土霉素发酵工艺26803.docx

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1、生物产品工艺学结课论文1 引言言生物工程程产品工工艺学课课程设计计，一方方面要求求综合应应用生物物、发酵酵工程、代代谢控制制发酵工工程和CCAD制制图等课课程的理理论知识识，以掌掌握微生生物发酵酵中常见见的代谢谢控制方方法、产产品工艺艺的设计计方法以以及设计计步骤，另另一方面面又要根根据设计计对象的的具体特特征，凭凭借设计计者的经经验（或或者借鉴鉴前人的的经验），了了解设计计的诀窍窍，对设设计参数数等做合合理的选选择和优优化，这这往往成成为设计计能否成成功的关关键所在在，也是是设计区区别于习习题的重重要方面面。1.1 土霉素素发展现现状在上世纪纪6070年年代，土土霉素曾曾经在我我国抗菌菌药市

2、场场上占据据着重要要位置，但但自800年代中中后期起起，土霉霉素的市市场就开开始逐渐渐下滑，大大批企业业先后放放弃了生生产。221世纪纪初，全全国土霉霉素产量量已从220世纪纪80年年代的22万吨下下降到1120000吨，目目前的产产量已不不到1万万吨，生生产企业业从几十十个减少少到只有有几个。目目前主要要生产企企业为石石家庄华华曙制药药、内蒙蒙古赤峰峰制药、山山西星火火制药等等。其中中石家庄庄华曙制制药的规规模和产产量最大大，达660000吨左右右，约占占世界总总产量的的1/44。随着土霉霉素产量量的不断断下降，出出口量也也逐年减减少，出出口价格格一路走走低。119955年，我我国土霉霉素出

3、口口价格为为11.5美元元/公斤斤，19998年年为100美元/公斤，220000年已降降到7美美元/公公斤。近近年来，出出口量和和出口价价格还在在下滑。在在国内市市场上，土土霉素除除了作为为生产强强力霉素素等的原原料外，主主要用于于畜禽药药物以及及饲料添添加剂，临临床用药药微乎其其微。在在发达国国家，土土霉素已已基本不不再使用用，发达达国家畜畜牧业中中用的也也是纯度度高的无无菌土霉霉素。我我国生产产的土霉霉素大部部分为低低档产品品，未来来几年出出口形势势将十分分严峻。1.2 土霉素素的应用用（1）土土霉素为为四环类类抗生素素，生产产工艺简简单、生生产成本本较低，可可作为生生产其它它新型抗抗生

4、素的的原料。（2）土土霉素价价格低廉廉，可以以作为饲饲料添加加剂用于于养殖业业。实践践表明：土霉素素用于饲饲料添加加剂，可可以改善善饲料转转化效率率，促进进畜禽生生长，提提高畜禽禽抗疾病病能力。（3）土土霉素是是广谱抗抗生素，对对多数革革兰氏阳阳性菌和和革兰氏氏阴性菌菌均有抗抗菌作用用。临床床上主要要用于肺肺炎，败败血症，斑斑疹，伤伤寒了，淋淋巴肉芽芽肿，砂砂岩及其其他细菌菌性感染染等，对对伤寒有有效，也也可用于于阿米巴巴痢疾和和阴道滴滴虫病患患者。此此外还能能抑制立立克次体体和砂岩岩病毒及及淋巴肉肉芽肿病病毒。2 土霉霉素及发发酵微生生物介绍绍2.1 土霉素素化学式式及性状状土霉素又又名氧四

5、四环素，化化学名是是：(44s,44R，55S，55R，66S，112S）-N-44-二甲甲胺基-1，44，4，5，55，6，111，112-八氢氢，5, 6，110，112，112- 六六羟基-6-甲甲基-11，111-二氧氧代并四四苯-22-甲酰酰胺，为为灰白色色至黄色色的结晶晶粉末，无无臭，味味苦，熔熔点是1180，在空空气中性性质稳定定，在日日光下颜颜色变暗暗在碱性性溶液中中易破坏坏失效。土土霉素的的盐酸盐盐为黄色色结晶，味味苦，熔熔点19901194，有吸吸湿性，但但水分和和光线不不影响其其效价，在在室温下下长期保保存不变变质，不不失效。盐盐酸盐易易溶于水水，溶于于甲醇，微微溶于无无

6、水乙醇醇，不溶溶于三氯氯甲烷和和乙醚，在在酸性条条件下不不稳定。添添加到饲饲料中，在在室温下下保存四四个月，效效价下降降4%9%，制制粒时效效价下降降5%7%1。土霉素化化学式：C222H24N3O9，R=H，RR=CCH3，R=OOH，齐齐结构示示意图如如图1-1所示示： 图11-1 2.2 作用机机理（1） 改变致病病微生物物的结构构和干扰扰其代谢谢过程，如如阻碍细细胞壁的的合成，影影响细胞胞黏膜的的通透性性，阻碍碍蛋白质质的合成成，改变变核酸代代谢。（2） 能抑制动动物肠道道内的有有害微生生物，激激活大肠肠中有利利于营养养物质合合成的微微生物。（3） 土霉素可可使动物物肠壁变变薄，更更有

