人力资源PCR培训教材4572.doc

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1、标准的PPCR实验室室简介设设计规划划1、 主主体结构构：主体体为彩钢钢板、铝铝合金型型材。室室内所有有阴角、阳角均均采用铝铝合金50内圆角角铝，从从而解决决容易污污染、积积尘、不不易清扫扫等问题题。结构构牢固，线线条简明明，美观观大方，密密封性好好。2、 标准的的三区分分隔和气气压调节节：将PCR过程分分成试剂剂准备、标本制制备和PCR扩增检检测三个个独立的的实验区区。整个个区域有有一个整整体缓冲冲走廊。每个独独立实验验区设置置有缓冲冲区， 同时各各区通过过气压调调节，使使整个PCR实验过过程中试试剂和标标本免受受气溶胶胶的污染染并降低低扩增产产物对人人员和环环境的污污染。可可打开缓缓冲区，

2、缓冲冲区和 PCCR 扩增区区的排风风扇往外外排气，在在实验区区的外墙墙上和各各扇门上上都安装装有风量量可调的的回风口口，空气气通过回回风口向向室内换换气。33、 消毒：在三个个实验区区和三个个缓冲区区顶部以以及传送送窗内部部安装有有紫外灯灯，供消消毒用。在试剂剂准备区区和标本本制备区区 还设置置移动紫紫外线灯灯，对实实验桌进进行局部部消毒。4、 机械连连锁不锈锈钢传递递窗：试试剂和标标本通过过机械连连锁不锈锈钢（不不建议使使用电子子连锁方方式）传传递窗传传递，保保证试剂剂和标本本在传递递过程中中不受污污染（人人物分流流）。55、 地面地面面建议使使用PVC卷材地地面或自自流坪地地面，整整体性

3、好好。便于于进行清清扫，耐耐腐蚀。没有条条件的也也可采用用水磨石石地面，或或大块的的瓷砖（至至少8000mmm8000mm）接接缝需要要小于22mm。6、 照明灯具具要选用用净化灯灯具，能能达到便便于清洗洗、不积积尘的特特点。在在建设的的过程中中应注意意：规范的的安装流流程和全全面的服服务流程程。严格按按照规范范科学设设计的安安装流程程。安装前前需要确确定以下下安装条条件，如如：电源源电压，电电源进线线位置，电电话网络络线进线线位置，进进水水压压，最小小安装空空间，地地面平整整度，通通风孔、进水管管和下水水管的位位置等，理理想状态态的空间间尺寸和和通风口口尺寸。实验室平平面布局局示意图图注：（

4、11）试剂剂准备和和标本制制备区之之间、标标本制备备和扩增增区之间间各有一一传递窗窗传递试试剂等物物品，根根据人物物分流原原则，实实验人员员由缓冲冲间经内内走廊单单向走入入下一区区间。非非实验室室工作人人员不得得进入内内走廊。 （2）三个个区均配配备独立立空调。试剂准准备区和和标本制制备区均均由外向向内排风风，保持持室内正正压。扩扩增区由由内向外外抽风，保保持室内内负压。 （3）三个个区间配配备移动动紫外灯灯各一台台。PCR装装机培训训一、 装机前准准备1、 询问需装装机单位位是否有有移液器器（必须须有的量量称为2ul、25uul、1000ul、2000ul等）、加热装装置(杭州奥奥盛干浴浴锅

5、温度必必须达到到1000)、台式式高速离离心机（转转速必须须达到130000rrpm）、低速速离心机机分离血血清（转转速必须须达到35000rppm以上）、震荡混混匀器。最好再再配掌式式离心机机（用于于将管壁壁上液体体甩到管管底）否否则只能能用手甩甩。2、 自带物品品：移液液器tip头（2000ul的黄枪枪头和10uul的小枪枪头）、薄膜手手套、乳乳胶手套套、0.55ml离心管管、1.55ml离心管管、离心心管架。如有必必要可自自带移液液器，规规格分别别为：0.55-100ul、5-550ull、20-2000ul、1000-10000uul。3、 如果要自自带试剂剂，一定定要领取取乙肝（HB

6、V）荧光光定量核核酸检测测试剂盒盒（罗氏氏专用试试剂盒），还还要配套套带好免免抽提标标准品（两两盒试剂剂配一套套免抽提提标准品品）。4、 清点设备备：PCR仪一台台、电脑脑主机一一台、电电脑显示示器一台台、打印印机一台台。二、 路上注意意事项1、 PCR仪仪一定要要小心轻轻放、保保持正面面向上，千千万不能能倒置。2、 如果携带带试剂盒盒，要在在泡沫箱箱中放入入冰袋，保保持低温温保存。三、 装机1、 查看场地地，PCR实验室室最好能能分为三三个：样本处处理（加加样）室室、反应液液配制室室、扩增室室。2、 将电脑显显示器、主机、打印机机和PCR仪连接接好，查查看是否否可正常常运行。3、 将装有试试

