灯盏花素对大鼠液压冲击伤性脑水肿水通道蛋白4表达的影响_孙国柱.doc

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1、中华中医药杂志 (原中国医药学报 )2013年 12 月第 28卷第 12期 CJTCMP , December 2013, Vol .28, No. 12 3727 研究报告 灯盏花素对大鼠液压冲击伤性脑水肿水通道 蛋白 4表达的影响 孙国柱，杨连琦，陈盼虎，马波涛，朱小辉，李胜超 （河北医科大学第二医院，石家庄 050000） 摘要： 目的：观察灯盏花素对大鼠液压冲击伤性脑水肿水通道蛋白 4（ AQP4）表达的影响。方法：成年 SD 大鼠 80只，应用 Dixon法制作脑损伤模型，随机分为两组：模型组和干预组，各 40只。干预组应用灯盏花素 90mg/ kg腹腔注射。两组动物均于术后 6、

2、 12、 24h、 3、 7d进行神经功能评分和组织学观察，并用干湿重法、免疫织化 法分别测定水肿脑组织含水量及其 AQP4表达。结果：与模型组比较，干预组大鼠脑组织水肿程度减轻，脑组织 含水量则以 24h、 3d减轻最为明显（ P0.05）；神经功能评分出现明显改善，以 12h、 24h、 3d、 7d 4个时间点最为 显著（ P0.05），同时 AQP4表达也出现不同程度减少，尤以 12h、 24h、 3d、 7d为著（ P0.05）。结论：灯盏花 素能够通过下调 AQP4表达减轻液压冲击脑损伤脑水肿，发挥神经保护作用。 关键词： 灯盏花素；脑损伤 ；液压冲击；水通道蛋白 4；脑水肿 基金

3、资助： 河北省自然基金资助项目（No.C2008001084），河北省科技厅资助项目（ No.08206123D）， 河北省医学科学重点课题（ No.20090091） Effects of breviscapine on AQP4 expression of fluid percussion injury in rats SUN Guo-zhu, YANG Lian-qi, CHEN Pan-hu, MA Bo-tao, ZHU Xiao-hui, LI Sheng-chao ( Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuan

4、g 050000, China ) Abstract: Objective: To investigate the effect of Breviscapine on AQP4 expression of fluid percussion injury in rats. Methods: 80 rats were employed to establish experimental models according to Dixons method and randomly divided into two groups: model group and intervention group,

5、 the later of which were adminstered Breviscapine (90mg/kg) by way of intraperitoneal injection. Nervous function score, brain water content, histological changes, AQP4 expression were observed by Shapira and Wahld method, dry-wet measure, light microscopy, immunohistochemistry at 6, 12, 24h, 3d and

6、 7d after strike respectively. Results: Compared with animals of model group, the pathological changes and water content of edemamtous brain in those of intervention group significantly improved, especially in 24h and 3d after strike (P0.05). Nervous function score increased significantly, especiall

7、y in 24h, 3d and 7d after strike (P0.05). AQP4 immunoreactive expression decreased signifacantly in 24h, 3d and 7d after strike (P0.05). Conclusion: Breviscapine plays a role of neuroprotective effect on brain damage from fluid percussion injury by downregulating AQP4 expression. Key words: Brevisca

8、pine; Brain injury; Fluid percussion; Aquaporin 4; Cerebral edema Fund assistance: Natural Science Foundation Project of Hebei Province (No.C2008001084), Project Funded by Department of Science and Technology of Hebei Province (No.08206123D), Key Medical Project of Hebei Province (No.20090091) 脑 水 肿

9、 是 颅 脑 外 伤 后 的 最 主要 病 理 学 改 变 ， 常 常 引 发 不 可 逆性神 经 损 伤 ， 遗留不 同 程 度 神 经 功 能 障 碍 甚 至 死 亡 ， 是 影 响 预 后 的 主 要 因素 之 一 。 水 通 道 蛋 白 4（ aquaporin 4， AQP4） 是 介 导 脑 组 织 中 水 分 子 双 向 转 运 的 最 主 要 膜 蛋 白 ， 在 脑 外 伤 、 脑 出 血 、 脑 缺 血 以 及 炎 症 所 引 起 的 脑 水 肿 产 生 或 消 退 中 发挥 着 重 要 作 用 1-3。 众 多 中 草 药 经 临 床 验 证 具 有 降 低 脑 血 管 阻

