中药、天然药物免疫毒性研究技术指导原则(第二稿)hwki.docx

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1、【Z】GPT4-1指导原则则编号中药、天天然药物物免疫毒毒性（过过敏性、光光敏性）研究的技技术指导导原则第（第二一一稿（草案案）二00三三年十二二月十七七日目 录录概述34一、 定义和意意义43二、 背景和目目的43三、 适应范围围45四、 重点内容容65基本内内容 .65一、基本本原则65二、免疫疫毒性6适用范围围和评价价指标7（一） 试验中应应考虑的的问题86三、过敏敏超敏反反应试验验97（一）试试验中应应考虑的的问题9.7（二）II型变态态反应超超敏反应应.1081定义义.10.82主动动皮肤主动动过敏试试验1083主动动全身主动动过敏试试验101004被动动皮肤过过敏试验验111115

2、抗体体滴度检检测11122（三）III、型变态态反应.12212（四）型变态态反应.133（五）型变态态反应.1121441小鼠鼠迟发型型变态反反应.142啮齿齿类局部部淋巴结结试验.1143Buuehller分分析和豚豚鼠最大大值法166四、光敏敏试验.17712（一）皮皮肤光毒毒性试验验188（二）皮皮肤光变变态反应应试验183（三）光光变态反反应试验验光敏试试验中应应考虑的的问题11139五、数据据分析及及评价20014六、常见见问题及及处理.21115七、不同同剂型的的中药、天天然药物物的一般般要求.2175参考文文献 22518附录199主动皮肤肤过敏试试验19主动全身身过敏试试验2

3、1被动全身身过敏试试验22型超敏敏试验23型超敏敏试验24Buehhlerr分析和和豚鼠最最大值法法.24啮齿类局局部淋巴巴结试验验.255小鼠迟发发型变态态反应试试验.266皮肤光变变态反应应试验27起草说说明 2627著者 229300概述一、定义义和意义义免疫毒理理学是毒毒理学中中一门重重要的分分支学科科，其目目的是探探讨外源源性化合合物对机机体（人人和实验验动物）免免疫系统统产生的的不良影影响及机机理。外外源性化化合物对对机体免免疫系统统的损伤伤作用包包括两类类，一是是免疫抑抑制，即即免疫系系统的广广泛抑制制，可致致机体对对感染的的易感性性增加及及肿瘤发发生率增增高；另另一是免免疫增强

4、强，即免免疫系统统反应性性过度增增强，而而导致机机体过敏敏反应（变变态反应应）和自自身免疫疫性疾病病。FDA定定义：修改免疫疫毒性定定义过敏反应应又称变变态反应应，是指指机体受受同一抗抗原再次次刺激后后产生的的一种异异常或病病理性免免疫反应应。按抗抗原与抗抗体或细细胞反应应的方式式和补体体是否参参加等，将将变态反反应分为为、四型。其其中型变态态反应是是了解得得最多的的一种变变态反应应，目前前采用的的过敏试试验方法法多数是是根据型变态态反应发发病机制制的不同同环节而而设计建建立的。光敏反应应包括光光毒反应应和光过过敏反应应（光变变态反应应）两类类，光过过敏反应应为IVV型变态态反应的的特殊类类型

5、，是是局部给给药和全全身给药药后，分分布在皮皮肤中的的药物中中所含的的感光物物质与光光线产生生复合作作用使得得用药后后皮肤对对光线产产生的不不良反应应。中药、天天然药物物为一种种外源性性物质，也也可作为为变应原原引机体体产生发发变态反反应。本指导导原则仅仅就中药药、天然然药物对对机体变变态反应应和光敏敏反应进进行讨论论。二、背景景和目的的增加中药药对免疫疫系统的的影响的的内容从70年年代后期期开始，欧欧美等先先进国家家开始研研究药物物对机体体免疫系系统的毒毒性研究究。900年代以以来，逐逐渐将免免疫毒性性作为药药物安全全性评价价的一项项重要内内容。随随着中药药走向世世界，许许多高新新技术也也广