7、剂盒的的泡沫箱箱打开，把把试剂盒盒以及免免抽提的的标准品品存放入入-20的冰箱箱，如马马上使用用，可存存放在44的冰箱箱待用。四、 实验（一）标标本处理理：在样样本处理理室进行行，处理理标本时时需要戴戴乳胶手手套。1、 打开加热热装置，把把预设温温度调到到1000。2、 标本由装装机单位位提供，可可选取阳阳性和阴阴性标本本各一、二个。3、 在离心管管架上排排上所需需数目的的0.55ml或或1.55ml离离心管待待用。4、 打开试剂剂盒，取取出标本本处理液液A和B，将两两者分别别混匀待待用。5、 在每一个个离心管管中加入入1000ul标本处处理液A，然后后再逐一一加入血血清液1000ul（每一一

8、个都要要换枪头头），盖盖上盖子子，做好好标记，在在震荡器器上震荡荡混匀（若若没有振振荡器可可人工颠颠倒混匀匀，并用用手指弹弹打数次次）。6、 放入台式式高速离离心机中中，130000rrpm离心10分钟。注意：在离心心时必须须保持离离心管的的平衡，离离心机有有内盖的的要盖内内盖。离离心管的的放置必必须保持持管背突突出部分分一致向向外，以以便在吸吸取上清清液时不不带走所所需的核核酸片断断。7、 离心完成成后，小小心取出出离心管管，尽量量少震动动，防止止核酸片片断从底底部被带带起，轻轻轻打开开离心管管，从离离心管腹腹部开始始慢慢吸吸取上清清液，不不要碰到到底部和和外侧部部的核酸酸片断，尽尽量一次次

9、性把2000ul的上清清夜吸干干净，若若不行也也可分两两次进行行，但不不要反复复吸打，以以避免核核酸片断断被带起起。（吸吸取上清清液时，离离心管按按从离心心机取出出的方向向倾斜，移移液枪头头斜向插插入离心心管底部部，吸出出的2000ul上清液液是不用用的）8、 在离心管管中加入入标本处处理液B 225ull（在加加的时候候注意枪枪头不要要碰到离离心管的的管壁，以以免交叉叉污染），用用震荡器器充分混混匀，低低速离心心数秒，放放入加热热装置中中，1000加热10分钟，取取出放入入台式高高速离心心机中，130000rrpm离心10分钟。9、 上清液（此此上清液液指的是是第8步配成成的液体体）作为为模

10、板待待用。10、 若要用试试剂盒中中的标准准品，则则与标本本相同处处理。（二）反反应液的的配制：在反应应液配制制室进行行，戴薄薄膜手套套，以避避免乳胶胶手套上上的荧光光粉粘在在毛细管管上，影影响荧光光的读取取。1、 取出试剂剂盒中的的反应液液A（蓝色色）B（绿色色）C（棕色色），待待完全溶溶化后，分分别混匀匀后，低低速离心心数秒，待待用。2、 在干净的的离心管管中按一一人份比比例为A:B:C=99:8:1的比例例（即一一人份，反反应液A 99ul、B 88ul、C 11ul）配制制反应液液，配制制时一般般要求多多配制一一人份（即n+1人份），充分混匀后，按每一管18ul量，分装于毛细管上面开口

11、的底部。（干净离心管的大小按实际配制量自行调整，可用0.5ml的或1.5ml的）（三）加加模版：在标本本处理室室进行，戴戴薄膜手手套。1、 将免抽提提的标准准品取出出，完全全溶化后后，充分分混匀，低低速离心心数秒，待待用。2、 将标本和和免抽提提标准品品（或抽抽提好的的标准品品）按每每个2ull 逐一加加入毛细细管开口口底部的的反应液液中（一一定要加加到反应应液中，不不可挂壁壁，以防防止两者者没有混混融，造造成实验验失败），每每一个都都要换枪枪头。3、 每一次实实验都要要带四个个标准品品（107、106、105、104）和一一个阴性性（阴性性对照液液也包括括在试剂剂盒中）。4、 用圆头镊镊子逐