7、利于于营养物物质的吸吸收和利利用，从从而提高高肠道吸吸收效率率。2.3 发酵微微生物土霉素是是由龟裂裂链霉菌菌产生的的，属于于放线菌菌中的链链霉菌属属，他们们具有良良好的菌菌丝体，菌菌丝体分分支，无无隔膜，直直径约00.41.00米，长长短不一一，多核核。菌丝丝体有营营养菌丝丝、气生生菌丝之之分，孢孢子丝再再形成分分生孢子子。而龟裂链链霉菌的的菌落呈呈灰白色色，后期期生褶皱皱，成龟龟裂状。菌菌丝成树树枝分支支，白色色，孢子子灰白色色，柱形形。3 土霉霉素生物物合成的的代谢调调控土霉素属属于四环环素类抗抗生素，是是一大类类广谱抗抗生素，他他们的化化学结构构中都含含有二甲甲氨基，酰酰胺基，酚酚羟基

8、和和两个含含有酮基基和烯醇醇基的共共轭双键键系统，即即都含有有氢化直直骈四苯苯的基本本结构，具具有共同同的碳架架。四环环素类抗抗生素生生物和成成及调控控过程中中，起始始的化合合物是丙丙二酰胺胺辅酶AA，它同同8个丙丙二酰辅辅酶A分分子重复复缩合脱脱羧，形形成一个个直链化化合物-多酮酮次甲基基链，然然后经过过重复闭闭环等反反应，形形成四环环素类抗抗生素。土土霉素代代谢调控控机制的的控制主主要有磷磷酸盐的的调节作作用、AATP的的调节的的调节等等2。3.1 抗生素素的生物物合成与与糖代谢谢途径的的关系在某些抗抗生素发发酵过程程中，不不同时期期的糖代代谢途径径是不同同的。从从菌体生生长期转转变为抗抗

9、生素分分泌期，糖糖代谢途途径也发发生变化化，可见见，抗生生素的生生物合成成与糖代代谢途径径有着一一定关系系。四环类抗抗生素这这类聚酮酮体衍生生物的合合成，需需要还原原型辅酶酶（NAADPHH），而而且NAADPHH还可能能是限制制因素，它它的浓度度大小决决定体外外醋酸盐盐进入聚聚酮体或或脂肪酸酸的数量量。但是是，NAADPHH又只是是来自戊戊糖循环环，该循循环的酶酶活性的的强弱直直接影响响NADDPH的的产量，因因此，过过量的磷磷酸盐或或通气会会严重干干扰土霉霉素的合合成，使使产生NNADPPH的戊戊糖循环环受阻。3.2 抗生素素的生物物合成与与三羧酸酸循环、脂脂肪酸代代谢的关关系已知四环环类

10、抗生生素的碳碳架，是是由乙酰酰辅酶AA、丙二二酰辅酶酶A合成成的。这这些前体体物质是是糖代谢谢的中间间体或衍衍生物，凡凡是影响响合成抗抗生素的的前体物物质形成成的反应应，都会会影响抗抗生素的的生物合合成。有有些前体体物质，不不仅可供供合成抗抗生素之之用，还还可进入入三羧酸酸循环等等初级代代谢途径径而被消消耗。乙乙酰辅酶酶A既可可与草酰酰乙酸反反应形成成柠檬酸酸，然后后进入三三羧酸循循环而被被氧化，又又可以形形成脂肪肪酸和聚聚酮体，因因此成为为代谢途途径中的的三岔路路口，随随着菌体体代谢机机能的差差异而调调节它的的代谢途途径。还原型辅辅酶（NAADPHH）的不不足可能能是产生生菌选择择合成四四环

11、素的的途径和和停止合合成脂肪肪酸的主主要原因因。因此此，从能能量的观观点来看看，利用用丙二酸酸单位来来合成土土霉素，对对产生菌菌是有利利的。3.3 抗生素素生物合合成与生生物能量量的关系系目前认为为，细胞胞的ATTP（或或EC）很很可能是是控制抗抗生素合合成基因因表达的的一种效效应剂，低低水平的的ATPP可能是是发酵单单位的标标志，高高水平的的ATPP可能抑抑制抗生生素的形形成。3.4 抗生素素发酵的的代谢调调控图（见见附图11）4 土霉霉素发酵酵工艺4.1 菌种的的选育与与制备用微生物物发酵方方法生产产抗生素素，首先先要有一一个性能能良好的的菌种，从从自然分分离的野野生菌种种由于生生产能力力

