仪器分析第七章分子发光分析法.ppt

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1、生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第七章第七章 分子发光分析法分子发光分析法 基基态态分分子子吸吸收收能能量量(电电能能、热热能能、化化学学能能或或光光能能等等)，电电子子由由基基态态跃跃迁迁到到激激发发态态，当当电电子子由由激激发发态态返返回回基基态时，以发射态时，以发射电磁辐射电磁辐射(即光即光)的形式释放能量。的形式释放能量。分子发光：分子发光：分子分子发光发光+电能电能化学能化学能光能光能生物活性参生物活性参与化学发光与化学发光 电致发光电致发光化学发光化学发光光致发光光致发光生物发光生物发光荧光荧光磷光磷光生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第七章第

2、七章 分子发光分析法分子发光分析法分子发光：分子发光：光致发光：光致发光：生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第七章第七章 分子发光分析法分子发光分析法第一节第一节 分子荧光、磷光产生基本原理分子荧光、磷光产生基本原理 第二节第二节 荧光光谱与基本特征荧光光谱与基本特征第三节第三节 荧光产率与分子结构的关系荧光产率与分子结构的关系第四节第四节 影响荧光强度的环境因素影响荧光强度的环境因素第五节第五节 分子发光光谱仪结构流程分子发光光谱仪结构流程第六节第六节 定量分析方法定量分析方法生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第一节第一节 分子荧光磷光产生基本原理分子荧光

3、磷光产生基本原理一、分子基态、激发态一、分子基态、激发态二、二、电子自旋多重度电子自旋多重度 三、激发态到基态的能量传递途径三、激发态到基态的能量传递途径生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第一节第一节 分子荧光磷光产生基本原理分子荧光磷光产生基本原理一、分子基态、激发态一、分子基态、激发态激发态：激发态：基基态态分分子子吸吸收收能能量量后后，价价层层电电子子跃跃迁迁到到高高能能级级的的分分子子轨轨道道上上称称为为电电子子激激发发态态。是是分分子子的的亚亚稳稳定状态定状态。基态：基态：在正常状态下，分子处于在正常状态下，分子处于最低能级最低能级的分子轨的分子轨道上称为基态。是分

4、子的道上称为基态。是分子的稳定状态稳定状态。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第一节第一节 分子荧光磷光产生基本原理分子荧光磷光产生基本原理二、二、电子自旋多重度电子自旋多重度 电电子子从从基基态态跃跃迁迁到到激激发发态态，分分子子中中的的电电子子可可以以处处在在不不同同的的自自旋旋状状态态,常常用用电电子子自自旋旋多多重重度度来描述来描述。M=2S+1S是电子的总自旋量子数是电子的总自旋量子数S为各电子自旋量子数的代数和。为各电子自旋量子数的代数和。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第一节第一节 分子荧光磷光产生基本原理分子荧光磷光产生基本原理 单重态（单

5、重态（M=1）：）：电子自旋都配对的分子的电电子自旋都配对的分子的电子态称为单重态，子态称为单重态，用用“S”表示。表示。三三重重态态（M=3）：分分子子中中的的电电子子对对的的电电子子自自旋旋平行的电子态称为三重态，平行的电子态称为三重态，用用“T”表示。表示。S2 T2 S1 T1 S0(洪特规则洪特规则)生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第一节第一节 分子荧光磷光产生基本原理分子荧光磷光产生基本原理三、激发态到基态的能量传递途径三、激发态到基态的能量传递途径 电电子子处处于于激激发发态态是是不不稳稳定定状状态态，返返回回基基态态时时，通通过过辐辐射射跃跃迁迁(发发光光)

6、和和非非辐辐射射跃跃迁迁(热热)等等方方式式失失去去能量。能量。传递途径传递途径辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光磷光磷光内转换内转换系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫非辐射跃迁非辐射跃迁延迟荧光延迟荧光外转换外转换返回速度快的途径，发生几率大返回速度快的途径，发生几率大!生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析e1.振振动动弛弛豫豫：同同一一电电子子能能级级内内以以热热能能量量交交换换形形式式由由高高振振动动能能级级至至低低相相邻邻振振动动能能级级间间的的跃跃迁迁。发发生生振振动动弛豫的时间弛豫的时间10-12 s。(一一)、非辐射跃迁非辐射跃迁第一节第一节 分子荧光磷光产生基本原理分子荧光