6、泛应应用于中中药新药药的研发发过程。其其研究内内容也日日趋与国国外化药药新药研研究接轨轨。中药药作为一一种外源源性化学学物质，进进入机体体后，同同样对机机体免疫疫系统产产生不同同程度的的毒副作作用。在在中药新新药研究究过程中中，研究究其对机机体免疫疫系统的的影响及及机理，是是中药临临床前安安全性研研究及评评价的一一项重要要内容。以以往中药药新药的的安全性性研究中中，很少少关注或或检查免免疫系统统，故也也极少发发现受试试物的免免疫毒性性作用。因因免疫系系统方面面的功能能改变能能在某种种意义上上预示药药物的不不良反应应，且免免疫系统统对毒物物具有很很高的敏敏感性。因因此，需需在新药药评价过过程中，

7、逐逐渐建立立一套评评价方法法，在常常规的安安全性研研究中探探索并发发现药物物的免疫疫毒性以以及及引引起的免免疫系统统的功能能性改变变等。传统观念念认为，中中药平和和、安全全，但近近年来，伴伴随中药药及其新新制剂的的不断增增多，如如注射剂剂品种的的不断增增加，使使用范围围的日益益扩大，由由中药引引起的不不良反应应特别是是变态反反应也在在逐年增增多。以以下几方方面可能能是导致致中药变变态反应应发生的的主要原原因：（11）中药药自身的的特点：中药成成分复杂杂，按生生理活性性可分为为有效成成分、辅辅助成分分、无效效成分、组组织物及及杂质等等，其中中不乏有有导致机机体的过过敏物质质，如动动、植物物蛋白，

8、多多肽，多多糖等大大分子物物质，它它们同时时具有免免疫原性性和反应应原性,属于完完全抗原原，可直直接刺激激机体免免疫系统统产生免免疫应答答,使机机体产生生抗体或或致敏淋淋巴细胞胞,最后后导致变变态反应应；一些些小分子子化学物物质属于于半抗原原，进入入人体后后与蛋白白质结合合成全抗抗原而致致敏。（22）中药药及其制制剂中的的致敏原原，除药药物本身身成分外外，其制制剂中的的添加剂剂、助溶溶剂、稳稳定剂、着着色剂、稀稀释剂及及在制备备过程中中产生的的杂质和和药物本本身的氧氧化、还还原、分分解、聚聚合等形形成的杂杂质均能能成为过过敏原而而致机体体过敏，从从而诱发发各种类类型的变变态反应应。（33）中药

9、药复方制制剂：复复方制剂剂包含多多种不同同药物，混混在一起起制成煎煎剂、注注射剂、丸丸剂及外外用制剂剂等。各各种药物物成分在在体外就就有可能能发生相相互作用用,进入入体内后后在消化化、吸收收及体内内转化过过程中,也会有有互相作作用发生生,这无无疑也会会成为发发生不良良反应的的原因。鉴鉴于此，中中药免疫疫毒性特特别是变变态反应应的研究究是不可可忽视的的临床前前安全性性评价的的重要内内容之一一。请教临床床免疫专专家（免免疫学会会，协和和医院张张宏誉），明明确过敏敏原、免免疫原、变应原三、适用用应范围该技术指指导原则则适用于于拟用人人和/或或已上市市的中药药、天然然药物的的免疫毒毒性研究究。这些些药

10、物指指非口服服给药途途径的中中药、天天然药物物，包括括中药注注射剂及及其他局局部用药药的制剂剂。四、重点点内容本技术指指导原则则的重点点内容主主要包括括免疫毒毒性、变变态反应应试验和和光敏试试验的相相关内容容。基本内内容一、基本本原则免疫毒性性研究过过程必须须执行药药品非临临床研究究质量管管理规范范（GGLP）。在进行试试验设计计中，应应遵循随随机、对对照、重重复的统统计学原原则。应在遵循循安全性性评价普普遍规律律的基础础上，运运用具体体问题具具体分析析的方法法，结合合受试物物的自身身特点，充充分考虑虑和结合合药学、药药效学、其其他毒理理学（长长毒、急急毒）及及拟临床床应用情情况等信信息，体体