12、低，往往往不能能满足工工业上的的需求。所所以工业业上常用用的菌种种都是经经过人工工选育，具具备工业业生产要要求，性性能优良良的菌种种。本设设计中，土土霉素发发酵生产产菌株为为龟裂链链霉菌，属属放线菌菌。4.1.1 标标本采集集土壤是微微生物聚聚集最丰丰富的场场所，菜菜园和农农田耗作作层土壤壤含有丰丰富的有有机物常常以细菌菌和放线线菌居多多。采土时时先用小小铲除去去表土，取取5115cmm深处的的土样，选选好35点，每每点取土土10gg混在一一起装入入灭过菌菌的牛皮皮纸袋，并并记录时时间、地地点、植植被等情情况，以以备考察察3。4.1.2 标标本的预预处理由于土霉霉素产生生菌龟裂裂链霉菌菌属放线

13、线菌中的的链霉菌菌属，又又由于放放线菌的的孢子（如如链霉菌菌）更加加耐热，所所以常采采用热处处理方法法减少材材料中的的细菌数数。取到的菌菌样在用用土壤、根根土组成成的培养养基中富富集培养养。要求求：9ccm直径径平皿培培养，加加入355455ml培培养基，培培养基温温度在1100培养1hh或400培养226h。待待培养基基上长出出菌落后后，依据据龟裂链链霉菌菌菌落外观观标准判判断。龟裂链霉霉菌菌落落外观：菌落较较小而致致密，不不易挑取取，菌落落呈皱状状裂纹。孢子丝初旋至螺旋形。孢子长圆形至柱形，表面光滑。 由此可断定为龟裂链霉菌。4.1.3 所所需菌种种的分离离筛选抗生生素生产产菌的方方法包括

14、括抑菌圈圈法、稀稀释法、扩扩散法、生生物自显显影法等等。本设计采采用稀释释法，稀稀释法又又可分为为液体稀稀释法和和固体稀稀释平板板倾注法法。这里采用后者。先先将待分分离的材材料作一一系列的的稀释(如1:10、11:1000、11:10000、11: 1100000)，然然后分别别取不同同稀释度度的溶液液少许，与与已熔化化并冷却却至455的琼脂脂培养基基相混合合摇匀后后，倒入入灭过菌菌的培养养皿中，待待琼脂凝凝固后，保保温培养养一定时时间即可可出现菌菌落。如如果稀释释得当，平平皿上可可出现分分散的单单个菌落落，这个个菌落可可能就是是由一个个细菌或或微生物物繁殖而而成的，随随后挑取取该单个个菌落，

15、或或重复以以上操作作数次，便便可得到到纯培养养。4.1.4 菌菌种的培培养以麸皮、琼脂作为天然培养基，在37保温箱中培养，至培养基中部分出现成熟颜色即可进行保藏。4.2 诱变育育种从自然环环境中分分离的菌菌种的生生产能力力有限，一一般不能能满足生生产的实实际需要要。诱变变育种是是提高菌菌种的生生产能力力，使所所需要的的某一特特性的代代谢产物物过量积积累的有有效方法法之一。诱变育种种的理论论基础是是基因突突变，一一般包括括诱变和和筛选两两个部分分，诱变变育种是是诱变和和筛选过过程的不不断重复复，直到到获得高高产菌株株。4.2.1 出出发菌株株的选择择用来进行行诱变的的出发菌菌株的性性能对提提高诱

16、变变效果和和效率十十分重要要，诱变变出发菌菌株要有有一定的的目标产产物的生生产能力力。由于于野生型型菌株生生产性能能较差，通通常采用用经历过过生产条条件考验验的菌株株，这样样的菌株株队诱变变剂的敏敏感性会会有所提提高。4.2.2 菌菌悬液的的制备在诱变育育种中，所所处理的的细胞必必须是均均匀状态态的单细细胞悬液液。分散散状态的的细胞可可以均匀匀地接触触诱变剂剂，又可可避免长长出不纯纯菌落。由由于在许许多微生生物的细细胞内同同时含有有几个核核，所以以即使用用单细胞胞悬浮液液处理，还还是容易易出现不不纯的菌菌落。有有时，虽虽然处理理的是 单核的的细胞或或孢子，但但由于诱诱变剂一一般只作作用于DDN

17、A双双链中的的某一条条单链，故故某一突突变无法法反映在在当代的的表型上上。由于于上述原原因，故故在诱变变霉菌或或放线菌菌时，应应处理它它们的孢孢子。在实际工工作中，要要得到均均匀分散散的细胞胞悬液，通通常可用用无菌的的玻璃珠珠震荡55minn，来打打散成团团的细胞胞，然后后再用脱脱脂棉过过滤，得得到分散散菌株。菌菌悬液介介质一般般用生理理盐水。4.2.3 诱诱变剂处处理诱变包括括物理、化化学、生生物诱变变，本设设计利用用物理诱诱变，方方法及步步骤如下下：紫外线诱诱变处理理：将制制备好的的菌悬液液于无菌菌培养皿皿中，置置波长为为2533.7nnm，115W的的紫外灯灯下600cm处处开盖，进进行