10、 力 、 增 加 脑 血 流 量 、 改 善微 循 环 、 缓 解 脑 水 肿 的 作 用 4-5， 其中 灯 盏 花 素 就 是有显著疗效的中草药之一，但尚缺乏分子生物学证据。 为此，本研究从介导脑水肿的主要膜蛋白 AQP4为切入点， 通过制作大鼠脑挫伤模型并予以灯盏花素干预，探讨灯盏花素 对外伤后脑水肿和 AQP4表达的影响，为灯盏花素缓解外伤性 脑水肿提供理论基础。 材料 1. 动物 成年雄性 SD大鼠 80只，体质量 250-300g，清洁 通讯作者：孙国柱，河北省石家庄市和平西路 215号河北医科大学第二医院神经外科，邮编： 050000，电话： 0311-66002973 E-ma

11、il： A B x x 3728 中华中医药杂志 (原中国医药学报 )2013年 12 月第 28卷第 12期 CJTCMP , December 2013, Vol .28, No. 12 表 1 模型组和干预组脑水含量、神经功能评分和 AQP4表达变化（ - s， n=8） 神经功能评分（分） 脑含水量（ %） AQP4 表达 时间 模型组 干预组 模型组 干预组 模型组 干预组（ OD） 6h 5.17 0.05 6.67 1.37 78.48 0.50 78.47 0.61 0.18 0.02 0.17 0.01 12h 5.67 1.20 7.00 0.63* 79.82 0.78

12、 79.22 0.77 0.26 0.03 0.26 0.02 24h 5.83 0.41 7.33 0.82* 82.54 1.89 80.84 1.08* 0.33 0.02 0.31 0.01* 3d 6.17 0.75 7.50 0.55* 80.61 0.49 79.11 1.14* 0.31 0.02 0.29 0.02* 7d 7.00 0.63 8.33 0.52* 77.64 0.21 77.11 0.98* 0.18 0.01 0.11 0.02* 注 ： 与模 型 组 同 时 间 点 比 较 ， *P 0.05。 级 ， 购于 河 北 医 科 大学 实 验 动 物 中 心

13、 ， 合 格 证 号 ： SCXK（ 冀 ） 2008-1-003。 2. 试 剂 注 射 用 灯 盏 花 素 ， 20mg/支 ， 恒 生 制 药 股 份 有 限公 司 ， 批 号 ： 10100617； 兔 抗 鼠 AQP4多 克 隆 抗 体 购 于 Sigma公 司 ， 兔二 步 法 检 测 试 剂 盒 购 于 Santa Cruz公 司 ， 其 他 试 剂 均 为 进 口 或国 产分 析 纯 。 方法 1. 模 型制 作 及 干 预 将 大 鼠 随 机 分 为 两 组 ： 模 型 组 和 干 预 组 ， 各 40只 ， 每 一 组又 按 造 模 后 6、 12、 24h， 3、 7d分

14、 为 5个 亚 组 ， 每 个 亚 组 8只 。 采用 Dixon法 制作 动 物 模 型 。 干预 组 的 前 3个 亚 组 分别 在 造 模 后 15min给 药 1次 ； 后 2个 亚 组 动物 每 日 给 药 1次 ， 共 给 药 3次 ， 剂 量 为 90mg/kg， 溶 入 5mL 0.9%氯 化 钠 溶 液 ， 一 次 性 腹 腔 注 射 。 标 准 饲 料 喂 养 和 饮 用 纯 净 水 ， 使 用 动 物 专 用 笼 箱 和 洁 净 垫 料 ， 恒 温 （ 20-25） 饲 养 。 2. 动 物 神 经 功 能 评 分 根 据 Shapira和 Wahl的 大 鼠 脑 损 伤

15、 神 经 功 能 评 分 方 法进 行 神 经 功 能 评 分 6， 采用 双 盲 法进 行 。 模 型 组 和 干预 组 于 伤 后 6、 12、 24h、 3、 7d在处 死 前 分 别 评 分 。 3. 标 本 制 作 在 相 应时 间 点 ， 各 动 物 在 氯 胺酮 过 度麻 醉 下 ， 4 多 聚 甲 醛 经 心 灌 注 , 开 颅 取 脑 ， 以 经 过 挫 伤 灶 的 横 线 为 基 线 ， 在基 线 前 侧 取 （ 20 0 50） mg脑 组 织 用 于 测 定 脑 组 织 含 水 量 ， 取 挫 伤 灶 后 （ 断面 跨 挫 伤 灶 ） 约 4mm厚 的 脑 组 织 进