11、现整体体性、综综合性的的原则，在在阐明其其研究方方法或手手段科学学、合理理的前提提下进行行规范性性试验，对对试验结结果应进进行全面面分析和和综合评评价，以以达到免免疫毒性性研究的的目的。二、免疫疫毒性原则性地地介绍（包包括免疫疫增强和和免疫抑抑制），不不详细介介绍方法法1 明确适用用范围2 明确何种种情况下下需结合合长毒试试验进行行3 明确何种种情况下下需进行行进深入入的研究究4 列出相应应的检测测指标药物对机机体的免免疫毒性性常涉及及免疫器器官、免免疫细胞胞和免疫疫分子。药药物暴露露后的免免疫毒性性可表现现为淋巴巴细胞器器官重量量或组织织学的改改变，或或骨髓及及外周淋淋巴细胞胞的改变变。药物

12、物对免疫疫系统影影响的评评价与免免疫反应应性有关关，不能能仅通过过组织病病理学和和血液学学的方法法对淋巴巴组织进进行单一一检查，一一般认为为组织病病理学变变化通常常不是敏敏感药物物诱发免免疫毒性性的指标标，而仅仅见于相相对较高高的剂量量时，且且并不一一定与功功能性免免疫改变变相对应应。因此此，检测测免疫毒毒性要通通过多项项指标来来进行综综合性评评价。实实验方法法应建立立在公认认的免疫疫学理论论和免疫疫实验技技术基础础之上；实验观观察指标标应标准准、灵敏敏、系统统、全面面；通常常由多剂剂量毒性性实验、病病理组织织学和/或免疫疫组化方方法完成成。（一）、适用范范围及评评价指标标需进行免免疫毒性性评

13、价的的受试物物：由于于免疫系系统是一一增生活活跃的系系统，因因此对毒毒物非常常敏感，但但每一种种化学物物质都有有其特定定的靶器器官，因因此不必必盲目地地对所有有受试物物进行免免疫毒性性监测，而而是选择择性地对对某些受受试物特特别是以以免疫系系统为靶靶器官的的毒物进进行研究究。用于于某些适适应症的的药物，因因其作用用机制的的特殊性性，对人人体免疫疫系统可可能产生生影响，如如感染HHIV的的病人，免免疫系统统已遭到到严重损损伤，故故对用于于AIDDS的治治疗剂进进行免疫疫毒理学学评价极极为重要要。另外外，当受受试物是是已知的的免疫调调节剂的的情况，或或在安全全性评价价过程中中初步发发现对免免疫系统

14、统有明显显影响的的药物也也应进行行免疫毒毒性的评评价。在何种试试验中进进行免疫疫毒性的的观察：建议在在现有的的长期毒毒性试验验中，增增加免疫疫系统损损伤的评评价指标标。现长长毒试验验中对免免疫器官官变化关关注的较较少，进进行病理理组织学学检查的的主要是是脾脏和和胸腺。对对脾、胸胸腺、淋淋巴结的的详细检检查，包包括重量量及病理理组织学学检查及及骨髓的的病理组组织学检检查更能能反应出出对免疫疫系统的的损伤作作用。即即应将临临床前安安全性试试验与确确定药物物对免疫疫系统功功能影响响的特殊殊评价结结合起来来， 应合理选选择综合合性评价价指标。进进行免疫疫毒性评评价时，通通常需对对免疫器器官、免免疫细胞

15、胞、免疫疫分子（包包括细胞胞因子）等等进行分分析。一一种化合合物或其其代谢产产物对淋淋巴细胞胞存活的的直接效效应，可可通过受受试物与与特定的的淋巴细细胞体外外共培养养确定，并并在不同同时间里里监测细细胞活力力。如果果某些受受试物体体内给药药能减少少一种或或多种细细胞类型型，而在在体外培培养时无无此作用用，则可可能间接接的作用用于淋巴巴细胞。有有些化合合物可能能抑制免免疫功能能而不显显著影响响细胞数数目，因因此有必必要对免免疫功能能进行分分析。如如用吞噬噬细胞摄摄取颗粒粒的能力力和肿瘤瘤活性的的能力来来评价某某些受试试物对其其的影响响。NKK细胞抗抗肿瘤活活性的测测量，通通常用标标记YAAC-1