7、磷光产生基本原理生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析e2.内内转转换换：相相同同多多重重度度的的电电子子能能级级中中,相相等等能能级级间间的的非辐射能级交换。发生内转换的时间非辐射能级交换。发生内转换的时间10-12 s。第一节第一节 分子荧光磷光产生基本原理分子荧光磷光产生基本原理生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析e3.系系间间跨跨越越：不不同同多多重重态态在在有有重重叠叠的的转转动动能能级级间间的的非非辐辐射射跃跃迁迁。电电子子自自旋旋改改变变，跃跃迁迁禁禁阻阻，通通过过自自旋旋-轨道耦合等跃迁。轨道耦合等跃迁。第一节第一节 分子荧光磷光产生基本原理分子荧

8、光磷光产生基本原理生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析4.外外转转换换：激激发发态态分分子子与与溶溶剂剂或或其其他他分分子子之之间间产产生生相相互互作作用用而而损损失失能能量量回回到到基基态态的的非非辐辐射射跃迁。跃迁。外转换使荧光或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭猝灭”。第一节第一节 分子荧光磷光产生基本原理分子荧光磷光产生基本原理生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析1.荧荧光光发发射射：电电子子由由第第一一激激发发单单重重态态的的最最低低振振动动能能级级基态各振动能级基态各振动能级，发射时间约为发射时间约为10-710-9 s。发射荧光的能量比分子吸

9、收的能量小发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长波长长。e(二二)、辐射跃迁辐射跃迁第一节第一节 分子荧光磷光产生基本原理分子荧光磷光产生基本原理生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析2.磷光发射磷光发射：电子由电子由第一激发三重态的最低振动能第一激发三重态的最低振动能级级基态各振动能级基态各振动能级。发光时间：发光时间：10-4100s。eS0 激发态激发态振动弛豫振动弛豫内转换内转换系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫 T1 S0 第一节第一节 分子荧光磷光产生基本原理分子荧光磷光产生基本原理生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第二节第二节 荧光光谱与基本特征荧

10、光光谱与基本特征一、荧光激发光谱一、荧光激发光谱二、二、荧光发射光谱荧光发射光谱 三、荧光光谱的基本特征三、荧光光谱的基本特征生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第二节第二节 荧光光谱与基本特征荧光光谱与基本特征一、荧光激发光谱一、荧光激发光谱 固固定定荧荧光光波波长长，改改变变激激发发光光波波长长，测测定定不不同同波波长长的的激激发发光光激激发发所所得得到到的的荧荧光光强强度度与与激激发发光光波长曲线。波长曲线。激发光谱相当于荧光物质的吸收光谱。激发光谱相当于荧光物质的吸收光谱。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第二节第二节 荧光光谱与基本特征荧光光谱与基本

11、特征二、二、荧光发射光谱荧光发射光谱 固固定定激激发发波波长长，扫扫描描发发射射波波长长，测测定定化化合合物物发发射射的的荧荧光光强强度度与与不不同同发发射射波长曲线波长曲线。发射光谱的形状与激发波长无关。发射光谱的形状与激发波长无关。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第二节第二节 荧光光谱与基本特征荧光光谱与基本特征三、荧光光谱的基本特征三、荧光光谱的基本特征（一）、一）、Stokes位移位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值激发光谱与发射光谱之间的波长差值。产生原因：产生原因：1.振动弛豫及内转换，产生位移主要原因；振动弛豫及内转换，产生位移主要原因；2.基态不同振动能级

12、间振动弛豫至最低振动基态不同振动能级间振动弛豫至最低振动 能级；能级；3.外转换。外转换。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第二节第二节 荧光光谱与基本特征荧光光谱与基本特征（二）、发射光谱的形状与激发波长无关（二）、发射光谱的形状与激发波长无关 荧荧光光分分子子吸吸收收不不同同波波长长的的能能量量，电电子子跃跃迁迁到到不不同同激激发发态态能能级级，产产生生不不同同吸吸收收带带，但但都都通通过过无无辐辐射射跃跃迁迁方方式式回回到到第第一一激激发发单单重重态态的的最最低低振振动动能能级级再再跃跃迁迁回回到到基基态态各各振振动动能能级级，产产生生波波长一定的荧光。长一定的荧光。生