12、一一将每一一个毛细细管的盖盖子盖好好，不要要用尖头头的镊子子，以免免把毛细细管的盖盖子顶穿穿。5、 把毛细管管放入离离心架上上，将离离心管架架放入离离心机中中，低速速离心数数秒（不不要超过过30000rppm，以防防毛细管管断掉）。6、 将毛细管管取出，上上机。注意事项项：1、所有有的试剂剂和反应应液(A试剂、B试剂、C反应液)都要在在振荡器器上单独独混匀。2、奇数数的试管管要加一一根2000ul水的子子弹头变变成偶数数配平后后均衡放放入离心心机后离离心，以以免不平平衡。3、1000干浴锅锅孵育时时间10分钟+3分钟，孵孵育时可可打开锅锅盖以免免爆子弹弹头瓶盖盖。4、高速速离心机机速度1330

13、000转(可设150000转)，时间间可适当当延长10分钟。5、放入入高速离离心机时时，记住住子弹头头的统一一放置方方向，抽抽提上清清液时，将将移液器器的量调调至2055ul，枪头头朝离心心反方向向的底部部倾斜抽抽提。6、毛细细管盖上上盖子后后低速离离心数秒秒，插入入仪器时时往下按按一下。上海科华华(Fluuo Cyyclee型)仪器操操作程序序1.目 的 保证上上海科华华(FluuoCyyclee型)核酸扩扩增荧光光定量检检测仪的的正确和和正常使使用。2.适用用范围 本规程程适用于于上海科科华(FluuoCyyclee型)荧光定定量PCR仪分析析的所有有实验过过程。3.制定定依据 上海科科华

14、(FluuoCyyclee型)仪器操操作使用用说明书书。4.职 责 由经培培训合格格的临床床基因扩扩增实验验室技术术人员操操作仪器器。5.准备备工作5.1打打开计算算机，键键入用户户名和密密码登录录；5.2打打开FluuoCyyclee机器电电源开关关；5.3在在桌面或或Winndowws开始菜菜单中点点击pccrsooftwwaree1图标标，进入入FluuoCyyclee软件主主界面；5.4点点击“编辑运运行” 进入样样品信息息设置界界面，稍稍后屏幕幕提示“是否现现在开始始自检？”对话框框；选择择“Yes”，机器器即进入入自检；选择“No”，机器器即跳过过自检。自检结结束后，屏屏幕显示示“

15、自检通通过”，点击“OK”后，进进入样品品设置界界面；机器只只需在每每天第一一次实验验前自检检一次，自自检：空空卡盘(未插入入毛细管管的样品品盘)放在机机器中，放放下盖子子，点击击“Yes”进行自自检；如如果自检检结果显显示“错误”，则记记下报错错信息，并并与科华华公司技技术服务务部联系系。6.编辑辑样品信信息6.1 在样品品信息设设置界面面,点击“新建文文件”,新建一一个实验验项目；6.2 “输入检检测样品品总数”后“回车”,编辑样样品信息息.也可在在仪器运运行过程程中点击击“编辑样样品”编辑，或或运行结结束后再再进入样样品信息息设置界界面更改改，但样样品个数数在仪器器运行后后不能再再修改；

16、在“类型”中可选“未知”（样品品）、“标准”和“阴性”，每次次实验一一般都带带标准和和阴性做做（阴性性是必须须带的，去去除工作作液受到到污染的的影响，除除非保证证实验室室完全无无污染），标标准的已已知浓度度根据试试剂标准准说明书书上的值值输入（譬譬如3E7、3E6、3E5、3E4、3E3），阴阴性的已已知浓度度为0.0000EE+0，项目目名称可可单独输输入也可可整体输输入。6.3 点击“打开文文件”,可对已已有项目目进行编编辑；6.3 点击“清除输输入”可清楚楚输入信信息重新新填写；6.4点点击“保存修修改”将保存存输入的的样品信信息；6.5点点击“运行”，仪器器开始样样品找位位，并进进入温

17、度度设置界界面。7.设置置实验参参数7.1点点击“新建参参数”， 按试剂剂说明书书要求设设定实验验循环参参数；编辑循环环参数时时,只要输输入“第一目目标温度度”、“温度保保持时间间”、“采样方方式”和“循环次次数”譬如4步步循环（机机器自带带，可以以直接打打开参数数调用，文文件存在在C:Proograam FFileesppcrssofttwarreeexp目录下下的KHB文件） 右下框框的名称称 第一目目标温度度 温度保保持时间间 采样方方式 循环次次数1 、(预热1) 500 1200S 不采样 12、(预预热2) 93 1120SS 不采样 13、 (采样) 993 100S 不采样40