16、1的肿瘤瘤细胞作作为靶细细胞分析析51Crr-的释释放量来来评价。淋淋巴细胞胞的信号号传递途途径和增增殖能力力，可通通过有丝丝分裂原原或者生生理活性性因子激激活细胞胞来评价价等。即即应结合合具体情情况，选选择合适适的评价价指标。（二）、试验中中应考虑虑的问题题1、1、动物物选择：用于检测测潜在免免疫毒性性的临床床前试验验的受试试动物应应为健康康动物，通通常用啮啮齿类动动物。受受试动物物在试验验前应在在试验场场所进行行适应性性饲养。免免疫毒性性试验设设计中要要充分考考虑到动动物免疫疫系统的的成熟程程度等。2、给给药途径径：应与拟用用临床途途径一致致（如有有特殊情情况，需需说明）。3、给药药剂量：

17、建议设置置三个剂剂量，低低剂量应应不低于于药效试试验有效效剂量。应考虑出现免疫毒性的剂量和引起其他毒性的剂量的关系；注意观察出现免疫毒性的可逆性。4、给药药时间：每日给药药，连续续1个月月或与长长毒试验验周期一一致。5、检测测指标：用于检测测受试物物引起动动物免疫疫毒性的的指标应应包括以以下两级级：（11）第一一级：血血液学（如如白细胞胞计数等等）、重重量（如如体重、脾脾重、胸胸腺重、肾肾脏重和和肝重等等）、脾脾细胞数数和骨髓髓细胞数数、淋巴巴器官组组织学观观察、IIgM抗抗体形成成空斑细细胞（PPFCSS）、TT淋巴细细胞转化化、混合合淋巴细细胞反应应、B淋淋巴细胞胞转化和和NK细细胞活性性

18、；（22）第二二级：BB淋巴细细胞、TT淋巴细细胞表面面标志、IIgG抗抗体形成成空斑细细胞计数数、T淋淋巴细胞胞的细胞胞毒效应应、ADDCC作作用、II型超敏敏反应（全全身或局局部）、迟迟发性超超敏反应应及宿主主对实验验性感染染或肿瘤瘤移植的的抵抗作作用等。6、环环境因素素：特定环境境的环境境，如群群养、单单养、温温度、禁禁食、禁禁水、光光照、固固定、手手术、给给药方法法和应激激都会对对实验动动物的免免疫系统统产生影影响。应应尽量注注意避免免。在任何免免疫毒性性研究中中，受试试物的剂剂量、给给药时间间、给药药方式应应与发现现不良反反应的实实验相一一致。7、免疫疫功能的的检测方方法7.1体体液

19、免疫疫功能（见见后）：包括皮皮肤被动动过敏试试验、皮皮肤主动动过敏试试验、全全身主动动过敏试试验及抗抗体滴度度测定等等。7.2细细胞免疫疫功能：包括淋巴巴细胞增增殖反应应，K细胞胞、NKK细胞、巨巨噬细胞胞、抗原原递呈细细胞功能能，以及及宿主抵抵抗力试试验（对对抗原的的抵抗试试验及肿肿瘤细胞胞攻击试试验）等等。三、超敏敏反应试试验（一）、试验中中应考虑虑的问题题中药、天天然药物物应进行行何种变变态反应应研究，可可根据药药物自身身特点、临临床适应应症和给给药方式式确定。通常局部部给药发发挥全身身作用的的药物（如如注射剂剂和透皮皮吸收剂剂等）需需考察型变态态反应，如如注射剂剂需进行行全身主主动过敏

20、敏试验和和皮肤被被动过敏敏试验，透透皮吸收收剂需进进行皮肤肤主动过过敏试验验等。和型型变态反反应可在在进行长长期毒性性试验中中选择相相关指标标进行观观察，如如观察动动物的体体征、一一般表现现及免疫疫系统损损伤的评评价指标标等。经皮给药药制剂（包包括经皮皮给药发发挥全身身作用或或局部作作用的药药物）应应进行IIV型变变态反应应试验。具体试验验方法的的选择应应根据给给药途径径、过敏敏反应发发生机制制、影响响因素和和临床意意义等为为基础进进行选择择，如皮皮肤主动动过敏试试验、全全身主动动过敏试试验、皮皮肤被动动过敏试试验、小小鼠耳廓廓肿胀试试验（MMESTT）、啮啮齿类局局部淋巴巴结实验验（LLLN

