减数分裂关键基因Spo11和Mlh1在鲫鲤杂交鱼中的遗传分析.docx

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1、减数分裂关键基因Spoil和Mlhl在鲫鲤杂交鱼中的遗传分析朱辣 张美文 朱明李琪贺旺超 秦伟玲周毅杨聪明张纯刘少军表1个。基因和初入基因CDS序列的扩增引物序列信息Table 1 The amplification primer sequences qSpoil gene and mlhl gene CDS sequences罂因 名 称 Gene引物序 列 Primer sequence退 火 温 度(3 ：) Annealing temperature 延 伸 时间(min) Extension timeSpoilSpo 11 -F ： 5*-ATGGCTGACC AGTTTATTG W

2、G-31571Spo 11-R： 5-TTATATCCAGCCTCCATAGC-3MlhlMlh 1 -F： SGCTGGAAACCAAGGGACAT-S*562Mlh 1 -R ： 5-AGTTCAGGCAGGCTGGCTAT3表2 4种鱼的加基因CDS序列号Table 2 The CDS serial nunibei of Spoil gene in four fish species鱼种 Fish species序列 号 Serial iiumbei备注 Remark膜上，以5%脱脂牛奶进行封闭，加入1 ： 1000稀释的抗SP011抗体RCCRCC-SP011-KMT629889)分别

3、来自3尾鱼样本CCRCC-SPO 11-2( MT629890) RCC-SPOU-3(MT629891) RCC-2(MN721966)CC(MN598071 )分别来H 3足鱼样本RCC-SPO11-KMT642704)CC-SPOll-2(MT642705)FrSPOil-l-2(MT642707)偏向原始母本(RCC)特征4nATFrSPOll-2-3(MT642709) FrSPOll-3-l(MT642710)FrSPOll-l-l(MT642706) FrSPOll-2-I(MT642708) FrSPOll-3-2(MT642711 ) 4n-SPOll-l-2(MT74222

4、3)偏向原始父本(CC)特征偏向原始一本(RCC)特征4n-SP011-10-I(MT648220) 4n-SPOl bl M (MT648222) 4n-SPOll-l-3(MT648219) 4n-SPOll-10-2( MT648221) 4n-SPOl 1-11-3( MT648224) 4n-SPOl 1-11-2( MT648223)偏向收始父本(CC)特征原始父母本片段簟组特征（Abcam81695）或抗 MLH1 抗体（Abcam92312） , 4 孵育过夜，1XPBST 洗膜 3次，加入1 ： 2000稀释的羊抗兔IgG （AS014, Abclonal公司），室温孵育1

5、h后以1XPBST洗膜3次，加入适量ECL发光液（A ： B=1 ： 1）,然后置于暗室 显影拍照。2结果与分析2. 1 Spoil基因CDS序列克隆及测序分析结果利用NCBI中的BLAST对测序分析获得的4种鱼Spoil基因CDS序列（表2）与 斑马鱼Spoil基因CDS序列（NM_205682.1）进行同源比对分析，结果显示 其相似性均高于86. 4%。同时比对分析原始亲本（RCC和CC）与鲫鲤杂交鱼（F1和4nAT）的Spoil基因CDS序列，旨在了解鲫鲤杂交鱼Spoil基因CDS序 列与原始亲本间的遗传关系，结果说明，RCC、CC、F1和4nAT的Spoil基因 CDS序列绝大局部为1

6、152 bp,仅4nAT中存在1157 bp的CDS序列（图1）。 其中，RCC-Spoil基因和CC-Spoil基因间存在稳定的差异，其CDS序列相似性 为95. 8%96. 0%,但RCC-Spoll基因CDS序列和CC-Spoll基因CDS序列在鲫 鲤杂交鱼中均稳定存在，即F1和4nAT中既存在RCC-Spoil基因CDS序列（相 似性为98.6%99.3%）,也存在CC-Spoil基因CDS序列（相似性为98. 9% 99.8%）。值得注意的是，在F1和4nAT中均稳定获得2种原始亲本的独立遗传 片段，且在4nAT中还检测到原始父母本重组基因片段4n-SP011-H-2（MT64822