18、振荡荡照射。4.2.4 突突变菌株株的筛选选诱变处理理后，正正向突变变的菌株株通常为为少数，需需进行大大量的筛筛选才能能获得高高产菌株株。在抗抗生素生生产菌的的选育中中，应筛筛选抗生生素抗性性突变株株。初筛：选选用适合合于抗生生素产生生菌的抑抑制圈法法进行初初筛。待待筛选的的菌株能能分泌产产生某些些能抑制制工具菌菌生长的的物质，或或能分泌泌某种酶酶并将无无毒的物物质水解解成对工工具菌有有毒的物物质，从从而在该该菌落周周围形成成工具菌菌不能生生长的抑抑菌圈。方法：将培养后的单菌落连同周围的小块琼脂用穿孔器取出，以避免其它因素干扰，移入无培养基平皿，继续培养45天，使抑制物积累，此时的抑制物难以渗

19、透到其它地方，再将其移入涂布有工具菌的平板，每个琼脂块中心间隔距离为2厘米，培养过夜后，即会出现抑菌圈。抑菌圈的大小反映了琼脂块中积累的抑制物的浓度高低。选择抑制圈大的菌落接入斜面备用。复筛：将将经过初筛筛后的少少数菌株株接种于于增殖培培养基中中培养113小时时后，接接种于锥锥形瓶发发酵培养养基中进进行往复复式摇床床震荡培培养，即即得到药药瓶种子子。4.3 菌种保保藏菌种的保保藏方法法有：斜斜面菌种种低温保保藏法、沙土管干燥保藏法、甘油封藏法、真空冷冻干燥法等4。本设计采用砂土管干燥保藏法，这种保藏法适用于产生孢子的真丝状真菌和放线菌，或形成芽孢的细菌。4.3.1 保保藏原理理及沙土土管制备备

20、方法沙土管干干燥保藏藏法的原原理是造造成干燥燥的寡营营养条的的保藏条条件。制备方法法：首先先将沙和和土分别别洗净烘烘干并过过筛（一一般沙用用80目目过筛，土土用1000目过过筛），按按沙与土土比例112：11混合均均匀，分分装于小小试管中中，分装装高度约约为1ccm左右右，1221高压间间歇灭菌菌233次，无无菌实验验合格后后烘干备备用。4.3.2 保保藏方法法和操作作步骤方法：将将需保藏藏的菌种种经斜面面培养后后用无菌菌水制成成孢子悬悬液，加加入经灭灭菌处理理的沙和和土的混混合物（或或纯沙亦亦可）作作为载体体，减压压抽去水水分，这这些吸附附有孢子子的干燥燥沙土载载体，在在低温下下保存。操作步

21、骤骤：斜面面孢子先先加灭菌菌蒸馏水水222.5mml，沿沿斜面轻轻刮孢子子后，再再吸0.200.3 ml到到灭菌备备用的沙沙土管中中，在真真空度1100 Pa以以下进行行干燥，直直至沙土土管外貌貌呈松散散状态，然然后低温温（4）保存存。经真真空干燥燥后的沙沙土管，最最好放在在密闭容容器内，一一般保存存期为两两年左右右5。4.4 培养基基的配置置微生物生生长、繁繁殖、代代谢和产产物合成成都需要要营养，人人工配置置的培养养基可以以为微生生物提供供所必须须的营养养，除此此之外，培培养基还还为微生生物的生生长提供供必要的的生长环环境。培养基按按照用途途可以分分成孢子子培养基基、种子子培养基基和发酵酵培

22、养基基。4.4.1 孢孢子培养养基孢子培养养基配置置的目的的是供菌菌种繁殖殖孢子的的，常采采用的是是固体培培养基。对这类培养基的要求是能使菌体生长迅速,产生数量多而且优质的孢子,并且不会引起菌体变异。培养基的营养不要太丰富，特别是有机氮源要低一些，否则孢子不易形成。无机盐的浓度要适当,否则会影响孢子的颜色和数量。应注意培养基的pH值和湿度。4.4.2 种种子培养养基种子培养养基时供供孢子发发芽、生生长和菌菌体繁殖殖的。这这类培养养基碳源源应该提提供速效效碳源如如葡萄糖糖等；氮氮源也要要提供一一些易于于利用的的；磷酸酸盐的浓浓度可以以适当高高一些；总之要要相对丰丰富、完完全、并并要考虑虑能够维维

