结冷胶裂解酶在毕赤酵母中的异源表达及其性质和应用.docx

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1、结冷胶裂解酶在毕赤酵母中的异源表达及其性质和应用结冷胶是少动鞘氨醇单胞菌所产的多糖，其分子骨架由B (If 3)-D-葡萄糖、B (l-4)-D-葡萄糖醛酸、B (l-4)-D-葡萄糖和a(1-4)旦-鼠李糖线性四糖重复单元按摩尔比1 ： 1 ： 1 ： 1聚合组成，分子质量达0.5X106 lX106Dal-3o结冷胶寡糖可由结冷胶降解得到，具有益 生活性4、植物诱导抗病性5、提高免疫活性等生物 学功能，其制备具有重要意义。寡糖一般通过物理、化学、 生物(酶)法降解多糖制备，比拟3类方法，酶法特异性强, 产物均一，是较理想的方法7。目前，缺乏有效降解结冷 胶的酶是结冷胶及其寡糖应用的最大障碍

2、。结冷胶裂解酶(EC4. 2. 2. 25,gellanlyase)特异性裂解结冷 胶主链的糖昔键，释放非还原端为不饱和葡萄糖醛酸的葡萄 糖醛基-葡萄糖基-鼠李糖基-葡萄糖四糖单元8。MIYAKE 等9对来自Bacillussp. GL1的结冷胶裂解酶在大肠杆菌中 胞内表达，并对其应用进行了研究。通过基因工程技术获得 重组的功能蛋白，是进行工业用高效蛋白生产的重要途径 10 o除大肠杆菌，目前研究比拟深入的重组蛋白表达系统 还有枯草芽胞杆菌和毕赤酵母(Pichiapastoris)等11。较 其他表达系统，毕赤酵母表达宿主遗传性能稳定、表达外源 蛋白分泌效率高、产物便于别离纯化、诱导型菌株具有

3、较完空白对照。分别取适量粗酶液处理进行SDS-PAGE分析，结 果如图 3-b, P. pastorisGS115-pPIC9K-nGLl. 2 上清液与空 质菌对照相比在分子质量75和45kDa处均有明显的蛋白表 达带。进一步别离纯化重组结冷胶裂解酶，经过SDS-PAGE 电泳检测，所得纯化酶液位置与粗酶液加粗条带一致，大小 正确。但所收集组分未别离开，表现为电泳条带无单条存在, 分析可能是结冷胶裂解酶发生降解。2. 3重组毕赤酵母工程菌的7L发酵罐高密度培养对高酶活力菌株 P. pastorisGS115-pPIC9K-nGLl. 2 进行 7L 发酵罐高密度培养，结果如图4所示，随着发酵

4、的进行，重 组毕赤酵母生物量最高达78. 5g/L,结冷胶裂解酶酶活力达 954. 6U/L,相比于摇瓶表达最高酶活力(266. 4U/L)提高了3. 58 倍。图4重组毕赤酵母7L发酵罐发酵Fig. 4RecombinantP. pastorisfermentationin7Lbioreacto r2. 4结冷胶裂解酶的酶学性质研究2. 4.1重组结冷胶裂解酶反响的最适温度及温度稳定性温度影响酶的空间结构。在一定温度范围内,温度升高，酶反响速率提高；高温或低温都会降低酶的催化效率，温度过 高甚至引起不可逆的蛋白变性21。研究结果见图5-a,在 3050C时，重组结冷胶裂解酶相对酶活力超过80

5、%。其中，相对酶活力在45。时最高，这与原始菌裂解酶性质一致9。 该重组酶温度稳定性结果如图5-b,总体而言，酶活力的降 低同保温时间呈正相关关系；45T下酶活力降低速度相对较 缓，即使放置10h相对酶活力依然大于80%o重组酶对反响 温度和保藏温度要求较高，选择合适的条件是提高寡糖产量 的基础。2. 4. 2重组结冷胶裂解酶反响的最适pH及pH稳定性 pH的改变影响酶分子中具有催化活性的离子基团解离程度, 从而影响酶的催化能力22 o由图5-c可知结冷胶裂解酶最 适pH7. 5,当pH值低于7. 5时，酶活力迅速下降，当pH值 降低到5.0时相对酶活力几近为0o重组酶在弱碱性条件下 容易发挥

