丹红注射液对动脉粥样硬化小鼠主动脉自噬基因Atg13启动子区甲基化及PI3K-Akt-mTORC1信号通路的影响.docx

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1、丹红注射液对动脉粥样硬化小鼠主动脉自噬基因Atgl3启动子区甲基化及PI3K/Akt/mT0RCl信号通路的影响周明学 李思耐刘卫红尚菊菊刘红旭表1 PCR各基因引物序列此外，微管相关蛋白前体LC3被裂解，产生一种活跃的细胞溶质形式(LC3- I ),然后被催化和结合成LC3H。LC3II的相对量可反映自噬体的量，这种基因名称引物序列产物长度/bpAtg3F： 5,-ATGAGCAACGGCAGCCTTTA-3,60R： S-ATCACTTCAGCATGCCTGCA-S1Atgl3F： 5-ATTTCAGAACCCCCCTCAGC-3,60R： 5,-TCATGCACAGCCAGCTTCTC-

2、3,Atg4aF： 5,-AAACCCCTGCTGCTCATTGT-360R： S-GCCCCTAAAGACTGTGGCAT-SmGAPDHF： SGGCAAATTCAACGGCACAGT-S60R： 5，-ACGACATACTCAGCACCGGC3LC3亚型是目前最广泛用来检测自噬体的分子标记10。吕燕妮等11应用系 统生物学方法模拟分析丹红注射液中丹参与红花配伍的分子机制，其机制可能 主要在细胞自噬、脂质代谢等生物学途径上协同发挥防治疾病的作用。本实验 结果说明，丹红注射液可明显促进AS小鼠主动脉Beclinl和LC3II/I的蛋白 表达，以及自噬基因Atgl3、Atg3和Atg4a的mR

3、NA表达。提示促进细胞自噬可 能是丹红注射液抑制AS的重要机制之一。研究发现，PI3K/Akl/mT0R信号通路 是AS形成的重要信号传导通路，该通路激活在自噬中发挥关键的调节作用， mTOR活化后主要调控自噬基因Atgl3表达12。我们研究结果提示，丹红注射 液可能通过抑制Akt在Ser473位点的磷酸化和mTORCl在Ser2448位点的磷酸 化，抑制PI3K/Akt/mT0R信号通路的活性，从而促进自噬基因Atgl3的表达， 促进自噬，发挥抗AS作用。既往活血化瘀抗AS作用机制研究主要集中在调脂、抗炎、保护细胞内皮、降低 血液黏稠度等方面，近年来，随着基因组学和表观遗传研究在心血管研究领

4、域 的开展和深入，从DNA甲基化修饰为代表的表观遗传学角度来探讨活血化瘀中 药的药理机制，为研究活血中药机制研究提供了新的思路与方法13。随着 DNA甲基化修饰与AS之间相关性的揭示，逆转基因的异常甲基化成为治疗AS 的理想靶点。我们课题组既往研究说明，丹红注射液可明显降低AS小鼠血脂水 平，减少AS斑块面积，发挥抗AS作用，其机制可能与降低AS小鼠血清基因组 甲基化水平、抑制AS小鼠血清学和主动脉斑块DNMT1表达有关1。提示丹红 注射液可明显抑制AS,其机制与DNA甲基化调控有关。另有研究说明，DNMT1 基因沉默后可明显改善由振动剪切刺激导致的血管内皮功能紊乱，其机制与抑 制PI3K/A

5、kt/mT0RCl信号通路的活化和诱导自噬有关14,提示抑制DNMT1参 与调控细胞自噬，发挥抗AS作用。上述提示丹红注射液抗AS的机制可能与调 控自噬及相关通路有关。由于Atgl3是自噬发生的关键基因，并受 PI3K/Akt/mT0R信号通路调控，所以，本研究靶向Algl3的DNA甲基化修饰， 探究丹红注射液调控DNA甲基化干预AS的具体机制和干预环节。结果说明，丹 红注射液通过降低AS小鼠主动脉Atgl3启动子区甲基化水平，促进Atgl3基因 表达及自噬，防治AS的机制这一过程中还可能与抑制PI3K/Akt/ mTORCl信号 通路活化有关。综上所述，丹红注射液防治AS的机制可能与降低AS