23、持稳定定的pHH值。最最后一级级种子培培养基的的成分应应该较接接近发酵酵培养基基，以便便种子进进入发酵酵培养基基后，能能迅速适适应发酵酵环境。4.4.3 发发酵培养养基发酵培养养基既要要有利于于生长繁繁殖，防防止菌体体过早衰衰老，又又要有利利于产物物的大量量合成。要要求培养养基的组组成应丰丰富、完完全，碳碳、氮源源要注意意速效和和迟效的的互相搭搭配，少少用速效效营养，多多加迟效效营养，还还要考虑虑适当的的碳氮比比，加缓缓冲剂稳稳定pHH值；并并且还要要有菌体体生长所所需的生生长因子子和产物物合成所所需的元元素、前前体和促促进剂等等。4.5 培养基基的营养养要求4.6.1 水水水是一切切生物生生

24、存的基基本条件件，是所所有培养养基的主主要成分分，也是是微生物物机体的的重要组组成成分分。水是是良好的的溶剂，又又是活细细胞中一一切代谢谢反应的的媒介物物，还可可以维持持细胞中中的渗透透压，同同时，水水的比热热高，又又是热的的良导体体，能有有效地吸吸收代谢谢过程中中产生的的热量，使使细胞温温度不致致于骤然然升高，能能有效调调节细胞胞内的温温度。4.5.2 碳碳源 凡能提供供微生物物营养所所需碳元元素(碳碳架)的的营养物物质称为为碳源。碳碳素是构构成菌体体成分的的主要元元素，又又是产生生各种代代谢产物物和细胞胞内贮藏藏物质的的重要原原料。抗抗生素发发酵中可可选用葡葡萄糖做做为碳源源。4.5.3

25、氮氮源氮源是组组成蛋白白质和核核酸的主主要元素素，酶自自身即为为蛋白质质。因此此，氮源源是必不不可少的的重要原原料。常常用的有有机氮源源油花生生饼粉、豆豆饼粉、棉棉籽饼粉粉、玉米米浆、玉玉米蛋白白粉、蛋蛋白胨、酵酵母粉等等。常用用的无机机氮源有有铵盐、硝硝酸盐和和氨水等等。抗生生素发酵酵中多选选用玉米米浆和黄黄豆饼粉粉作为氮氮源，其其中含有有的磷酸酸肌醇对对土霉素素的生产产有积极极的促进进作用。发发酵补料料过程中中选择用用于辅助助氮源的的氨水。4.5.4 无无机盐类类及微量量元素各种微生生物在生生长繁殖殖和生产产代谢产产物中，需需要磷、镁镁、硫、铁铁、钾等等无机盐盐和微量量元素作作为酶的的激活

26、剂剂、生理理活性物物质的组组成或生生理活性性作用的的调节剂剂。在土霉素素发酵中中，很容容易受到到磷浓度度的影响响，很多多此生代代谢产物物的产生生多受磷磷酸盐浓浓度的影影响，必必须严格格控制。土土霉素发发酵中，选选用碳酸酸钙为原原料来提提供无机机盐和微微量元素素。4.5.5生长长因子和和促进剂剂酶的生产产中所需需的生长长因子大大多由天天然原料料提供。玉玉米浆、麦麦芽汁、豆豆芽汁和和酵母等等，含有有丰富的的生长因因子。促促进剂是是一类刺刺激因子子，它们们并不是是前体或或营养，这这类物质质加入或或可以影影响微生生物的正正常代谢谢，或促促进中间间代谢产产物的积积累，或或提高次次级代谢谢产物的的产量6。

27、4.6 龟裂链链霉菌培培养基及及其培养养条件斜面孢子子培养基基：麸皮皮85%，琼脂脂15%，水1100%种子培养养基(gg/L)：KH2PO40.5592，黄黄豆饼粉粉16.5，葡葡萄糖44.933，碳酸酸钙0.15，硝硝酸钾00.155，玉米米油0.2366，油酸酸甘油酯酯4.002，豆豆油9.0455，硅油油0.0021。发酵培养养基(gg/L)：KH2PO41.663，黄黄豆饼粉粉45.30，葡葡萄糖116.442，碳碳酸钙00.155，硝酸酸钾0.15，玉玉米油00.799，油酸酸甘油酯酯3.442，豆豆油7.53，硅硅油0.0566。发酵培养养基补料料(g/L)：油酸甘甘油酯116.

28、5571，豆豆油199.3333，氨氨水（226%）112.22646。所有培养养基都在在1211，0.1MPPa灭菌菌30mmin。酸性蛋白白酶生产产中，种种子培养养初始温温度控制制在300C左右；发酵全程程31-30C分段培培养。发发酵周期期为1990h。4.7 种子扩扩大培养养及孢子子制备4.7.1 种种子扩大大培养种子扩大大培养是是指将保保存在砂砂土管、冷冷冻干燥燥管处于于休眠状状态的生生产菌种种接入试试管斜面面活化后后，再经经过扁瓶瓶或摇瓶瓶及种子子罐逐级级扩大培培养而获获得一定定数量和和质量的的纯种的的过程。本发酵属属于二级种子子罐扩大大培养，三级发酵。设计流程如下：孢子种种子斜面

