蛋白质组学研究进展 [免疫蛋白质组学的研究进展] .docx

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1、蛋白质组学研究进展 免疫蛋白质组学的研究进展 摘要：蛋白质组学与免疫学分析方法结合形成了一门新学科，即免疫蛋白质组学。现从免疫蛋白质组学的由来、方法、技术要点以及应用等方面进行综述，并针对其局限性提出展望。 关键词：免疫蛋白组学；探讨进展 中图分类号：Q939.91文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)03-0050-05 Research Advance in Immunoproteomics HAN Chen (College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China) Abstract：I

2、mmunoproteomics is a new science from the combination of proteomics and immunological analytical methods. The forming process，tools, main technical points and applications of immunoproteomics have been discussed in this paper. Meanwhile, the development of this new science is prospected in terms of

3、its limitations. Key words：immunoproteomics; advance 免疫原性蛋白质始终是微生物学家及医学家探讨的热点。酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫共沉淀及蛋白质印迹（Western blot）等技术都是基于抗原抗体特异结合的原理，用于检测抗原存在与否，及探测一种疾病或一种微生物的免疫蛋白质组。但是，ELISA不能区分不同的免疫原性蛋白质，免疫沉淀则须要大量的抗体，且在抗原鉴定前须要去除抗体。起初，科学家曾试图用抗体从电泳后的固体胶中探测抗原，但因所需抗体量大、操作过程困难且重复性差等缘由进展缓慢。蛋白质从凝胶向膜转移技术的建立，使经凝胶分别后免疫原

4、性蛋白质的探测成为可能，也促进了蛋白质印迹技术的发展。但传统的蛋白质印迹技术由于电泳分别的效果差，及抗原鉴定胜利率低，往往只用于一般的检测、分析，很少用于大规模探测免疫原性蛋白质1。 蛋白质组学的特点是采纳高辨别率的蛋白质分别手段，结合高效率的蛋白质鉴定技术，探讨蛋白质的各种代谢和调控途径2，使分别高辨别率及鉴定高胜利率困难蛋白质成为可能。现代蛋白质组学技术与传统免疫杂交方法相结合产生了一门新兴的交叉学科免疫蛋白质组学（immunoproteomics）3。 1 蛋白质组学 1.1概述 蛋白质组学属蛋白质化学的范畴，蛋白质化学包括探讨蛋白质的结构和功能，通常涉及生物化学和酶学。蛋白质组学重点探

5、讨组成一个大系统的多个不同蛋白质的相互作用，它需对困难混合物进行分析，不是通过测定完整序列进行鉴定，而是在数据库匹配工具帮助下进行部分序列测定。它是系统生物学而不是结构生物学；是鉴定系统的行为而不是鉴定任何单一组分的行为。 “蛋白质组”是一种细胞、组织或完整的生物体所拥有的全套蛋白质4。生命科学的探讨工作主要有4个层次：基因组学（genomics），转录组学（transcriptomics），蛋白质组学（proteomics）和代谢组学（metabolomics）。人类基因组安排（human genomic project）顺当完成之后，后基因组时代（post genome era）来临，从而

6、蛋白质组学成为科学家面临的最大挑战5-7。 蛋白质组学探讨也是对分析手段的挑战。如何同时测定一个生物中大量或全部基因的表达好像通过引入cDNA或寡核苷酸微阵已得以解决。用DNA微阵和相关方法分析基因表达依靠于两个重要工具：聚合酶链反应（PCR）和寡核苷酸与互补序列的杂交。但是没有类似的工具用于蛋白质分析。缘由首先是没有蛋白质PCR等价物，目前不行能有多肽分子类似于核苷酸通过PCR复制的方式复制；其次，蛋白质不能专一性与互补氨基酸序列杂交。 另一个蛋白质组学的特有问题是细胞中每一个蛋白质产物并不肯定只有一种分子实体。这是由于蛋白质翻译后有修饰8。修饰的内容随蛋白质的种类、细胞的调整机制和环境因子