21、A）、BBuehhlerr分析法法、豚鼠鼠最大值值法（GGPMTT）等，也也可采用用其它的的检测方方法，但但需阐明明其合理理性并说说明具体体方法及及操作流流程。过敏试验验均应设设立阳性性对照和和阴性对对照。可可选择多多个剂量量进行试试验，尽尽可能找找出无过过敏反应应的剂量量，以提提示临床床进行脱脱敏处理理的起始始剂量；也可避避免因剂剂量过低低而出现现假阴性性结果；另外，可可帮助判判断阳性性结果是是否因强强刺激反反应而引引起。（二）、型超敏敏反应试试验1、定定义型超敏敏反应又又称速发发型，药药物分子子本身为为变应原原,进入入机体刺刺激免疫疫系统产产生相应应的IggE抗体体,IggE抗体体附着在在

22、肥大细细胞及嗜嗜碱性细细胞上使使之致敏敏,当同同一变应应原再次次进入机机体后,即与肥肥大细胞胞及嗜碱碱性细胞胞表面的的IgEE抗体发发生抗原原抗体反反应,导导致肥大大细胞及及嗜碱性性细胞脱脱颗粒并并释放生生物活性性介质,作用于于不同的的组织和和器官,产生不不同的病病理生理理反应。临临床表现现为过敏敏性休克克、支气气管哮喘喘、变应应原鼻炎炎、胃肠肠道与皮皮肤过敏敏反应等等。型超敏敏反应通通常用皮皮肤主动动过敏试试验（AACA）、全全身主动动过敏试试验（AASA）和和皮肤被被动过敏敏试验（PPCA）等等考察，对对于吸入入途径药药物常采采用呼吸吸道敏感感性检测测。2、主主动皮肤肤过敏试试验（AAct

23、iive Cuttaneeouss annaphhylaaxiss, AACA ）皮肤过敏敏是一种种受试物物产生免免疫学传传递的皮皮肤反应应。当动动物初始始接触受受试物后后至少11周，再再进行受受试物的的激发接接触，有有可能导导致过敏敏状态。本试验的的目的就就是要观观察受试试物经皮皮肤重复复接触受受试物后后，机体体免疫系系统反应应在皮肤肤上的表表现，即即有无过过敏反应应及过敏敏强度如如何。将试验方方法列在在附录中21动动物选择择：建议议选用豚豚鼠。给给药前背背部两侧侧脱毛，脱脱毛区应应不小于于33cmm2。22受受试物：受试物物应与用用于人体体的制剂剂一致，应应为含活活性成分分和赋形形剂或含含

24、透皮促促进剂的的混合制制剂。受受试物应应采用制制备工艺艺稳定的的样品，应应明确受受试物提提供单位位、批号号、含量量（或浓浓度）、配配制方法法等。若若受试物物为膏剂剂或液体体，则一一般不稀稀释；若若受试物物为固体体粉末，则则需适量量水或赋赋形剂混混匀，以以保证受受试物与与皮肤的的良好接接触。当当使用赋赋形剂时时，应考考虑其对对受试物物透皮吸吸收的影影响。23对对照设置置：应设设置阳性性对照药药组和阴阴性或赋赋形剂对对照组，阳阳性药可可选择22，4-二硝基基氯代苯苯（1%的致敏敏浓度和和0.11%的激激发浓度度）。24给给药范围围及停留留时间：在受试试物的致致敏接触触阶段，应应充分保保证其在在皮肤

25、上上的停留留时间（66小时）和和接触皮皮肤的范范围。25致致敏：在在第0、第7和第14天，以同样的方法局部给药。末次给受试物致敏后14天，在激发接触阶段，再次将受试物涂于脱毛区，6小时左右后，观察72小时内皮肤过敏反应情况，并按皮肤过敏反应评分标准进行评分。26结结果描述述：应详详细叙述述实验方方法，列列表记录录各组各各时间的的平均分分值，同同时应密密切观察察动物是是否有哮哮喘、战战立不稳稳或休克克等严重重的全身身性过敏敏反应出出现。27结结果判断断：根据据试验组组和对照照组动物物皮肤反反应的差差别，判判断受试试物对皮皮肤过敏敏反应的的性质，并并计算致致敏发生生率（即即将出现现皮肤红红斑、水水