16、行 固 定 和 石 蜡 包 埋 ， 获得的组 织 切 片 行 HE染 色和 免 疫 组 织 化 学 染 色。 分 析 ， 以 P 0.05为 差异 有 统 计 学 意 义 。 结果 1. 动 物 神 经 功 能 评 分 见 表 1。 模 型 组 在 伤 后 1h开 始 ， 评 分 逐 渐 升 高 ， 在 伤 后 12h出 现 拐 点 ， 到 伤 后 24h时 下 降 至 最 低 值 ， 于 伤 后 3d时 有 所 升 高 ， 但 仍 低 于 12h， 随 后 逐 渐 升 高 。 与模 型 组 相 比 较 ， 干预 组 动 物 评 分 随 着时 间 的 进 展 明 显提 高 ， 其 中 12h、

17、 24h、 3d、 7d 4个 时 间 点 与模 型 组 相 对 应时 间 点 的 神 经 功 能 评 分 相 比 较 ， 差异 有 统 计 学 意 义 （ P 0.05） 。 2. 脑组织含水量的测定 见表 1。两组脑组织含水量发展 趋势 一 致 ， 均从 6h开 始增 加 ， 24h达 到 最 大 值 ， 并 持 续 到 3d， 之 后 开 始 下 降 。 与模 型 组 比 较 ， 干预 组 脑 含 水 量除 6h、 12h外 各 时 间 点 均 有 减 轻 ， 以 24h、 3d、 7d减 轻 最 为 明 显 （ P 0.05） 。 3. 组织学观察 见图 1。模型组：损伤后 6h神经元

18、细胞周 围间隙增宽，出现轻度细胞水肿。伤后 12h挫伤坏死组织与周围 边界清楚，灶周水肿加重。 24h水肿范围继续扩大，神经元水肿 达高峰。水肿持续到 3d，但较 24h有所减轻，开始出现明显的胶 质细胞增生并可见新生毛细血管。伤后 7d细胞水肿基本消退， 挫伤坏死组织有明显的瘢痕样改变，胶质细胞仍增生明显 。 4. 干湿法测定脑含水量 标本置电子分析天平（分度值 0.0001g） 称 取 湿 重 （ W） ， 再 经 110 恒 温 烤 箱 烘 烤 24h后 称 取 干 重 （ D） 。 应 用 公 式 ： 脑 组 织 含 水 量 （ %） =（ W-D） /W 100%， 计 算 出 脑

19、组 织 含 水 量 。 5. 免 疫 组 化 观 察 AQP4表 达 采 用 链 霉 菌 抗 生 物 素 蛋 白 过 氧 化 物 酶 免疫 组 织 化学染 色 试 剂 盒 进 行 染 色 。 阴 性 对照分 别用 正 常山 羊 血 清 和 PBS代 替 AQP4一 抗 作 孵 育 ， 其 余 步 骤 同 上 。 以 细 胞 膜 上 出 现 棕 黄 色 粗 颗 粒 或 棕 黄 色 细 腻 颗 粒 为 阳 性 结 果 。 采用 Motic Med 6.0数 码 医 学 图 像 分 析 系 统 进 行图 像 分 析 ， 以 细 胞 平 均 光 密度 值 （ OD） 表 示 AQP4阳 性 表 达 的

20、 强 弱 。 6. 统计方 学 法 采 用 SPSS 11.0专 用 统 计 软 件 进 行 数 据 分 析 。 数 据 用 - s来 表 示 ， 差 异 统 计 学 意 义 检 验 采 用 单 因 素 方 差 图 1 组织学观察模型组 24h（ A）、 3d（ B）大鼠脑水肿程度 （ HE 400） 干预组：各个时间点仍存在着不同程度的脑水肿。与模型 组比较，伤后 6h、 12h无明显区别， 24h、 3d、 7d 3个时间点脑水 肿程度明显减轻， 24h表现为气球样变的细 胞数目明显减少和 细胞外间隙明显缩小， 3d、 7d细胞水肿减轻更为显著，大量胶 质细胞增生明显，纤维组织增多（图 2