7、改变，很多蛋白质以多种形式存在。对任何特定基因的多种蛋白质产物进行检测和区分的必要性使蛋白质组学在分析方面更具挑战性9。 1.2蛋白质组学的工具 高通量、高灵敏度和规模化的双向凝胶电泳-质谱是目前最流行、最牢靠的技术平台10；酵母双杂交技术已用于探讨蛋白质连锁群和蛋白质功能网络系统。生物信息学方法在蛋白质组学探讨领域已得到有效的利用，其中突出的代表是Eisenberg等联合采纳系统发育分布图（phylogenetic profiles）法、融合蛋白序列（rosetta stone）法和基因邻居（gene neighbor）法，胜利地建立了酵母缄默信息调整子（silencing informat

8、ion regulator，SIR）作用网络和酵母朊病毒（prion）功能连锁网络。 除双向凝胶电泳，其他的蛋白质分别技术包括一维十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 （1D -SDS AGE）、高效液相色谱（HPLC）、毛细管电泳（CE）、等电聚焦（IEF）和亲和层析。最有力的技术是将不同的蛋白质和肽分别技术结合为多维技术，例如离子交换液相层析（LC）与反相高效液相色谱（RP-HPLC）的串联是分别困难肽混合物的有力工具11。 1.3蛋白质组学的应用 1.3.1蛋白质表达谱鉴定生物或细胞的特定状态，如分化、发育状态或疾病状态下蛋白质的表达以及物理、化学刺激下蛋白质的表达。这种信息对于检测药物治疗

9、的潜在靶子极为有用。 1.3.2蛋白质网络谱这是在生物系统中测定蛋白质之间相互作用的蛋白质组学方法。大多数蛋白质在执行功能时与其他蛋白质亲密相关，这些相互作用是通过体外纯化的蛋白质和酵母双杂交系统获得的。通过亲和俘获配对技术与分析蛋白质组学方法相结合，蛋白质组学可以鉴定更困难的蛋白质网络。在细胞中多蛋白质复合物与点到点的信号传导途径有关。在蛋白质网络谱可测定的过程中，全部参加者的状态是蛋白质组学最具远大前景的应用之一。 1.3.3蛋白质修饰谱这是鉴定蛋白质怎样以及在何处得到了修饰。很多蛋白质翻译后的修饰限制着蛋白质的靶向、结构、功能和转换。此外，很多环境化学因素、药物和内源化学因素可产生修饰蛋

10、白质的活性亲电体。修饰蛋白质可用抗体测定，但是一个特定修饰的精确序列位点往往是未知的。蛋白质组学是探讨翻译后修饰的性质和序列专一性最好的方法。此法的扩展允许在一个网络中同时鉴定调整蛋白质的修饰状态，这是蛋白质组学技术的重要扩充12。 2 免疫蛋白质组学的技术要点 2.1二维凝胶电泳 二维凝胶电泳（two-dimensional gel elect-rophoresis，2DE）又称双向凝胶电泳，它的发展使得蛋白质混合物的分别达到高重现性和高辨别率，使定性和定量分析2个或多个细胞或组织标本中的蛋白质成为可能。2DE的出现早于通过基因测序技术检测基因表达的方法，但2DE本身是一种重要的描述性技术，

11、当分别后的蛋白质缺少快速和牢靠的鉴定工具时，它在分子生物学探讨中的应用受到限制。 软电离技术电喷雾离子化 （ESI）和基体协助激光解吸电离 （MALDI）的出现，使质谱成为现代蛋白质科学中最重要的组成部分。基体协助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）、电喷雾离子化串联质谱（ESI-MS/MS）取代了速度较慢、灵敏度较差的Eadman化学降解法，用于分析和鉴定2DE分别所获得的蛋白质样品。此类方法的一般步骤是：先从2DE胶切下待分析的蛋白质斑点，用胰蛋白酶对蛋白质进行胶内消化，然后用质谱技术分析消化后得到的多肽片断，用MALDI-TOF-MS测定酶解后的多肽片断得到肽质量指纹图