6、较大活性，考察重组结冷胶裂解酶的pH稳定性， 反响结果如图5-d所示。从图中明显看出结冷胶裂解酶具有 较大的耐碱范围，这与其最适反响pH结果一致。当pH值处 于7.09.0时，呈现出较为稳定的状态，剩余酶活力高于 80%,相比于原始菌稳定性得到了一定提升9。可能原因是 毕赤酵母的糖基化功能，提高了重组酶的温度稳定性10。 结果说明弱碱环境适合结冷胶裂解酶降解结冷胶。a-最适温度；b-温度稳定性；c-最适pH； d-pH稳定性；e- 金属离子稳定性图5重组结冷胶裂解酶酶学性质Fig. 5Enzymaticpropertiesofrecombinantgellanlyase2. 4. 3重组结冷胶

7、裂解酶反响的金属离子稳定性 金属离子通过与氨基酸残基结合，影响酶活力22。以不含 金属离子的Tris-HCl缓冲液反响体系作为对照，考察不同 金属离子（K+、Ca2+、Na+、Mg2+、A13+、Zn2+、Fe3+、Mn2+） 对重组结冷胶裂解酶酶促反响的影响。结果如图5-e, K+、 Na+对重组酶酶活力既没有促进作用，也没有明显的抑制作 用，影响并不大；Zn2+对重组酶有微弱的促进作用，酶活力 为对照组的 108.9%； Ca2+、Mg2+、A13+、Fe3+和 Mn2+对重 组酶那么有着不同程度的抑制作用，其中A13+抑制作用最强, 相对酶活力仅44%。a-结冷胶寡糖TLC分析图（1-葡

8、萄糖标品；2-蔗糖标品；3- 8 - 环糊精标品；410-30、60、90、120、150、180、Omin 结 冷胶寡糖样品；阴性对照组）；b-结冷胶寡糖 MALDI-TOF-MS 分析图图6结冷胶裂解酶降解产物分析Fig. 6Degreeofpolymerizationofgellanoligosaccharide2. 5结冷胶裂解酶降解产物分析 应用TLC联用MALDI-TOF-MS分析结冷胶裂解酶降解产物。从图6-a中可以看出，结冷胶裂解酶降解结冷胶的产物主要 为一种，且随着时间的延长，产物的种类没有明显的增加。 如图6-b,从降解产物的MALDI-TOF-MS分析结果来看，样品 被有

9、效地离子化，得到阳离子化准分子离子(quasi-molecularion)峰M+Na +m/z=709. 84,与结冷胶的 明显特征单元残基吻合，判断结冷胶的降解产物聚合度大致 为40说明重组结冷胶裂解酶可以有效降解结冷胶，具有特 异性。根据结冷胶分子结构可初步确定该结冷胶寡糖是非还 原端为不饱和葡萄糖醛酸的葡萄糖醛基-葡萄糖基-鼠李糖 基-葡萄糖四糖单元，这与文献报道相符8。因此，利用毕 赤酵母异源表达的结冷胶裂解酶可以有效制备聚合度为4的 结冷胶寡糖。3结论 首次成功将经优化的Bacillussp. GL1来源的结冷胶裂解酶 基因在毕赤酵母中进行了表达，构建了重组P. pastorisGS

10、115-pPIC9K-nGLlo将重组菌在摇瓶水平诱导 表达，获得最高酶活力为266.4U/L。进一步在7L发酵罐中 进行高密度培养，酶活力达954. 6U/L,较摇瓶水平提高了 3. 58倍。通过别离纯化得到结冷胶裂解酶纯酶并对其酶学性 质展开研究，分析结果说明结冷胶裂解酶的最适反响温度为 45,当温度大于45C时酶活力开始迅速下降，在5(TC以 上稳定性较差；结冷胶裂解酶在pH6. 07. 5内酶活力都维 持较高的水平，最适反响pH7. 5,在酸性环境中稳定性比拟 差；Zn2+对酶活力有促进作用，A13+显著抑制酶活力。另外， 以0. 5g/L结冷胶为底物，通过酶促降解反响生成聚合度为4