7、3）,其与原始母本RCC-Spoil基因对应片段的相似性为96. 2%,与 原始父本CC-Spoil基因对应片段的相似性为93. 7%o每尾鱼取可重复的代表性序列上传，Spoil基因CDS序列的同源比对分析结果详见表3O2. 2 Mlhl基因CDS序列克隆及测序分析结果Mlhl基因CDS序列相对稳定且保守。将所获得重复性高的代表性Mlhl基因CDS 序列上传至NCBI Bankit获取相应序列号（表4）。在原始亲本（RCC和CC） 中，能稳定克隆获得保守性非常高的Mlhl基因CDS序列，其中，RCC-Mlhl基 因 CDS 序列为 2175 bp, CC-Mlhl 基因 CDS 序列为 217

8、2 bpo RCC-Mlhl 基因 CDS 序列与CC-Mlhl基因CDS序列的最稳定差异在于CC较RCC在CDS序列的 10761086 bp中段位置多出TAGTTCCTC碱基序列，且其3端结尾序列也存在 稳定差异，相似性仅为93. 4虬 此外，RCC-Mlhl基因CDS序列终止密码子是TAG,而CC-Mlhl基因CDS序列终止密码子为TGA。RCC-Mlhl基因CDS序列和 CC-Mlhl基因CDS序列在鲫鲤杂交鱼中同样稳定存在，即鲫鲤杂交鱼（F1和 4nAT）中既存在RCC-Mlhl基因CDS序列（相似性为99. 5%）,也存在CC-Mlhl 基因CDS序列（相似性为99.4%）,鲫鲤杂

9、交鱼相应的遗传片段和原始亲本间 仅存在极少的基因位点变异（图2）。Mlhl基因CDS序列的同源比对分析结果 详见表5。RCC和CC的Mlhl基因CDS序列分别编码724和723个氨基酸残基;F1和4nAT 的RCC-Mlhl基因CDS序列均编码724个氨基酸残基，CC-Mlhl基因CDS序列均 编码723个氨基酸残基。使用MegAlign对4种鱼的Mlhl氨基酸序列进行比对 分析，结果如图3所示。由于CC-Mlhl基因CDS序列在10761086 bp中段位 置存在TAGTTCCTC碱基序列，而在RCC-Mlhl基因CDS序列中不存在TAGTTCCTC 碱基序列，说明该片段位点翻译表达出的蛋白

10、序列也存在稳定差异，RCC为X X,而CC为SSSS （图3中以红色框标识）。此外，RCC-Mlhl基因CDS序列结尾 处的AAAAAGAAGAATAAAAAGGAATAG碱基序列与CC-Mlhl基因CDS序列结尾处的TTTGAAAGAT GCTGA碱基序列也存在明显差异，其翻译表达出的蛋白序列在RCC中是TKKKNKKE,在CC中那么为FEXXAX （图3中以黄色框标识）。 可见，Mlhl基因表达在原始父母本中存在稳定差异，且这种差异在鲫鲤杂交鱼 中稳定遗传。2. 3鲫鲤杂交鱼精巢SP011和MLH1蛋白的表达分析结果通过Western blotting检测4种鱼精巢SP011蛋白和MLH1

11、蛋白的表达情况， 结果（图4）发现RCC、CC、F1和4nAT等4种鱼的精巢均能成功表达SP0U蛋 白。SP0U蛋白存在2种剪接亚体形式（SPO11-a和SPO11-B）（蒋涵玮 等，2017）。由图4可看出，RCC的精巢中同时表达2种蛋白亚体，且相对分 子量较大的SP011-B亚体表达量高于相对分子量较小的SPOll-a亚体;4nAT 和CC的精巢中仅表达相对分子量较大的SP011-B亚体（或同时表达极少量的 spoil-a亚体）；F1的精巢中仅表达相对分子量较小的spoil-a亚体。此外， 4种鱼的精巢均能成功表达出MLH1蛋白，且MLH1蛋白相封表达量在4种鱼间 的差异较小，可能与所取精