29、面孢子种子摇摇瓶一级种子子罐二级种种子罐发酵罐罐4.7.2 制制备母液液斜面孢孢子将保存在在冷冻干干燥管中中的土霉霉素生产产菌，在在无菌室室超净工工作台上上接种于于已灭菌菌的斜面面培养基基上，于于 35536培养，取取出放入入冰箱（226）保存存备用。 4.7.3 制制备子瓶瓶斜面孢孢子将生长好好且在冰冰箱存放放一周以以上的母母瓶取出出，制成成菌悬液液接种于于子瓶斜斜面上，于于 35536恒温室室培养，培培养好的的子斜面面，测摇摇瓶效价价合格后后保存在在26冰箱中中备用。 4.7.4 种种子摇瓶瓶一段时间间后，将将孢子用用无菌水水移接到到装有种子子培养基基的三角角瓶中，在在3437下静置置培养

30、440h，待待长出大大量孢子子后，将将其孢悬悬液接入入一级种种子罐内内进行扩大大培养7。4.8 发酵工工艺控制制微生物发发酵生产产中，必必须研究究生产菌菌种的最最佳发酵酵工艺，如如营养要要求、培培养温度度、pHH条件、对对氧的需需求等，据据此设计计合理的的发酵工工艺，使使生产菌菌种处于于最佳的的产物合合成条件件下，才才能取得得优质高高产的效效果。4.8.1 发发酵过程程中温度度的影响响及控制制对微生物物发酵来来说，温温度的影影响是多多方面的的，可以以影响各各种发酵酵条件，最最终影响响微生物物的生长长和产物物形成。在抗生素素发酵中中，细胞胞生长和和代谢产产物积累累的最适适温度往往往不同同。在生生

31、长初期期，抗生生素还未未开始合合成，菌菌丝体浓浓度很低低时，以以促进菌菌丝体迅迅速生长长繁殖为为目的时时，应该该选择适适于菌丝丝体生长长的温度度当菌丝丝体浓度度达到一一定程度度，到了了抗生素素分泌期期时，此此时生物物合成成成为主要要方面，就就应该满满足生物物合成的的最适温温度，这这样才能能促进 抗生素素的大量量合成。在土霉素素发酵中中，采用用变温控控制，种种子培养养初始温温度控制制在3551C，发酵阶阶段发酵酵温度控控制在33234C，在中中后期保保持较低低的温度度，以延延长抗生生素的分分泌期，放放罐前224h提提高23C培养，能能使发酵酵单位提提高88。4.8.2 发发酵过程程中pHH的影响

32、响及控制制微生物生生长和生生物合成成都有其其最适和和能够耐耐受的ppH范围围，放线线菌生长长的最适适pH范范围是778，土土霉素发发酵用菌菌种龟裂裂链霉菌菌的生长长繁殖阶阶段的最最适pHH范围与与产物形形成阶段段的最适适pH范范围是不不一致的的。其菌菌体生长长最适ppH范围围：6.06.66，产物物形成最最适pHH范围：5.886.11。当接接种后发发酵pHH低于66.4时时就可以以开始通通氨，通通氨量的的多少参参考pHH值，要要求1000小时时前pHH在6.3-66.5，1100小小时候ppH在66.2-6.33，放罐罐前8小小时停止止通氨。一般情况况下，培培养基成成分中(C/NN)高，发酵

33、液倾于酸性，pH低；(C/N)低，发酵液倾向于碱性，pH高。pH与通气量的关系是：通气量大，糖、脂得到完全氧化，最后产物为CO2和H2O；如果通气量不足，糖、脂不完全氧化，则产物为中间产物有机酸，这些使培养基pH会不同程度的降低。不同盐的利用对pH也会产生影响，如（NH4）2SO4的被利用则pH下降；而一些生理碱性盐（如NaNO3）的酸根被利用则导致发酵液pH上升；在碳源严重不足，微生物被迫利用氨基酸的碳架，留下NH3，pH亦可能上升。pH的这些变化情况，常常引起细胞生长和生产环境的变化，对生产带来不利影响。因此生产中常采用一些pH的控制方法，通常有：添加缓冲液维持一定的pH；调节通风量维持发

34、酵液的氧化还原电位于一定范围；调节培养基的原始pH，保持一定的(C/N)；当发酵液pH过高时用糖或淀粉来调节，pH过低时，通过氮调节。4.8.3 发发酵过程程中COO2的影响响及控制制CO2是是微生物物的代谢谢产物，同同时也是是某些合合成代谢谢的一种种基质，它它是细胞胞代谢的的重要指指示。溶溶解在发发酵液中中CO22的对氨氨基酸、抗抗生素等等微生物物发酵具具有刺激激或抑制制作用。土土霉素发发酵中，需需要控制制一个最最佳的CCO2分压，才才能获得得最高产产量。可可以通过过提高通通气量和和搅拌速速率，在在调节溶溶解氧的的同时，还还可以调调节COO2的浓度度，通气气使溶解解氧保持持在临界界值以上上，