6、小鼠主动脉Atgl3启动子 区甲基化水平，抑制PI3K/Akt/mTORCl信号通路，促进细胞自噬有关。具体机 制尚需今后深入研究。Reference：1张颖，周明学，李思耐，等.丹红注射液对动脉粥样硬化小鼠主动脉斑块的 干预作用及基因组DNA甲基化水平和甲基化转移酶的影响J.世界中医药， 2017, 12 (2) ： 247-251.2 LIAO X, SLUIMER J C, WANG Y, et al. Macrophage autophagy plays a protective role in advanced atherosclerosisJ. Cell Metab, 2012,

7、15 (4) ： 545-553.3 MIKAELA M B, ROSS T M, ANTHONY W R. Epigenetic modulation in the treatment of atherosclerotic diseaseJ. Frontiers in Genetics, 2014, 364： 1-7.4孙源超，秦训思，陈宏，等.细胞自噬发生的表观遗传调节J.遗传， 2014, 36 (5) ： 447-455.5徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学M. 3版.北京：人民卫生出版 社，2002： 202-204.6陈光，高嘉良，刘咏梅，等.冠心病血瘀证表观遗传学研究进展J.中

8、国中 医基础医学杂志，2017, 23 (9) ： 1336-1339.7 KHAN S, REHMAN R. DNA methylation： Atherosclerosis leading to congenital heart diseasesJ. J Pak Med Assoc, 2019, 69 (1) ： 137- 138.8 YU M, MEISSA D T, COHEN R A, et al. Autophagy and oxidative stress in cardiovascular diseasesfj. Biochimica et Biophysica Acta, 2

9、015, 185： 243-251.9张雨晴，张丽慧，魏尔清.Beclinl在凋亡和自噬中的调节作用J.2015, 31 (4) ： 331-338.10晏浩,徐建军，李文林，等.MicroRNA-30a调控Beclin-1对缺氧复氧乳 鼠心肌细胞的保护效应J.中国病理生理杂志，2012, 28 (4) ： 583-588.11吕燕妮，付龙生，魏筱华.丹参与红花配伍机制的系统生物学分析J.中 国实验方剂学杂志，2015, 21 (5) ： 220-224.12王和峰，翟纯刚，庞文会，等.PI3K/Akt/mT0R信号通路在巨噬细胞自噬 及动脉粥样硬化斑块不稳定中的作用J.中国病理生理杂志，20

10、13, 29(3) ： 390-397.13任攀，周明学，刘卫红，等.丹红注射液治疗心脑血管疾病的药理作用研 究进展J.现代生物医学进展，2016, 16 (31) ： 6197-6200.14 SANG E P, HYE J Y, NAYOUNG S, et al. Inhibition of EHMT2/G9a epigenetically increases the transcription of Bcclinl via an increase in ROS and activation of NF-k Bj. Oncotarget, 2016, 7 (26)： 39796-39808

11、.(-全文完-Summary：目的 觐察丹红注射液对动脉粥样硬化(AS)小鼠自噬基因Atgl3启 动子区甲基化及自噬信号通路PI3K/Akt/mT0RCl的影响，探讨其可能的作用机 制。方法40只8周龄雄性ApoE-/-小鼠高脂饲料喂养6周，随机分为模型 组、阳性对照组和丹红注射液低、高剂量组，每组10只，各给药组给予相应药 物干预。6周后RT-PCR检测AS小鼠主动脉自噬基因Algl3、Alg3和Atg4a的 mRNA 表达;Western blot 检测 AS 小鼠主动脉 Beclinl、LC3H/I、PI3K、 Akt、p-Akt. mTORCl和p-mTORCl的蛋白表达；采用亚硫酸氢

12、盐测序法检测AS 小鼠主动脉自噬基因Algl3启动子区甲基化水平。结果 与模型组比拟，丹红 注射液高、低剂量组小鼠主动脉Bcclinl蛋白表达明显升高，丹红注射液低剂 量组小鼠主动脉LC3H/I表达明显升高(P0.01),丹红注射液高、低剂量组 小鼠主动脉自噬基因Atgl3启动子区甲基化水平明显降低(P0.01),丹红注 射液高、低剂量组小鼠主动脉p-Akt蛋白表达明显降低(P 2 uL dNTP MIX、2 uL DTT 和1 |i L AMV)进行反转录。采用Sybrpremix ex Taq试剂盒(Takara)扩 增，94 预变性5 min, 94 变性30 s, 60 退火10 s,