12、巢组织中含相关时期的初级精母细胞比例有关。3讨论Spoil和Mlhl都是减数分裂的关键基因，在脊椎动物进化过程中相对较保守， 其保障减数分裂正常进行的功能对物种延续具有重要意义。近年来，针对 Spoil和Mlhl等关键基因在模式生物减数分裂过程中的调控机制越来越深入。 Spoil在减数分裂的染色体重组后可使着丝粒解离（Hou et al. , 2021）,并 协同切割产生DNA断裂（Johnson et al. , 2021） ；Mlhl关联信号通路调控减 数分裂同源染色体交叉的产生（Cannavo et al. , 2020） o至今，有关鱼类Spoil和Mlhl的研究主要是作为生殖细胞减数

13、分裂发生的分子标记，通过克 隆、组织定位及基因编辑等探究相关因子在鱼类中的进化关系和表达特征(尚 婉靖等，2016；Zhang et al. , 2020) o远缘杂交鱼需克服生殖障碾，其减数分 裂关键基因能否正常表达是关键。因此，明确能越过生殖障碍的鲫鲤杂交鱼减 数分裂关键基因遗传模式，有利于解析远缘杂交跨越减数分裂生殖障碍的遗传 学基础，为鱼类遗传育种提供重要的理论指导。本研究结果说明，Spoil基因和Mlhl基因在鲫鲤杂交子代中能正常转录及翻译 出结构和功能正常的蛋白，说明这2种基因在鲫鲤杂交鱼中均能正常表达，由 其控制的减数分裂重组和错配修复过程在远缘杂交鱼中均能表达出相关蛋白， 对保

14、证SDB的形成至关重要(Blokhina et al. , 2019)。这也为杂交鱼生殖细 胞最终能完成减数分裂及产生具有功能的配子奠定了重要基础。从CDS序列的 遗传模式来看，Spoil基因和Mlhl基因均较保守，其共同特征是在杂交子代中 稳定获得2种原始亲本的独立遗传片段。对于Spoil基因而言，F1和4nAT既 拥有原始母本RCC-Spoil基因片段，也拥有原始父本CC-Spoil基因片段;对于 Mlhl基因而言，F1和4nAT既拥有原始母本RCC-Mlhl基因片段，也拥有原始父 本CC-Mlhl基因片段。整体上，二者均保持了杂交鱼遗传物质的异源稳定性， 且4nAT是F1多倍化后繁殖30

15、代以上的子代，仍保持这个杂合遗传的特性，与 已报道杂交鱼在染色体组水平保持异源稳定性(Zhang et al. , 2015)的结论 一致。值得注意的是，在4nAT中发现重组型的Spoil基因遗传片段，与尚婉靖 等(2016)研究报道Spoil基因表达模式并非完全保守的结论一致，也暗示 4nAT 较 F1 存在更多的变异性(Wang et al. , 2015；Ye et al. , 2017a, 2017b) o说明这2个保守功能基因的稳定遗传在杂交多倍化过程中能和谐共处，进一步验证杂交多倍化后的异源稳定性特征。在历经30余代以后的4nAT 中检测到Spoil基因的原始父母本重组基因片段4n

16、-SP011-11-2(MT648233),说明异源多倍体的功能基因序列有交流和同化趋势，但具体进 化方向还需在后续子代中进一步验证。鲫鲤杂交鱼原始亲本RCC和CC的Mlhl基因CDS序列稳定差异在于CC较RCC在 10761086 bp中段位置多出TAGTTCCTC碱基序列，且3端结尾序列存在稳定 差异及终止密码子不同，此序列位点翻译表达出的蛋白序列也存在稳定差异。 这种双亲间存在一定差异，在杂交后代中独立表达且最终并未影响蛋白功能的 内在表达调控机制尚有待进一步解析。在SP011蛋白翻译水平上，RCC的精巢 中同时表达出2种蛋白亚体，且相对分子量较大的SP011-B亚体表达量高于相 对分子