35、COO2又可随随着废弃弃排出，使使其维持持在引起起抑制作作用的浓浓度之下下；降低低通气量量和搅拌拌速率，有有利于提提高COO2在发酵酵液中的的浓度。4.8.4 发发酵过程程中溶氧氧的影响响及控制制发酵中可可以改变变通风量量和搅拌拌速率，来来实现对对溶氧的的控制。（1）通通风量的的影响：发酵过过程中，通风量的多少应根据培养基中的溶解氧而定。一般来说，在发酵初期，虽然年轻细胞呼吸强度大，耗氧多，但由于菌体少，相对通气量可以少些；菌体生长繁殖旺盛时期，耗氧多，要求通风量大些；生产旺盛时的通风量因菌种和酶种而定，一般需要强烈通风；但也有例外，通风量的过多反而抑制酶的生成。因此，菌种、酶种、培养时期、培

36、养基和设备性能都能影响通风量，从而影响酶的产量。用于土霉素生产的微生物龟裂链霉菌为好气性微生物，生产上普遍采用自动测定和记录溶解氧的仪表进行控制。土霉素发酵生产过程中，通气比应控制在1:0.8-1.0vvm。（2）搅搅拌的影影响：对对于好气气性微生生物的深深层发酵酵，除了了需要通通气外，还还需要搅搅拌。搅搅拌有利利于热交交换、营营养物质质与菌体体均匀接接触，降降低细胞胞周围的的代谢产产物，从从而有利利于新陈陈代谢。同同时可打打破空气气气泡，使使发酵液液形成湍湍流，增增加湍流流速度，从从而提高高溶解氧氧，增加加空气用用量。当当搅拌速速度主要要因菌体体大小而而异，由由于搅拌拌产生切切应力，易易使细

37、胞胞受损。同同时搅拌拌也带来来一定机机械热，容容易使发发酵温度度发生变变化。搅搅拌速度度还与发发酵液粘粘度有关关。土霉霉素发酵酵生产过过程中，搅搅拌转速速可根据据发酵不不同阶段段的需要要进行调调整，使使溶解氧氧不低于于饱和溶溶解氧浓浓度的330%。4.8.5 发发酵过程程中泡沫沫的影响响及控制制在微生物物好气培培养中，发发酵液为为往往产产生许多多泡沫，这这是正常常现象。泡沫的存在阻碍了CO2的排除，影响溶氧量，同时泡沫过多影响添料，也容易使发酵液溢出罐外。因此，生产上必须采取消泡措施。消除可控制泡沫的方法主要包括机械消沫和消沫剂消沫两大类。机械消沫是利用物理作用，靠机械的强烈振动或压力的变化促

38、使泡沫破碎；消泡剂主要是一些天然的矿物油类、醇类、脂肪酸类、胺类、酰胺类、醚类、硫酸酯类、金属皂类、聚硅氧烷和聚硅酮，其中聚甲基硅氧烷最好。我国常用聚氧丙烯甘油醚或泡敌（聚环氧丙环氧乙烷甘有醚）。理想的消泡剂，其表面相互作用力应低，而且应难容于水，还不能影响氧的传递速率和微生物的正常代谢。土霉素发酵中，一般随着菌体生长繁殖旺盛和抗生素的积累而泡沫上升，因此消泡应视具体情况而定。4.8.6 发发酵过程程中染菌菌的控制制在工业发发酵中，染染菌轻则则影响产产品的质质和量，重重则倒罐罐或停产产，影响响工厂效效益。因因此要严严格无菌菌操作，种种子灭菌菌要彻底底，净化化空气设设备，操操作要慎慎重，设设备灭

39、菌菌要彻底底。若在在前期染染菌，应应重新灭灭菌；中中期染菌菌，应偏偏离杂菌菌生长条条件；后后期染菌菌，可提提前或及及时放罐罐。 4.9 发酵工工艺流程程图（见见附图22）5 土霉霉素提取取工艺5.1 发酵液液的预处处理与固固液分离离预处理目目的是将将难溶于于水的高高价金属属离子螯螯合物溶溶解，使使土霉素素以盐的的形式溶溶解到发发酵液中中。5.1.1 酸酸化（1） 酸化过程程：酸化化过程常常采用草草酸酸化化，使菌菌丝中的的土霉素素释放出出来并生生成溶于于水的盐盐，并且且能析出出草酸钙钙沉淀，从从而除去去发酵液液中的钙钙离子，同同时草酸酸钙能促促进蛋白白质的凝凝结，从从而提高高滤液的的质量。另另外