13、物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第二节第二节 荧光光谱与基本特征荧光光谱与基本特征（三）、荧光发射光谱与吸收光谱成镜像关系（三）、荧光发射光谱与吸收光谱成镜像关系 通通常常荧荧光光发发射射光光谱谱与与它它的的吸吸收收光光谱谱（与与激激发发光光谱形状一样）成镜像对称关系。谱形状一样）成镜像对称关系。S S0 03 32 21 10 0S S1 13 32 21 10 0生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第三节第三节 荧光产率与分子结构的关系荧光产率与分子结构的关系一、分子产生荧光必须具备的条件一、分子产生荧光必须具备的条件二、二、化合物的结构与荧光化合物的结构

14、与荧光 生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第三节第三节 荧光产率与分子结构的关系荧光产率与分子结构的关系一、分子产生荧光必须具备的条件一、分子产生荧光必须具备的条件1.具具有有合合适适的的结结构构：通通常常是是含含有有苯苯环环和和稠稠环环的的刚刚性结构的有机分子；性结构的有机分子；2.具有一定的荧光量子产率。具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（荧光量子产率（）：）：衡量荧光物质发光能力。衡量荧光物质发光能力。它表示激发分子发射出荧光它表示激发分子发射出荧光(或磷光或磷光)的比例。的比例。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第三节第三节 荧光产率与分子结构的关

15、系荧光产率与分子结构的关系f=发射的光量子数发射的光量子数吸收的光量子数吸收的光量子数f=发射发射荧光的分子数荧光的分子数被激发的分子数被激发的分子数生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第三节第三节 荧光产率与分子结构的关系荧光产率与分子结构的关系 荧荧光光量量子子产产率率与与激激发发态态能能量量释释放放各各过过程程的的速速率率常常数数有有关关，可可用用各各过过程程的的速速率率常常数数来来表表示示荧荧光光量子产率：量子产率：荧光发射过程的荧光发射过程的速率常数，取决速率常数，取决于分子结构。于分子结构。各各种种无无辐辐射射跃跃迁迁过过程程的的速速率率常常数数之之和和。取取决决于

16、于分分子子所所处处的的化化学学环环境境，同同时时也也与化学结构有关。与化学结构有关。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第三节第三节 荧光产率与分子结构的关系荧光产率与分子结构的关系二、二、化合物的结构与荧光化合物的结构与荧光（一）、（一）、跃迁的类型跃迁的类型对于有机荧光物质对于有机荧光物质:n*max100 平均寿命平均寿命10-510-7 s；*max104 平均寿命平均寿命10-710-9 s S T速率速率kISC小。小。*是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。*n 生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第三节第三节 荧

17、光产率与分子结构的关系荧光产率与分子结构的关系（二）、（二）、共轭效应共轭效应 产产生生荧荧光光的的有有机机物物质质，都都含含有有共共轭轭双双键键体体系系，共共轭轭体体系系越越大大，荧荧光光量量子子产产率率越越高高，向向长长波波方方向向移动。移动。化合物化合物量子产率量子产率F ex（nm）em（nm）苯苯萘萘蒽蒽丁省丁省0.110.290.460.60205286365390278321400480生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第三节第三节 荧光产率与分子结构的关系荧光产率与分子结构的关系（三）、（三）、刚性平面结构刚性平面结构芴芴f =1联苯联苯f =0.21.减少分

18、子振动，减小外转换。减少分子振动，减小外转换。2.增大分子吸光截面，增大摩尔吸光系数。增大分子吸光截面，增大摩尔吸光系数。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第三节第三节 荧光产率与分子结构的关系荧光产率与分子结构的关系荧光黄荧光黄f =0.92酚酞酚酞f =0生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第三节第三节 荧光产率与分子结构的关系荧光产率与分子结构的关系（三）、（三）、取代基效应取代基效应1.给电子取代基加强荧光给电子取代基加强荧光-HN2，-NHR，-NR2，-OH，-OR，-CN产生产生 p 共轭共轭2.吸电子取代基减弱荧光吸电子取代基减弱荧光-C=O，