12、谱并通过数据库检索来对蛋白质进行鉴定。在同一试验中未鉴定的蛋白质，再用纳升电喷雾串联质谱（nano- ESI-MS/MS）或联机的反相毛细管柱液相色谱电喷雾串联质谱进行自动的数据扫描，肽离子经碰撞诱导裂解（CID）产生的串联质谱图谱，与数据库中肽序列的理论串联质谱图进行对比检索，鉴定蛋白质。 纳升电喷雾串联质谱是基于Wilm和Mann的理论探讨，现已成为分析从1D和2D上分别得到的微量蛋白质的有力工具。电喷雾上样还可在电喷雾接口前用HPLC分别多肽（在线CapLC-ESI-MS/MS）。nano-ESI- MS/MS和在线CapLC-ESI-MS/MS 2种方法是相互补充的，各有优势3。 2.

13、2 半干转印 蛋白质从凝胶中向固相支持物的转移创建了Western免疫杂交探讨方法，由于是在液体环境中进行，它转移速度慢，须要大电流，而大电流易产热，所以试验需在低温下进行，运用很不便利。半干转印解决了这个问题，且避开了缓冲液中不纯杂质向固相膜载体的转移。半干转印法只需将凝胶与膜紧贴，夹在转移缓冲液浸泡过的滤纸中间，然后将它们一起置于石墨电极之间，接通电源即可转移，在室温下12 h即可完成，特别便利。由于SDS在转移环境中与蛋白质可逆结合，假如胶上的蛋白质与SDS已经分别，则它由于失去了电场供应的驱动力而不能转移到膜上；相反，假如蛋白质已经转移到膜上而仍未与SDS分开，则蛋白质可能穿透膜而不能

14、结合到膜上，因此，要限制好半干转印的时间。一般而言，高相对分子质量的蛋白质易丢掉SDS而留在胶中，低相对分子质量的蛋白质则不易丢掉SDS穿透膜。在阴极滤纸的转印缓冲液中补加SDS可促进SDS与蛋白质结合，从而有利于高相对分子质量蛋白质向膜上转移；通过增加杂交缓冲液中的离子强度，增加蛋白质与膜之间的疏水性相互作用，使低相对分子质量蛋白质获得了较好的杂交效率。 2.3免疫芯片 免疫芯片（immunochip）作为一种高通量同步多元检测系统，其检测操作所需样品量少、反应速度快、灵敏度高、稳定性好，在分子诊断学和蛋白质组学领域将会大有作为13。 目前，蛋白质组分析的探讨主要依靠双向电泳和质谱，繁琐且低

15、效，亟需建立简便易行、灵敏、高通量的表达蛋白质分析方法。其中之一就是基于抗体微阵列的蛋白质芯片14。通过抗体工程可以得到各种重组抗体，加上目前商业可得的抗体，将组成数量可观的抗体库，应用这些抗体制造的抗体微阵列免疫芯片即能对含有各种功能基团的蛋白质进行全面快速的分析。 随着芯片微型化技术的发展，微点的尺度进一步缩小至纳米尺度，出现了纳米阵列（nanoarray）免疫芯片。纳米点阵应用原子力显微镜（atom force microscopy，AFM）的针尖制作，纳点（nanospot）直径一般为100350 nm，仅约为微米阵列中微点尺度的1/1 000。它不仅微型化程度高，而且检测程序无需进行

16、分子标记，可干脆用于复合物的测定，与表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）检测方法有相像之处。2002年，美国西北高校的探讨人员利用AFM制作了以免疫球蛋白为捕获探针的纳米阵列免疫芯片，并验证其可与抗免疫球蛋白结合反应。 探针点并非越小越好，当点尺度小到肯定程度时，因每点所含捕获分子数量过少，检测体系将表现出较大的差异性，从而失去统计学意义15。 3 免疫蛋白质组学的临床应用 3.1在糖尿病中的应用 型糖尿病（T1DM）是一种多基因、多病因的自身免疫性疾病，发病特点是选择性且不行逆的破坏胰岛B细胞，导致胰岛素产生障碍，患者终生须要外源性胰岛素。1987年

