?我我们知道道,现在在淀粉酶酶主要来来源于植植物和微微生物,并通过过发酵完完成生产产,因此此筛选出出高产、稳稳定的淀淀粉酶产产生菌是是淀粉酶酶生产的的头等大大事。本本文试图图从土壤壤中分离离出产淀淀粉酶的的枯草杆菌菌,通过过紫外线线诱变育育种及发发酵条件件优化来来得到高高产、稳稳定的淀淀粉酶产产生菌株株,并对对发酵得得到的淀淀粉酶进进行初步步提纯,以达达到加深深对发酵酵工程上上游技术术中
4、菌种种选育的的认识、掌掌握紫外外线诱变变育种的的原理和和方法、了了解发酵酵条件对对产物形形成的影影响、熟熟悉发酵酵条件的的优化方方法、掌掌握分光光光度法法测液化化型淀粉粉酶活力力的基本本原理和和方法、掌掌握初步步纯化淀淀粉酶的的方法的的实验目目的。2、材料料与方法法2. 11 实验验材料211 样品:贵贵师大综综合楼附附近的土土壤212 培养基基和试剂剂:淀粉培培养基、牛牛肉膏蛋蛋白胨(斜斜面)、牛肉膏蛋白胨(液体)种子培养基、淀粉酶发酵培养基、生理盐水、碘液、2可溶性淀粉、硫酸铵、乙酸溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液213 仪器设备备:全自自动高压压灭菌锅锅、培养养皿、恒恒温培养
5、养箱、超净工工作台、恒恒温摇床床、离心心机、分分光光度度计、恒恒温水浴浴锅、移移液管、PPH试纸纸、吸耳耳球、玻玻璃棒、量量筒、试试管、试试管架、酒酒精灯、电电子天平平、三角角烧瓶、洗洗瓶、接接种针、接接种环、直直尺、记记号笔等等。2. 22 实实验方法法221 细菌的分分离与初初步鉴定定:将土土壤系列列稀释,把把10-3 、10-44、100-5分别别涂布到到淀粉培培养基上上,27倒置培培养2天天,将长出出的菌落落接入斜斜面。将将细菌从从斜面接接种到淀淀粉培养养基培养养2天,用用碘液染色色,记录透透明圈大大小和菌菌落直径径,计算算D/d值。保保菌供下下次实验验用。222 紫外线线诱变育育种:
6、取活化化后的菌菌种配成成菌悬液液、稀释;倒倒淀粉培培养基平平板,将将菌悬液液涂布其表表面;用用紫外线线处理平平板0、22minn、4miin、66minn、8mmin、110miin,每个处处理2次次重复;放到黑黑暗中倒倒置培养养,377培养488h,分分别计数数诱变组组和对照照组平板板上的菌菌落数,并计算算致死率率;加入入碘液,分分别测量量诱变组组和对照照组菌落落的透明明圈直径径和菌落落直径,计计算D/d值;将D/d值最最大的菌菌种保存存到斜面面培养基基上。223 生产菌菌株摇瓶瓶发酵条条件的优优化22311 培培养基初初始pHH值和装装液量对对产酶的的影响:用1mmol/L盐酸酸或1mmo
7、l/L氢氧化化钠调节节培养基基pH值值,使培培养基的的pH值值为5.0、77.0、99.0,分分装至2250mmL三角角瓶中,每每瓶255mL,灭灭菌,冷冷却后编编号1、22、3,再再接种,37下恒温摇床培养48h(摇瓶装液量分别30、40、50),最后测定发酵液酶活。 编号号处理项1号2号3号PH579装液量304050A660010-1110-222.2.3.22 培培养基碳碳源对产产酶的影影响:在在不含可可溶性淀粉的培养基基中,分别别加入00.5的各种种碳源(可可溶性淀粉、葡葡萄糖、蔗蔗糖),以以硝酸铵铵作为唯唯一氮源源,进行行碳源对对产酶的的影响的的发酵试试验。 处处理结果可溶性淀淀粉
8、葡萄糖蔗糖A660010-1110-222.2.3.33 正正交试验验设计:通过三因因素两水水平的正正交试验验对高产产菌的发发酵条件件进行优优化,建建立高产产菌株的的最佳摇摇瓶发酵酵条件。因素处理接种量淀粉含量量蛋白胨含含量处理一35g/LL5g/LL处理二310g/L10g/L处理三55g/LL10g/L处理四510g/L5g/LL224 淀粉粉酶的初初步提纯及酶活活性的测测定2.2.4.11 淀淀粉酶的的初步提纯:收集集发酵液液,30000rr/minn离心110miin,去去除菌体体,在上上清液中中加入665饱和度度的硫酸酸铵,待待硫酸铵铵充分溶溶解后于于4盐析22h,然然后50000r
9、r/minn离心220miin,得得到初步步纯化的的淀粉酶酶。2.2.4.22 标标准曲线线的制作作和酶活活性的测测定:将将可溶性淀粉稀释释成0.2、0.5、1、1.5和2的稀释液液,按下下表进行行标准曲曲线的制制作和酶酶活性的的测定。管号12345671727374淀粉稀释释液/mL2(0)2(0.2)2(0.5)2(1)2(1.5)2(2)2(2)2(2)2(2)2(2)缓冲液/mL111111111140水水浴保温温5miin蒸馏水/mL1111110000粗酶液/mL000000111140水水浴保温温30mmin,然然后加入入0.55moll/L乙酸100 mLL,混均均吸取反反应液
10、11 mLL碘液/mmL10101010101010101010A6600(平均值值)(711、72、773、774中中加入的的粗酶液液,即为为正交试验验设计中中处理一一、处理理二、处处理三、处处理四所所得的淀淀粉酶液液)注:前前6组的的数据用用于标准准曲线的的制作:以淀粉粉浓度为为横坐标标,吸光光度为纵纵坐标,作作标准曲曲线;后4组组的数据据用于酶酶活性的的测定:测得吸吸光度后后,可从从标准曲曲线中查查出相应应的淀粉粉浓度,求求出被消消耗的淀淀粉量,这这里的酶酶活即为为每毫升升粗酶液液于400,PH6.0的条条件下,每每小时液液化可溶溶性淀粉粉的毫克克数【mmg可溶溶性淀粉粉/mLLh】。3
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