19、-COOH，-NO2n*跃迁，跃迁，摩尔吸光系数小，荧光发射弱，系摩尔吸光系数小，荧光发射弱，系间跨跃较大，同样使荧光减弱，相应磷光增强。间跨跃较大，同样使荧光减弱，相应磷光增强。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第四节第四节 影响荧光强度的环境因素影响荧光强度的环境因素一、溶剂一、溶剂二、二、温度温度 三、溶液的三、溶液的PH值值四、四、内滤光作用与自吸现象内滤光作用与自吸现象 五、五、荧光猝灭荧光猝灭 生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第四节第四节 影响荧光强度的环境因素影响荧光强度的环境因素一、溶剂一、溶剂 主主要要表表现现为为溶溶剂剂的的极极性性、氢

20、氢键键、配配位位键键的的形形成成对化合物的荧光发生变化。对化合物的荧光发生变化。*跃跃迁迁类类型型：激激发发态态极极性性比比基基态态大大，溶溶剂剂极极性增大，性增大，跃迁能量降低跃迁能量降低，发生红移，荧光增强。，发生红移，荧光增强。溶溶剂剂与与荧荧光光分分子子形形成成氢氢键键、配配位位键键主主要要影影响响荧荧光光分分子子的的存存在在型型体体、电电离离状状态态，荧荧光光强强度度和和形形状状均均发生很大变化。发生很大变化。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第四节第四节 影响荧光强度的环境因素影响荧光强度的环境因素二、二、温度温度 温度升高，外转换的几率增加。荧光强度降低。温度升

21、高，外转换的几率增加。荧光强度降低。三、溶液的三、溶液的PH值值不同不同PH值下，荧光分子存在形式不同。值下，荧光分子存在形式不同。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第四节第四节 影响荧光强度的环境因素影响荧光强度的环境因素四、四、内滤光作用与自吸现象内滤光作用与自吸现象 自自吸吸现现象象：化化合合物物的的荧荧光光发发射射光光谱谱的的短短波波长长端端与与其其吸吸收收光光谱谱的的长长波波长长端端重重叠叠，产产生生自自吸吸收；如蒽化合物。收；如蒽化合物。内滤光作用内滤光作用：溶液中含有能吸收荧光物质溶液中含有能吸收荧光物质发射的荧光的组分，如色胺酸中的重铬酸钾。发射的荧光的组分，

22、如色胺酸中的重铬酸钾。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第四节第四节 影响荧光强度的环境因素影响荧光强度的环境因素五、五、荧光猝灭荧光猝灭 荧荧光光分分子子与与溶溶剂剂分分子子或或者者其其他他分分子子之之间间存存在在相互作用，使得荧光强度降低或消失的现象。相互作用，使得荧光强度降低或消失的现象。（一）、（一）、碰撞猝灭碰撞猝灭-动态猝灭动态猝灭 M*+Q M +Q +热量热量激发态分子激发态分子猝灭剂猝灭剂生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第四节第四节 影响荧光强度的环境因素影响荧光强度的环境因素（二）、（二）、生成化合物的猝灭生成化合物的猝灭-静态猝灭静态

23、猝灭 M +Q M Q 基态的荧光物质与猝灭剂反应生成非荧光的基态的荧光物质与猝灭剂反应生成非荧光的化合物，导致荧光的猝灭。化合物，导致荧光的猝灭。（三）、（三）、氧的猝灭氧的猝灭 氧氧对对溶溶液液荧荧光光产产生生猝猝灭灭作作用用的的原原因因比比较较复复杂，可能包含着多种机理。杂，可能包含着多种机理。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第四节第四节 影响荧光强度的环境因素影响荧光强度的环境因素（四）、（四）、自猝灭自猝灭 荧光物质的浓度较大时，会使荧光强度降低。荧光物质的浓度较大时，会使荧光强度降低。此外，还有电荷转移猝灭，光化学反应猝灭等。此外，还有电荷转移猝灭，光化学反应猝

24、灭等。自猝灭可能有如下几个原因：自猝灭可能有如下几个原因：1.荧光物质分子之间的碰撞能量损失荧光物质分子之间的碰撞能量损失;2.荧光物质的自吸收荧光物质的自吸收;3.荧光物质分子的缔合。荧光物质分子的缔合。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第五节第五节 分子发光光谱仪结构流程分子发光光谱仪结构流程Cary Eclipse 荧光分光光度计荧光分光光度计荧光、磷光化学荧光、磷光化学/生物发光生物发光美国瓦里安技术中国有限公司美国瓦里安技术中国有限公司生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第五节第五节 分子发光光谱仪结构流程分子发光光谱仪结构流程一、一、荧光分光光度计