17、，Nepom等用2DE和免疫沉淀法分析T1MD患者HLA分子，发觉HLA分子存在杂合性。Winer探讨非肥胖型糖尿病（non obesity diabetes，NOD）小鼠和糖尿病患者，通过SELDI-TOF-MS的质谱技术鉴定出胰岛Schwann细胞和Langerhans细胞分泌自身抗体，刺激胶质纤维酸性蛋白。探讨发觉，T1DM发病机制中存在自发免疫系统对抗胰岛神经组织的途径。Nielsen等的体外探讨发觉，B细胞成熟过程中在2 239个蛋白点中135个有差异改变，这是翻译后修饰的结果，这些翻译后修饰的蛋白质是探讨T1DM发病机制的潜在靶位16。 蛋白质组学的探讨技术在提高，将双向电泳技术用

18、于小鼠组织，通过增大2D胶、运用窄范围的pH胶、细胞器分别可以获得超过10 000个蛋白点，远远超过传统方法获得的1 900个蛋白点。用 IL-1探讨胰岛B细胞系的蛋白质组学得到得结论是T1DM发病是多因素、动态的，并非某个基因单独作用的结果。 3.2在肿瘤诊断中的应用 蛋白质组学被用于鉴定癌症诊断的标记物，检测疾病进展和鉴定治疗的靶位。它在发觉癌症的标记物方面具有重要价值，因为蛋白质组反映了细胞内在的遗传程序和干脆的环境影响。美国国立肿瘤探讨所组织的早期疾病探测探讨机构多中心三期临床试验得出结论：通过血清及仪器标准化质控，增加激光解吸电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）是目前最有希望

19、的检测肿瘤早期的方法17。对乳腺癌和卵巢癌检测的敏感性和特异性为93%和91%，较传统的检测标记物癌抗原提高许多18；对前列腺癌检测的敏感性和特异性为83%和97%；国内外学者还用SELDI技术对肺癌、肝癌、胃癌、肠癌、食道癌、鼻咽癌、喉癌、胰腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤进行了检验和探讨，也取得了很好的效果19, 20。 3.3在病原性疾病中的应用 很多感染性疾病如乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒、鼠疫等的抗原尚依靠ELISA、放射免疫法、免疫荧光法等间接测定，用SELDI则可同时干脆检测这些疾病特异性抗原的相对分子质量，并进行窗口期检查，这是其他检测手段无法做到的。 Jungblut等21通过免

20、疫蛋白质组学手段，利用感染早期和晚期患者的血清探讨了嘎氏疏螺旋体的免疫原性蛋白，在验证了传统运用的2个靶标抗原的同时，又找到了2个新的靶抗原。并且在幽门螺杆菌的诊断中，分别用幽门螺杆菌感染不同阶段及其他缘由导致的胃炎患者的血清，探测了幽门螺杆菌不同菌株的免疫原性蛋白，对其感染特异的免疫原性靶标蛋白进行了深化系统的探讨，为其诊断、预防和治疗奠定了良好的基础。 应天翼等22提取福氏贺杆菌2a 2457T全菌蛋白进行不同pH梯度的双向电泳，结合蛋白质印迹技术找寻发生免疫反应的蛋白质。用MALDI-TOF-MS鉴定了19个免疫反应蛋白点，对应于10种蛋白质，胜利建立了福氏贺杆菌2a 2457T的免疫蛋