18、 600 30SS采样4、 (散热) 440 100S 不采样 1注：第三三步循环环中的第第一阶段段温度保保持时间间10S是正确确的，试试剂说明明书上写写的3S是错误误的。7.2参参数设置置完毕后后，点击击“保存参参数”；7.3 对已保保存的实实验参数数，点击击“打开参参数”即可调调用；7.4 样品找找位结束束后，点点击“运行”进入运运行界面面，开始始检测，此此时禁止止打开盖盖子。实验程序序运行界界面结构构：上方方为荧光光实时显显示图：显示每每个样本本实时荧荧光值，记记录每个个样本荧荧光值变变化趋势势；下方方为温度度实时显显示图：显示运运行过程程中的实实际温度度值；若温度实实时显示示图显示示的

19、波形形不是规规则的或或不均匀匀的，说说明仪器器的温度度控制部部件有故故障；若若荧光实实时显示示图显示示的波形形不是正正常的图图形，很很可能是是光路对对位置光光偶有问问题。发射波长长是470，接收收滤光片片的波长长F1/5300、F2/6400、F3/7100（平时时只用F1/5300单波长）。7.5完完成运行行后，软软件自动动保存数数据，转转入FluuoCyyclee数据分分析主界界面。8.数据据分析8.1仪仪器运行行结束后后，进入入数据分分析界面面，软件件自动加加载当前前的实验验数据，也也可点击击左下角角“打开文文件”打开一一个已经经有的实实验，进进行离线线的分析析；8.2仪仪器提供供“方差

20、法”和“最小二二乘法”两种数数据分析析方法；8.3方方差法分分析：选选择方差差法，设设置起始始点（默默认3）、终终止点（默默认8）和系系数（默默认1.2），点点击红色色按钮“方差法法分析”，直到到得到较较好的结结果； 起始点和和终止点点都是指指横坐标标循环次次数第几几次对应应的荧光光值，适适当修改改起始点点、终止止点和加加大系数数值相当当于向上上拉动“噪声带带设置框框”、提高CT阈值。8.4最最小二乘乘法分析析：选择择最小二二乘法，显显示方式式选择“log”，拉动“噪声带带设置框框”的噪声声带设置置线（图图中黑色色的水平平线），按按住鼠标标左键，上上下移动动基线，至至刚刚覆覆盖阴性性对照正正常

21、扩增增曲线顶顶部位置置/且正好好所有曲曲线都处处在刚好好开始均均匀规则则的上升升处，且且阴性对对照CT值为零零，点击击按钮“最小化化误差”，得到到各标本本的检测测结果；或者拉拉动CT阈值设设置框中中的黑色色水平线线设置阈阈值，但但阈值只只能在噪噪声带以以上位置置移动（经经验丰富富的操作作者，可可不用拉拉动“噪声带带设置框框”的黑色色水平线线，直接接拉动CT阈值黑黑色水平平线到正正好所有有曲线都都处在刚刚好开始始均匀规规则的上上升处设设置阈值值，然后后点击“CT值分析”即可）；8.5选选择任何何一种分分析方法法，软件件均可自自动地计计算CT，绘出出标准曲曲线和相相关系数数r，并计计算样品品浓度值

22、值。8.6分分析完毕毕后，点点击“保存结结果”，否则则打印报报告时仪仪器自动动读取调调整前的的默认数数据。注：完成成后进行行数据分分析，若若实验结结果中由由标准品品求得的的标准线线较好(相关系系数不小小于实验验规定数数据/非常接接近-1.0000，标准准样本点点几乎都都在标准准直线上上)时 ，也可不不用做调调整。标准曲线线的创立立：结果果分析完完成后，点点击“保存标标准”，在弹弹出的对对话框点点击保存存创立并并保存本本次实验验的标准准线。大部分情情况下相相信仪器器通过方方差法自自动测得得的值，不不用执行行最小二二乘法分分析操作作。标准曲线线的调用用：在数数据分析析界面，点点击“调用标标准”，仪

23、器器提示“将调用用已有标标准曲线线进行分分析，但但不保证证计算结结果的准准确性！”，点击“ok”, 在弹出出的对话话框中选选择要导导入的标标准曲线线，点击击“ok”打开导导入,实验数数据由软软件自动动分析得得出。 9.打印印报告9.1在在数据分分析界面面或主界界面，点点击“打印报报告”，进入入打印界界面；9.2选选择要编编辑的样样品，点点击“病人信信息设置置”，在跳跳出的对对话框中中输入病病人信息息，点击击“保存修修改”；9.3选选择要打打印的样样品，点点击“打印检检验报告告”，即可可打印病病人报告告；9.4点点击“打印检检验报表表”，可打打印综合合检验报报告。10结束束工作10.11确认实实