11、的结冷胶寡糖，为其工业制备提供了一种可行性方案。善的发酵策略，应用广泛12。在毕赤酵母表达系统中，醇 氧化酶A0X1基因强启动子最为常用，受甲醇严格调节，诱 导表达外源蛋白，能到达很高的生产水平13。本研究首次应用毕赤酵母构建表达Bacillussp. GL1来源结 冷胶裂解酶基因，诱使结冷胶裂解酶胞外分泌，发酵扩大生 产。经别离纯化，重组结冷胶裂解酶的酶学性质被测定，并 利用其对结冷胶进行降解，这是对获得大量结冷胶裂解酶用 于寡糖制备和工业应用的初步探索，为进一步开发利用结冷 胶资源，扩大其应用范围提供理论依据。1材料与方法 1. 1实验材料1. 1菌株与质粒 大肠杆菌JM109、毕赤酵母G

12、S115及分泌型酵母表达载体 pPIC9K均购自美国Invitrogen公司，并保藏于糖化学与生 物技术教育部重点实验室。1.1. 2试剂与仪器 限制性核酸内切酶（EcoR I、Not I和Sal I）、DL-10000DNAMarker SanPrep柱式质粒小量抽提试剂盒和Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒等,大连TaKaRa公司； 酵母粉、蛋白陈、甘油和无水甲醇等，国药集团化学试剂有 限公司；结冷胶（食品级），无锡格莱克斯生物科技。 MicroPulser 型电转仪、ClOOOTouch 型 PCR 仪，美国 Bio-Rad公司；3K15型高速冷冻离心机，德国Sigma公司；BioF

13、loll5型7L发酵罐，美NBS 公司；ultrafleXtreme 型质谱仪, 美国 BrukerDa 11onics 公司。1. 1. 3培养基LB培养基(g/L)：蛋白脓10,酵母粉5, NaCllO, pH7.0(固 体培养基加入琼脂粉20g/L) oYPD培养基(g/L)：蛋白蛛20,酵母粉10,葡萄糖20(固体 培养基加入琼脂粉20g/L) oMD 培养基(g/L)： 无氨基酵母氮源 (yeastnitrogenbase, YNB) 13. 4,生物素 4X10-5,葡萄糖 20,琼脂20。MM培养基：YNB13. 4g/L,生物素40 u g/L,甲醇5mL/L,琼 脂 20g/

14、LoBMGY培养基：酵母粉10g/L,蛋白脓20g/L,磷酸钾缓冲液 100mmol/LpH6. 0,YNB13. 4g/L,生物素 40 u g/L,甘油 10g/Lo BMMY培养基：酵母粉lOg/L,蛋白蛛20g/L,磷酸钾缓冲液 100mmol/LpH6. 0,YNB13. 4g/L,生物素 40 u g/L,甲醇 10mL/L。 上述培养基在1210c灭菌20min或115灭菌30mino 1.2实验方法1. 2. 1重组表达质粒的构建及鉴定选取Bacillussp. GL1来源结冷胶裂解酶基因 (GenBankID：AB006853. 1)中已报道的功能活性区域(N-termina

15、lgellanlyase,nGL) 9,根据毕赤酵母 (P. pastorisGS115)的偏好性进行密码子优化后委托生工生 物工程(上海)股份合成结冷胶裂解酶基因(nGLl), 获得商品重组克隆质粒pUC57-nGLl。根据优化后的基因序列 设计引物，分别在引物5,和3端分另1力口上EcoRi和Not I 酶切位点及保护碱基。本研究中PCR扩增体系所用引物如表 1所示。表1本研究所用引物TableIPrimersusedinthisstudy注：下划线局部为酶切位点，小写局部为保护碱基 pUC57-nGLl溶解稀释至一定浓度用EcoR I、Not I双酶切, 经琼脂糖凝胶电泳鉴定、回收、纯化