40、，草草酸属于于弱酸，其其对设备备的腐蚀蚀性要比比硫酸、盐盐酸好。（2） pH的控控制：加加入草酸酸的目的的是释放放菌丝中中的单位位，同时时要保证证土霉素素的稳定定性、成成品的质质量和提提炼成本本。目前前，工业业提炼的的pH控控制在11.62.00范围内内，pHH过高对对单位的的释放不不利，ppH过低低会影响响产品的的质量，同同时增加加产品的的成本9。（3） 发酵液的的去杂：发酵中中存在着着许多有有机和无无机的物物质，加加入净化化剂除去去铁离子子和蛋白白质。去去杂过程程采用的的净化剂剂是黄血血盐和硫硫酸锌，利利用二者者的协同同效应除除去蛋白白质，同同时除去去铁离子子。5.1.2 稀稀释将发酵液液

41、进行适适当的稀稀释，一一般稀释释23倍，有有利于过过滤和脱脱色过程程。5.1.3 过过滤发酵液经经过预处处理后可可以通过过板框过过滤机进进行过滤滤，实现现固-液液分离。工工业上采采用低单单位滤液液和草酸酸水洗滤滤饼以提提高收率率。5.2 脱色与与结晶采用1222-22树脂对对滤液进进行脱色色，其原原理是利利用1222-22树脂为为阳离子子交换树树脂，处处理为氢氢型树脂脂后，所所带的氢氢离子与与色素蛋蛋白中的的氮、氧氧形成氢氢键，对对过滤液液中的色色素有吸吸附作用用，可进进行脱色色。土霉素脱脱色液加加入碱化化剂155%的氨氨水后，调调pH到到等电点点附近，使使土霉素素从脱色色液中直直接沉淀淀出来

42、。5.3 分离洗洗涤与气气流干燥燥将上述结结晶液甩甩滤后用用水淋洗洗，再甩甩干，可可得到湿湿晶体。将的到的的湿晶体体进行气气流干燥燥，采用用进风11401700，出风风7080的气流流进行湿湿晶体的的干燥，便便得到土土霉素碱碱成品。5.4 提取工工艺流程程图（见见附图33）总结课程论文文设计是是培养学学生综合合运用所所学知识识,发现现、提出出、分析析和解决决实际问问题,锻锻炼实践践能力的的重要环环节,是是对学生生实际工工作能力力的具体体训练和和考察过过程。我我们必须须认真对对待，好好好把握握每一个个环节，以以一个工工程师的的要求要要求自己己，让自自己在这这种难得得的机会会中好好好历练自自己，让

43、让自己在在学习和和思考中中充实。通过这次次课程设设计使我我懂得了了理论与与实际相相结合是是很重要要的，只只有理论论知识是是远远不不够的，只只有把所所学的理理论知识识与实践践相结合合起来，从从理论中中得出结结论，才才能真正正为社会会服务，从从而提高高自己的的实际动动手能力力和独立立思考的的能力。在在设计过过程中遇遇到的问问题，可可以说得得是困难难重重，这这毕竟是是专业课课程的设设计，不不能有一一丝的马马虎和不不小心。所所以，难难免会遇遇到过各各种各样样的问题题，同时时在设计计的过程程中发现现了自己己的不足足之处，对对以前所所学过的的知识理理解得不不够深刻刻，掌握握得不够够牢固。通通过这次次课程设

44、设计之后后，一定定要把以以前所学学过的知知识重新新温故。 这次课程设计终于顺利完成了，在设计过程中遇到了很多问题，最后在贾万利老师的辛勤指导下，还有和做同种设计题目的同学的探讨下终于游刃而解了。这是我们意志、耐力和心灵上的胜利，相信这些都必将成为我们人生的宝贵财富。在这次课课程设计计中我学学了很多多知识，不不只是书书本上的的知识，还还有一些些生活中中的道理理，比如如做什么么事情都都要有始始有终，要要坚持到到底。还还要加强强自己的的动手能能力，使使自己知知识更加加充实，比比如要熟熟悉掌握握Worrd的操操作和AAutooCADD绘图的的各种技技巧。最后真挚挚的感谢谢史楠老老师的指指导！谢谢谢！参

45、考文献献1 微生物物工程 曹军卫卫，马辉辉文编著著 北京京：科学学出版社社，20002.82 代谢控控制发酵酵 张克克旭等编编著 北北京：中中国轻工工业出版版社，220088.53 新编编生物工工艺学上上册 俞俊俊堂，唐唐孝宣 北京京化学工工业出版版社 2200554 微生物物工程 曹军卫卫，马辉辉文编著著 北京京：科学学出版社社，20002.85 新编编生物工工艺学上上册 俞俊堂堂，唐孝孝宣 北京化化学工业业出版社社 200056 生物工工程工厂厂设计概概论 吴吴思芳主主编 北北京：中中国轻工工业出版版社，220088.67 生物工工艺原理理 贺小小贤 北北京：化化学工业业出版社社，200038 微生物物工程 曹军卫卫，马辉辉文编著著 北京京：科学学出版社社，20002.89 新编编生物工工艺学下下册 俞俊俊堂，唐唐孝宣 北京化化学工业业出版220055第13页 共14页