13、 72 延伸10 s, 共40个循环，72 再延伸5 min。定量RT-PCR中使用特臭性基因表达引物见 表1。数据分析采用2- ACt法进行相对量化。以mGAPDH为内参基因。1. 6 Western blot 检测取小鼠主动脉，试剂盒提取蛋白，采用BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。6%-15% SDS聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白电泳，蛋白别离后恒定电流200 mA转至PVDF 膜。室温5%脱脂奶粉封闭2 h,用相应的一抗(1 ： 1000) 4 C孵育过夜，洗涤 后换HRP标记二抗(1 ： 10 000)室温孵肓2 ho洗涤后采用化学发光试剂盒在 GE magcQuant LAS 4000 mini

14、 超灵敏化学发光成像仪显影，Gel Image ststcm ver. 4. 00对图像进行灰度分析。1.7 亚硫酸氢盐测序法检测选择Atgl3启动子中富含CpG的区域测序。1 ug基因组DNA使用DNA甲基化 试剂盒转化的亚硫酸氢盐。上游引物5 -TTTGAAGAnnGATGTATAGA AATATT- 3,下游引物 5 -ATTATTACCCTCAAAAATA AATACCT-3,扩增产物长度均为 448 bp；使用 MethPrimer ( ： / urogene, org/cgi-bin/methprimer/ methprimer, cgi )设计。用SK814PCR对PCR产物进行

15、纯化,克隆到pUC18-T 载体系统中，转化为SK9307细胞。选择独立的白色菌落，并使用 Genomelabgexp基因分析系统测序。采用亚硫酸氢盐测序DNA甲基化分析软件 对测序数据进行分析。对各实验组中每个CpG位点的平均甲基化百分比进行分 析。1.8 统计学方法采用SPSS11.5统计软件进行分析。计量资料用一x土s表示，组间比拟方差齐 时用方差分析，两两比拟用t检验。P0. 05表示差异有统计学意义。2结果1丹红注射液对模型小鼠主动脉自噬标志性基因LC3II/ I和Beclinl蛋白表 达的影响与模型组比拟，丹红高、低剂量组小鼠主动脉Beclinl蛋白表达明显升高，差 异有统计学意义

16、(P0. 05, P0.05) o结果见图1。1.9 丹红注射液对模型小鼠主动脉自噬基因Atgl3、Atg3和Atg4a mRNA表达 的影响与模型组比拟，丹红高、低剂量组主动脉小鼠自噬基因Algl3、Alg3和Alg4a mRNA表达均显著升高，差异有统计学意义(P0.05) o结果见图2。1.10 丹红注射液对模型小鼠主动脉自噬基因Atgl3启动子区甲基化水平的影响 与模型组比拟，丹红高、低剂量组小鼠主动脉自噬基因Atgl3启动子区甲基化 水平明显降低(P0.01) o结果见图3。1.11 丹红注射液对模型小鼠主动脉PT3K/Akt/mT0RCl信号通路的影响与模型组比拟，丹红低、高剂量组

17、小鼠主动脉p-Akt蛋白表达明显降低，丹红 高剂量组小鼠主动脉p-mTORCl蛋白表达明显降低，差异均有统计学意义(P0. 01) o结果见图4。3讨论AS是心脑血管疾病发病的共同病理基础，血脉瘀阻是心脑血管疾病的共同中医 病机。活血化瘀中药丹红注射液治疗AS表达了中医“脑心同治”理论，见心病 而兼治脑，见脑病同时兼顾心，符合中医整体观念异病同治思想，临床上广泛 用于AS性心脑血管疾病的治疗6。最新研究发现，细胞异常自噬和基因的 DNA甲基化修饰异常是AS发生的重要机制7。自噬是细胞在自噬基因的调控下，利用溶酶体降解细胞内受损细胞器及大分子 物质的过程。在AS病变早期，通过自噬降解细胞内受损结构，以适应炎症、缺 氧等环境改变，延缓AS开展8。Beclinl是细胞自噬的关键调控因子，是自 噬体形成必需分子，可介导自噬相关蛋白定位于吞噬泡，调控自噬体形成9。