16、后，进而用T4DNA连接 酶连接到经过相同的工具酶线性化载体pPIC9K上，构建重 组表达质粒pPIC9K-nGLl (图1),并转化到E. coliJM109感 受态细胞中富集。选取含有氨芾抗性LB平板上阳性克隆子， 提取质粒使用EcoR I和Not I进行单酶切和双酶切及菌落PCR鉴定。图1重组表达质粒构建Fig. IConstructionofrecombinantexpressionplasmid1. 2. 2重组毕赤酵母的构建及验证鉴定成功的pPIC9K-nGLl经Sal I酶切线性化后电转化入P.pastorisGS115染色体DNA中，30培养23d,以得到 转化子。采用MD/M

17、M平板点植对照法筛选甲醇快速利用型 (Mut+)表型，进一步通过YPD-遗传霉素(G418)平板筛选优良 的表达菌株14。随机挑取其单菌落，接种于3mLYPD液体 培养基中，3(TC、200r/min过夜培养。以Ezup柱式酵母基 因组DNA抽提试剂盒提取酵母基因组DNA为模板，进行PCR 扩增，然后1.0%琼脂糖凝胶检测PCR结果。PCR鉴定正确的 重组菌经测序验证目的基因整合到酵母基因组中，将测序正 确的菌株命名为 P. pastorisGSU5-pPIC9K-nGLl 并于-40 甘油管中保藏。1. 2. 3重组结冷胶裂解酶活性的测定取适量酶液与Tris-HCl缓冲液(50mmol/L,

18、 pH7.0)混匀，加 入终质量浓度为0. 5g/L的底物结冷胶溶液激活反响，涡旋 振荡lmin,于45水浴反响20min后，煮沸lOmin灭活。酶活力定义为在1mL上述反响体系条件下，Imin转化底物生 成lumol还原糖所需的酶量为一个单位Uo二硝基水杨酸 (3,5-dinitrosalicylicacid, DNS)法测定反响体系中还原 糖浓度15。1. 2. 4重组结冷胶裂解酶的诱导表达与筛选参考Invitrogen公司的毕赤酵母表达系统操作手册16, 挑取构建成功的重组毕赤酵母单菌落接种至50mLBMGY培养 基中,30、200r/min 培养至 0D600=2. 0-6.0, 4、

19、4000Xg 离心5min收集菌体。用lOOmLBMMY培养基重悬并稀释至 0D600=1.0,进行诱导培养；每隔24h加入无水甲醇至终体 积分数为0.5%,发酵120h。发酵结束菌液4。（3、8000Xg离 心5min收集上清液测定酶活力，并用8%SDS-PAGE检测蛋白 质表达情况。1.2. 5重组结冷胶裂解酶的别离纯化发酵液上清液于80%饱和硫酸铁盐析沉降，沉淀物复溶后4 透析过夜，而后经葡聚糖凝胶Sephadex-G100柱层析17。 层析组分加到预先经Tris-HCl缓冲液（0. lmol/L,pH7.0）平 衡的DEAE-52纤维素层析柱，用00. 8mol/LNaCl溶液（同 种

20、缓冲液配制）进行线性梯度洗脱，设置280nm测紫外吸光 值，分管收集18得到纯酶液，待处理样品进行SDS-PAGE 分析。1. 2. 6重组结冷胶裂解酶的酶学性质研究最适反响温度测定。分别在20、25、30、35、40、45、50、 55、60、65、70C条件下检测结冷胶裂解酶酶活性，设最高 酶活力为100%,计算各水平条件下相对酶活力。温度稳定性检测。取等量纯酶液置于45、50、55C水浴锅中 温育，每隔30min取样，于冰上冷却5min,保持其他反响条 件不变，计算相对酶活力。最适反响pH测定。保持其他反响条件不变，反响体系中加 入相同体积的 pH 值为 4. 5、5. 0、5. 5、6

21、. 0、6. 5、7. 0、7. 5、 8. 0、9. 0、9. 5的Tris-HCl缓冲液,设最高酶活力为100%,计算相对酶活力。pH稳定性检测。取等量纯酶液用相同体积的pH值为4、5、 6、7、8、9、10、11的缓冲溶液悬浮，于42放置12h,保 持其他反响条件不变，随后计算相对酶活力。金属离子稳定性检测。在酶反响体系中分别加入0. 1R1O1/LK+、 Na+、Ca2+、Mg2+、A13+、Zn2+、Fe3+、Mn2+,以不加金属 离子Tris-HC1缓冲液的酶的活性为100%,计算相对酶活力。1. 2.7重组毕赤酵母工程菌的7L发酵罐高密度培养接种重组毕赤酵母单菌落于BMGY培养基