26、肿或全全身过敏敏反应的的动物例例数除以以受试物物总数）。致致敏发生生率为00-100%，111-330%，331-660%，661-880%，881-1100%分别为为无致敏敏性、轻轻度、中中度、高高度和极极度致敏敏性。3、主主动全身身超敏试试验（AActiive sysstemmic anaaphyylaxxis, ASSA）当药物作作为抗原原或半抗抗原初次次进入体体内，刺刺激机体体产生相相应的抗抗体（IIgE）。当同样药物再次进入机体，抗原与抗体结合形成的抗原抗体复合物，刺激肥大细胞及嗜碱性细胞释放活性介质，从而引起局部水肿、抓鼻、竖毛、呼吸困难、窒息、痉挛，甚至休克死亡。本试验的的目的即

27、即观察受受试物给给药后对对动物引引起的过过敏反应应。中药注射射剂引起起的过敏敏反应临临床上较较多见，尤尤其是引引起全身身性过敏敏反应，甚甚至过敏敏性休克克等非常常严重的的副反应应。因此此，中药药注射剂剂全身主主动过敏敏试验更更显得有有特殊意意义。是否要求求攻击时时必须一一次性静静脉注射射（腹腔腔注射可可因脱敏敏作用使使得致敏敏程度降降低）31动动物选择择：常选选用豚鼠鼠。做过过敏试验验后的豚豚鼠不能能再进行行重复应应用。32受受试物：大部分分受试物物进行过过敏试验验时，可可直接用用受试物物本身作作为致敏敏液，某某些产品品可用其其原料的的半水解解物或受受试物与与佐剂11：1的的混合液液作为致致敏

28、原，以以提高试试验灵敏敏度。加佐剂可可使过敏敏反应强强度增加加可溶性受受试物，对对肌肉注注射制剂剂，若为为混悬液液不能静静脉注射射者，可可用腹腔腔注射途途径进行行攻击。33致致敏：致致敏时常常选择容容易产生生抗体的的方法，如如皮下、腹腹腔或肌肌肉注射射等。如如给豚鼠鼠隔日肌肌肉注射射受试物物0.55ml，共3-5次。剂量设置置：通常常设置两两个剂量量组，低低剂量一一般采用用临床拟拟用量的的最高剂剂量，高高剂量组组为低剂剂量组的的10倍倍或数倍？。（请王老老师、顾顾老师查查阅相关关文献，可可行性如如何？）34攻攻击：分分两组，分分别于首首次注射射后第114-221天一一次攻击击（请王秀秀文、顾顾

29、立刚老老师查相相关依据据）。攻攻击途径径通常采用用静脉注注射途径径，以致致敏剂量量的2-5倍经经静脉，观观察注射射后有无无过敏症症状。若若采用其其他给药药途径常常引起脱脱敏。35对对照设置置：试验验应设立立阳性对对照药组组、赋形形剂对照照组等，阳阳性对照照药可选选用1-5mgg/只的的牛血清清白蛋白白或卵蛋蛋白或其其他已知知的致敏敏阳性物物质 人血白白蛋白等等。36环环境因素素：过敏敏反应试试验过程程，尤其其是攻击击（还是是激发？）时室室温不应应低于118。37结结果判断断：症状评分分表攻击注射射后，若若发现有有过敏反反应症状状时，可可应取健康康未致敏敏豚鼠22只，自自静脉注注射攻击击剂量的的

30、受试物物2mll，观察察有无由由于药物物作用引引起的类类似过敏敏反应症症状，以以供结果果判断时时参考。若出现过过敏反应应，最好好必要时时可进行行过敏的的剂量效效应关系系研究，争争取找出出无过敏敏反应的的剂量，以以提示临临床进行行脱敏处处理的起起始剂量量。38判判断标准准：无症状状；+不不安、哆哆嗦、搔搔鼻、喷喷嚏、排排尿、呼呼吸急促促等；+除上上述症状状外，呼呼吸困难难和运动动障碍；+除上述述症状外外，呼吸吸衰竭直直至痉挛挛，但可可恢复；+死亡亡。4、被被动皮肤肤过敏试试验（PPasssivee Cuutanneouus AAnapphyllaxiis, PCAA）被动皮肤肤过敏试试验是一一种