25、结构流程荧光分光光度计结构流程 二、二、磷光分光光度计结构流程磷光分光光度计结构流程 生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第五节第五节 分子发光光谱仪结构流程分子发光光谱仪结构流程一、一、荧光分光光度计结构流程荧光分光光度计结构流程 光源光源光源光源氙氙氙氙灯灯灯灯激发单色器激发单色器激发单色器激发单色器样品池样品池样品池样品池光电倍增管光电倍增管光电倍增管光电倍增管数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制发射单色器发射单色器发射单色器发射单色器生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第五节第五节 分子发光光谱仪结构流程分子发光光谱仪结构流程

26、光源光源样品池样品池激发激发单色器单色器检测器检测器数据处理数据处理仪器控制仪器控制发射发射单色器单色器组成：组成：激发光源、样品池、双单色器、检测器。激发光源、样品池、双单色器、检测器。特殊点：特殊点：两个单色器两个单色器，光源与检测器通常成，光源与检测器通常成直角直角。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第五节第五节 分子发光光谱仪结构流程分子发光光谱仪结构流程（一）、（一）、激发光源激发光源 氙灯氙灯、高压汞灯，染料激光器。、高压汞灯，染料激光器。（二）、（二）、单色器单色器 激发单色器：激发单色器：选择激发光波长，选择激发光波长，用以分离出所需用的激发光。用以分离出所需

27、用的激发光。发射单色器：发射单色器：选择荧光发射波长，选择荧光发射波长，用以滤去杂散光、瑞利光、用以滤去杂散光、瑞利光、拉曼光和杂质所发射的荧光。拉曼光和杂质所发射的荧光。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第五节第五节 分子发光光谱仪结构流程分子发光光谱仪结构流程（三）、（三）、样品池样品池 I0ItIf样品池四面透光。样品池四面透光。（四）、（四）、检测器检测器 光电倍增管。光电倍增管。检测器的方向与激发光的方向成直角，以消检测器的方向与激发光的方向成直角，以消除样品池中除样品池中透射光和杂散光的干扰透射光和杂散光的干扰。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析

28、第五节第五节 分子发光光谱仪结构流程分子发光光谱仪结构流程二、二、磷光分光光度计结构流程磷光分光光度计结构流程 光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器斩波器（磷光镜）利用荧光和磷光发射寿利用荧光和磷光发射寿命的差别命的差别通常情况下，样品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶内，通常情况下，样品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶内，来测定低温磷光。来测定低温磷光。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第六节第六节 定量分析方法定量分析方法二、二、定量方法定量方法 一、一、定量依据定量依据 生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第六节第六节 定量分析方法定量分析方法一、

29、一、定量依据定量依据 荧荧光光强强度度 If 正正比比于于吸吸收收的的光光强强度度 Ia 和和荧荧光量子产率光量子产率：由朗伯由朗伯-比耳定律得：比耳定律得：荧光强度荧光强度 If：生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第六节第六节 定量分析方法定量分析方法对于稀溶液，当对于稀溶液，当 bC 0.05（磷光（磷光 bC 0.01）时：）时：If-荧光强度荧光强度I0-入射光强度入射光强度f-荧光量子产率荧光量子产率b-吸收光程吸收光程 -摩尔吸光系数摩尔吸光系数C-物质浓度物质浓度 Ip-磷光强度磷光强度I0-入射光强度入射光强度p-磷光量子产率磷光量子产率b-吸收光程吸收光程 -摩尔吸光系数摩尔吸光系数C 物质浓度物质浓度生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析第六节第六节 定量分析方法定量分析方法二、二、定量方法定量方法 标准曲线法：标准曲线法：FCsFxCxFxFCsCx直接荧光标准曲线法直接荧光标准曲线法荧光熄灭工作曲线法荧光熄灭工作曲线法比比较较法法：在在线线性性范范围围内内，测测定定标标样样和和试试样样的的荧荧光强度，比较。光强度，比较。生物与化学工程学院生物与化学工程学院仪器分析仪器分析