22、，30 200r/min 培养24h即得种子液。将2. 7LBMGY培养基加入7L发酵罐内， 经灭菌处理后调节发酵体系维持在30. pH6. 0并稳定2h。 随后加入300mL种子液。对发酵罐的通气量和转速进行调节， 维持溶氧在20%上下，培养2024h,使得发酵液中的所有 甘油被消耗完。此时进入展开甲醇诱导培养阶段，调PH6. 0, 并处于30C条件下。利用同时反响控制方法进行在线测定 19,甲醇质量浓度维持在10g/L。发酵过程中，每间隔6h 需要对典型生化指标进行测定和记录，如生物量和结冷胶裂 解酶活力。1. 2. 8重组结冷胶裂解酶的裂解产物分析 以低质量浓度0. 5g/L的结冷胶溶液

23、为底物进行酶促降解反 应，每隔30min取样，用展开剂(正丙醇：乙酸：水=5 ： 2 ： 3, 体积比)于Merck 薄层板(TLCSilicagel60F254,20X20cm)上 将产物别离进行薄层色谱法(thinTayerchromatography, TLC)分析。为进一步鉴定降解产物，反响结束后样品经 0. 22um水系膜过滤器过滤后以2,5-二羟基苯甲酸 (2,5-dihydroxybenzoicacid, DHB)为基质,利用基质辅助 激光解析电离飞行时间质谱 (matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeoffli ghtmasss

24、pectrometry,MALDI-TOF-MS)在正离子模式下对产 物寡糖的质荷比进行分析，以确定结冷胶寡糖的聚合度20。 1.3数据处理实验设置3次平行，测定参数取平均值，利用0rigin8.5软 件绘制图表并进行数据处理分析。2结果与分析1重组毕赤酵母的构建及筛选阳性克隆子经菌落PCR验证提取重组质粒并分别使用EcoRi和Not I进行单酶切和双酶切验证。结果如图2-a, 在琼脂糖凝胶上EcoR I或Not I单酶切的产物大小约 12827bp的单条带，EcoR I和Not I双酶切分别得到3551bp 的nGLl片段和9276bp的线性pPIC9K片段，说明重组表达 质粒pPIC9K-

25、nGLl构建成功。经电转、筛选，随机选择8株阳性转化子于YPD液体培养基 中扩培，然后取适量菌液PCR验证，结果如图2-b,在琼脂 糖凝胶3551bp的位置上有明显条带即nGLl片段，说明重组 质粒pPIC9K-nGLl已成功电转化入毕赤酵母GS115细胞中， 经进一步测序表示基因工程菌重组 P. pastorisGS115-pPIC9K-nGL 1 构建成功。a-重组表达质粒电泳鉴定图（M-Marker ； l-Not I单切； 2-EcoRi 单切；3-Not I 和 EcoR I 双切;4-菌落 PCR）； b-重 组毕赤酵母电泳验证图（M-Marker； 18-阳性转化子PCR结 果；

26、9-空质菌PCR结果）图2重组毕赤酵母的构建及验证筛选Fig. 2ConstructionandvalidationofrecombinantP. pastor is2. 2重组结冷胶裂解酶的诱导表达及鉴定利用ExPASy预测本研究中结冷胶裂解酶分子质量约为 125kDa。重组毕赤酵母摇瓶诱导表达并测定酶活力，如图3-a, 筛选得到高酶活力菌株P. pas tor i sGS 115-pPIC9K-nGL 1. 2酶 活力为266. 4U/LOa-重组结冷胶裂解酶高酶活菌株筛选（18-阳性转化子；9- 空质菌）；b-重组结冷胶裂解酶SDS-PAGE电泳分析（1-空质 菌上清液；2、3-重组菌上清；4、5-初步纯化后酶液） 图3重组结冷胶裂解酶的诱导表达及鉴定Fig. 3Inducedexpressionandidentificationofrecombinan tgellanlyase用相同方法培养处理空质菌P. pastorisGS115-pPIC9K作为