17、量较小的SPO11-a亚体;CC和4nAT的精巢中仅表达相对分子量较大的 SPO11-P亚体;F1的精巢中仅表达相对分子量较小的spoil-a亚体。SP011-P 亚体通过与其他因子互作，参与常染色体DSB的产生；而SPOll-a亚体不能与 其他相关因子互作，主要负责性染色体DSB的产生。此外，在DSB产生后的修 复过程中，SP011蛋白最终被移除(蒋涵玮等，2017)。综上所述，F1的精巢 中仅高表达相对分子量较小的SPO11-a亚体，可能与其生殖细胞暂时被阻滞在 DSB产生后的修复阶段，与SP011-a亚体未被及时移除有关；而4nAT由于已完 成减数分裂形成大量精子，导致SP01a亚体表达

18、水平较低。该结论为探讨 F1的生殖阻滞提供了重要参考依据。4结论F1和4nAT能稳定杂合遗传原始亲本RCC的Spoil基因和Mlhl基因，虽然在 CDS序列结构上存在少量差异，但最终都能独立表达相关蛋白，即杂交鱼形成过程中减数分裂关键基因的表达正常可为其跨越生殖障碍打下分子基础。Reference：董然然，陈修云，王岗屹，吕昌乾.2018.贵州草海鲫鱼Spoil基因的克隆、生物信息学和表达分析J.重庆师范大学学报(自然科学版)，35 (4) ： 25- 30. Dong R R, Chen X Y, Wang G Y, L ti C Q. 2018. Cloning, bioinformati

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46、poil mutationJ. Aquaculture Research, 51 (12) ： 4916-4924. doi： 10. 1111/are. 14829.任编辑兰宗宝)一全文完一 代(Fl)和异源四倍体鲫鲤(4nAT),通过分子克隆、序列比对及Western blotting等方法研究Spoil基因和Mlhl基因在鲫鲤杂交鱼中的遗传规律和表 达特征，并分析其与原始父母本间的关系。【结果】RCC、CC、F1和4nAT的 Spoil基因CDS序列绝大局部为1152 bp,仅4nAT中存在H57 bp的CDS序列;在F1和4nAT中均稳定获得2种原始亲本的独立遗传片段，且在4nAT中还

47、检测 到原始父母本重组基因片段4n-SP011T1-2 (MT648223),其与原始母本 RCC-Spoll基因对应片段的相似性为96. 2%,与原始父本CC-Spoil基因对应片 段的相似性为93. 7%,说明Spoil基因表达模式并非完全保守性及4nAT存在遗 传变异性。Mlhl基因CDS序列在鲫鲤杂交鱼中同样稳定存在，表现出稳定的杂 合遗传特征，即F1和4nAT中既存在RCC-Mlhl基因CDS序列(相似性为 99.5%),也存在CC-Mlhl基因CDS序列(相似性为99.4%),鲫鲤杂交鱼相应 的遗传片段和原始亲本间仅存在极少的基因位点变异。Western blotting检测 结果

48、说明，SP011蛋白和MLH1蛋白在鲫鲤杂交子代中均能正常表达。其中， 4nAT的精巢中仅表达相对分子量较大的SPOU-B亚体，而F1的精巢中仅表达 相对分子量较小的SP011-a亚体。【结论】F1和4nAT能稳定杂合遗传原始亲 本RCC的Spoil基因和Mlhl基因，虽然在CDS序列结构上存在少量差异，但最 终都能独立表达相关蛋白，即杂交鱼形成过程中减数分裂关键基因的表达正常 可为其跨越生殖障碍打下分子基础。Key：异源四倍体鲫鲤(4nAT) ； Spoil基因;Mlhl基因；减数分裂；远缘杂交；遗 传模式：S917文献标志码：A ： 2095-1191 (2021) 08- 2251-08Genetic analysis of key genes Spoil and Mlhl controlling meiosis in hybrid fish of Carassius auratus red var. (宇) X Cyprinus carpio L. ( 3 )ZHU La, ZHANG Mei-wen, ZHU Ming, LI Qi, HE Wang-chao, QIN Welling,ZHOU Yi, YANG Cong-hui, ZHANG Chun*, LIU Shao-jun*(State Key Laborator