24、验结束束后，关关闭FluuoCyyclee软件；10.22关闭主主机的电电源；10.33关闭计计算机系系统；10.44取出样样品盘，用用退管器器取出毛毛细管，按按照有关关规定处处理用过过的毛细细管；10.55清理操操作台面面。上海科华华(FluuoCyyclee型)荧光定定量PCCR仪维维护保养养程序1.目的的本规程程决定了了荧光定定量PCCR仪保保养方法法，以确确保仪器器正常运运行，结结果准确确规范。2.适用用范围本本规程适适用于上上海科华华FluuoCyyclee型荧光光定量PPCR仪仪分析的的所有试试验过程程。3.制定定依据 上海科科华FluuoCyyclee型荧光光定量PPCR仪仪使用

25、说说明书。4.职责责由经培培训合格格的临床床基因扩扩增实验验室技术术人员操操作仪器器。5.维护护方法：5.1 每天使使用结束束后，用用干净软软布清洁洁机器表表面尘土土；5.2 每周用用镜头纸纸清洁检检测窗口口一次；5.3 如果发发生毛细细管破裂裂情况，可先用10%次氯酸钠浸泡的棉签对样品盘及机器内外壁消毒，再用蒸馏水或70乙醇浸泡的棉签清洁；注意事项项：a)记好好操作记记录。b)非本本室人员员使用该该仪器，需需在本室室人员的的指导下下操作。关机前前，应由由本室人人员检查查仪器是是否正常常方可关关机。操操作人员员和本室室人员同同时签字字。不可可自行挪挪动仪器器，不可可自行拆拆开仪器器间接口口。注

26、：该仪仪器由厂厂家每年年定期校校准维护护。上海科华华(FluuoCyyclee型)荧光定定量PCCR仪校校准程序序1.目的的 保证循循环仪温温控的精精确度。2.适用用范围 FlluoCCyclle荧光定定量PCR仪。3.职责责 本SOP由实验验室负责责人执行行落实。4.操作作程序4.1 新安装装的仪器器以生产产厂商的的合格证证明为校校准依据据。4.2 循环仪仪每1年由厂厂商对其其温控系系统进行行校准1次。4.3 仪器使使用过程程中如发发现温度度有漂移移或怀疑疑实验结结果不理理想的可可能原因因是循环环仪时，应应及时与与厂商联联系对仪仪器进行行校准。4.4 仪器故故障维修修后应对对仪器进进行校准准

27、合格后后方可使使用。4.5 做好仪仪器的校校准记录录。附：注意意事项a）仪器器应放置置在水平平坚固的的平台上上，外界界电源系系统电压压要匹配配，并要要求有良良好的接接地线。b）环境境温度保保持在223左右，湿湿度保持持在60左右右。对于于潮湿的的省份，推推荐配备备除湿机机。c）仪器器应配备备合适的的UPS或稳压压器。e）仪器器使用时时应严格格遵守上上述使用用步骤。Fluoocyccle实时荧荧光PCR仪加热热丝更换换说明书书一、准备备工具：1、内六六角扳手手（3#）一把把。2、十字字螺丝刀刀一把。3、小型型平头螺螺丝刀一一把。二、更换换步骤：1、 切断仪器器电源开开关。2、 等仪器冷冷却后，打

28、打开仪器器盖子，拆拆去上盖盖外围三三颗内六六角螺丝丝，将帽帽子拿下下，见下下图。内六角螺丝3颗3、 松开接线线柱上连连接加热热丝导线线的两颗颗一字螺螺丝，将将导线轻轻轻取出出，拆去去加热腔腔上面固固定加热热丝的两两颗十字字螺丝，见见下图十字螺丝2颗一字螺丝2颗4、 抓住导线线将加热热丝从加加热腔垂垂直拿出出，小心心不要将将腔内壁壁的绝缘缘片带出出或划破破。5、 将备用加加热丝原原样垂直直装回。注意：加热腔腔内壁贴贴有绝缘缘片，安安装时请请保证绝绝缘片紧紧贴腔体体内壁。6、 确定加热热丝已安安放后，旋旋紧固定定螺丝，再再将导线线固定到到接线柱柱上。7、 上盖帽子子原样安安放好，先先将三颗颗内六角角螺丝分分别旋上上，在确确定三颗颗螺丝都都旋上后后，均匀匀将螺丝丝旋紧。8、 更换完毕毕。