21、白质组学探讨方法，为找寻爱护性抗原打下了基础。 Pitarch等23通过免疫蛋白质组学手段从白假丝酵母中鉴定到了42个有免疫原性的持家酶。通过进一步的探讨发觉，在念珠菌病发病过程中，磷酸甘油酸激酶与乙醇脱氢酶抗体的产生与刺激人的免疫分化有关，并验证了循环系统中白假丝酵母特异性抗体对念珠菌病发展的抑制作用。他们认为，高浓度的抗烯醇酶抗体的出现标记着患者处于复原期，可作为病情发展的标记物。此探讨为念珠菌病的早期检测及临床跟踪供应了靶标，且可能被用作设计抗真菌药物及疫苗的靶标。 3.4在其他疾病中的应用 英国Rrian Austen探讨小组检测了老年性痴呆（AD）患者的组织和脑脊液，发觉了一种-淀粉

22、样蛋白多肽，并被公认为是人脑产生神经退行性变更的标记物24。用SELDI进一步确定了抗原变异片段，为B型多肽的片段142，相对分子质量为4 511，是引发疾病的关键标记物。 在心血管病的诊断中，Allard等用SELDI技术首次发觉载脂蛋白C-I（ApoC-I）和载脂蛋白C-（ApoC-）可区分缺血性和出血性脑卒中。用SELDI技术测定补体C3链及纤维蛋白原的早期降解蛋白指纹，能更早地发觉心肌梗死。 最近，Chen等提出免疫蛋白质组学应当分为3部分，（1）通过免疫蛋白质组学筛选外膜中具有免疫原性的蛋白质；（2）通过免疫后攻毒的方法鉴定免疫原性蛋白的爱护性；（3）通过其中和实力来确定候选疫苗。根

23、据上述原则，该探讨小组通过试验从嗜水气单孢菌的外膜蛋白中筛选出了爱护性达71.4%的抗原。但探讨者认为，假如只作为诊断靶标，后两步不是必需的，而应通过与其他菌株之间的交叉反应来筛选。 4 展望 目前免疫蛋白质组学已胜利地应用于生物医学的很多领域，如病源性微生物、自身抗原、肿瘤抗原及蛋白质修饰等的探讨；也应用于不同种类免疫反应以及免疫反应过程中不同阶段特异性免疫蛋白质的探讨。其原理还用于蛋白质翻译后修饰的探讨，如通过磷酸化抗体来探测被检蛋白质中磷酸化的状况等。在今后生命科学的相关探讨中，免疫蛋白质组学将应用于更为广泛的领域。 方法学上，二维凝胶电泳-质谱仍是目前最流行和较牢靠的技术，但其通量、灵

24、敏度和规模化均有待进一步加强，一些学者起先重视探讨以色谱/电泳-质谱为主的技术。此外，酵母双杂交技术虽已用于探讨蛋白质连锁群和蛋白质功能网络系统，但尚缺乏快速、高效的手段获得困难蛋白质相互作用的多维信息。蛋白质组的生物信息学探讨虽已有胜利的先例，但其应用范围与精确率仍需提高，所面临的更大挑战是如何综合信息，精确分析蛋白质的相互作用，界定相互作用连锁群。 学术上，在基因组、转录组基础上的蛋白质组全谱探讨，微生物已有胜利的报道，但是在高等生物尤其是哺乳动物尚未见报道，人类组织或细胞的蛋白质组全谱探讨则基本未涉足。此外，人类基因组草图虽已公布，但是，估计的3.5万左右基因中一半以上属理论推想，须要从

25、蛋白质组水平予以检验与确认，因此，开展人类组织或细胞的蛋白质组表达谱的分析势在必行。 受基因调控的细胞内各种信号转导途径之间是相互交织和彼此关联的。虽然近年人们对转导途径以及相互关系的相识取得了进展，但是，针对任一生物体组织、细胞开展全方位的蛋白质组相互作用网络的分析鲜有报道。而此类相互作用网络的揭示对于深刻相识重要生理、病理过程的机制是不行缺少的25。 参考文献 1王军军，王恒，黄留玉. 免疫蛋白质组学及其在病原菌探讨中的应用J. 生物技术通讯，2005，16（3）：313-316. 2Blonder J, Rodriguez-Galan M C, Lucas D A, et al. Pro

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