21、）。 4. 水 肿 脑 组 织 AQP4表 达 见 表 1。 模 型 组 ： 脑 挫 伤 灶 区 神 经 元 和 胶 质 细 胞 崩 解 坏 死 ， AQP4呈 低 表 达 ； 挫 伤灶 周 水 肿 脑 组 织 AQP4阳 性 表达 增 强 ： 伤 后 6h AQP4表 达 开 始 增 高 ， 24h达 到 高 峰 ， 持 续 至 3d后 表 达 开 始 下 降 ， 伤 后 7d下 降 至 伤 后 6h的 表 A B 中华中医药杂志 (原中国医药学报 )2013年 12 月第 28卷第 12期 CJTCMP , December 2013, Vol .28, No. 12 3729 图 2 组

22、织学观察干预组 24h（ A）、 3d（ B）大鼠脑水肿程度 （ HE 400） 达水平。干预组：挫伤坏死区 AQP4表达未有变化。挫伤灶周水 肿脑组织 AQP4阳性表达强度较模型组减轻：伤后 6h、 12h较模 型组无明显变化，伤后 24h、 3d AQP4表达较模型组明显减 轻 （ P 0.05） ， 伤 后 7d AQP4表 达 显 著 性 低 于 模 型 组 （ P 0.05） 。 讨论 AQP4主 要 分 布于 靠 近 蛛 网 膜 下 腔 、 位 于 血 管 周 围 的 星 形 胶 质 细 胞 表 面 和 星 形 胶 质 细 胞 的 终 足 紧 密包 绕 毛 细 血 管 壁 形 成

23、的 一 层 胶 质 界 膜 上 ， 是胶 质 细 胞 与 脑 脊 液 以 及 血 管 之 间 的 水 调 节和 运 输 的 重 要 结 构 基 础 。 研 究 表 明 ， AQP4与 脑 水 肿 密 切 相 关 。 Rao K V等 7发 现 ， 冲击 伤 胶 质 细 胞胞 膜 AQP4明 显 上 调 ， 给 予 环 己 酰 亚胺 或应 用 siRNA沉 默 下 调 AQP4表 达 能 够 明 显 减轻 胶 质 细 胞 肿 胀 。 Karasu A等 8观 察 到 蛋 白 激 酶 C激 动 剂 佛 二 丁 酸 不 但 明 显 降 低 水 肿 脑 组 织的 水 含 量 ， 而 且 显 著抑制 A

24、QP4的 表 达 ， 认 为 佛 二 丁 酸 通过 抑制 AQP4表 达 而 发挥 减 轻 脑 水 肿 的 作 用 ， 证 实 了 AQP4上 调 是 创 伤 性 脑 水 肿 的 发 病 机 制 。 灯盏花素主要含灯盏乙素、少量灯盏甲素及其他黄酮类成 分，其中前者占 95%以上，具有活血化瘀、通经活络之功效。现 代药理学研究表明，其有扩张脑血管，增加脑血流量、抗血小 板聚集、改善微循环，减轻脑水肿的作用，已经广泛应用于心 脑血管疾病。近年来也有应用于颅脑外伤的报道 9-10，认为灯 盏花素能够改善脑水肿，促进神经功能恢复，缩短病程，但缺 乏水转运结构基础的分子生物学证据。本实验结果发现，灯盏

25、花素干预组的大鼠脑组织水肿趋势与外伤组相似，说明灯盏花 素并没有从根本上改变脑水肿的发展趋势，但能够明显降低脑 组织含水量，组织学观察也证实了这一点，表明灯盏花素能够 减轻液压冲击伤性脑水肿。免疫组化结果证实，灯盏花素能够 抑制水肿脑组织 AQP4表达，与灯盏花素能够减轻脑组织水肿 和脑含水量的规律基本一致，表明灯盏花素减轻液压冲击伤性 脑水肿可能是通过下调 AQP4表达实现的，为临床应用治疗颅 脑外伤提供了水分子转运结构变化的分子生物学证据。 参 考 文 献 1 Keisuke Taya,Christina R.Marmarou,Kenji Okuno,et al.Effect of sec

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