31、较敏敏感的测测试特异异抗体滴滴度的方方法。将将受试物物致敏动动物的血血清（含含丰富的的IgEE抗体）给给正常动动物皮内内注射，IIgE的的Fc端端与皮肤肤的肥大大细胞表表面的特特异受体体结合，形形成IggE的复复合物，使使肥大细细胞致敏敏。当抗抗原攻击击时，抗抗原与肥肥大细胞胞表面上上IgEE的Faab端结结合，导导致IggE分子子结构的的改变，引引起肥大大细胞脱脱颗粒，释释放过敏敏介质如如组胺、慢慢反应物物质等，使使皮肤局局部血管管的通透透性增加加，使静静脉注射射抗原的的同时注注入的伊伊文思蓝蓝染料在在该皮肤肤处渗出出着色。根根据局部部皮肤蓝蓝染范围围或程度度，可判判定血管管通透性性变化的的

32、大小，继继而判定定皮肤过过敏反应应的程度度。41试试验动物物的选择择：PCCA反应应常用的的动物是是大鼠，亦亦用小鼠鼠，有时时根据试试验需要要用家兔兔豚鼠。选择动动物时应应注意因因这些动动物PCCA反应应是由IIgE介介导的。豚鼠因其PCA反应主要是由IgG介导的，现已较少采用。42试试验分组组：应设设立阴性性、阳性性对照组组和受试试物不同同2个剂量组组。阴性性对照组组应给予予同体积积的溶媒媒，阳性性对照组组给予卵卵白蛋白白或天花花粉或已已知致敏敏阳性药药物。43致致敏途径径及方式式：应按按临床拟拟给药途途径。隔隔日致敏敏一次，共共3-55次。末末次致敏敏后100天左右右采血，制制备抗血血清。

33、44试试验方法法选择：可采用用大鼠同同种被动动皮肤过过敏试验验、小鼠鼠被动皮皮肤过敏敏试验或或小鼠耳耳异种皮皮肤过敏敏试验。45试试验操作作：将各各组含IIgE的的抗血清清分别用用生理盐盐水稀释释成不同同倍数（通常采用1:10-1:50稀释度），在动物背部脊柱两侧脱毛区皮内注射各对应组的抗血清，24或48小时后，各组动物进行抗原攻击，静脉注射与致敏剂量相同的激发抗原（含0.5-1%的伊文思文斯蓝兰染料），30分后将动物处死，摘出背部皮肤，测量皮肤里层内侧的蓝色反应斑直径，同时拍摄照片。直径在5mm以上者判定为阳性。或用比色法测定46评评价方法法：有两两种方法法，一种种是呈阳阳性反应应的最高高稀

34、释倍倍数的抗抗体效价价为指标标。另一一种是固固定的血血清稀释释倍数后后以色斑斑的大小小或光密度度值为指标标。直径径在5mmm以上上者判定定为阳性性。应提提供蓝斑斑照片。47蓝蓝色反应应斑的测测定：色色斑大小小的测定定可采用用直接测测定法或或比色测测定法。直直接测定定法是指指取对照照组和用用药组两两组的蓝蓝色斑直直径的平平均值，计计算出变变化百分分率。比比色测定定法是将将蓝色斑斑片剪下下，剪碎碎后加入入丙酮-生理盐盐水（77:3）混混合液55-6mml，浸浸泡后次次日离心心，在6610nnm波长长处测定定其吸收收度。取取两组的的吸收度度平均值值，计算算出变化化百分率率。 5、抗抗体滴度度测定Ig

35、E是是引起II型变态态反应的的主要原原因，检检测血清清或体液液中的IIgE水水平对明明确是否否存在II型变态态反应和和认识药药物诱发发变态反反应的机机制具有有重要意意义。IgE的的检测可可利用放放射免疫疫法（RRIA）等等进行。如如取静脉脉血，分分离血清清后，可可用双抗抗体夹心心酶联免免疫吸附附法测定定（Ennzymme-llinkked immmunoosorrbennt aassaay）。有有研究认认为临床床理想条条件下，血血清IggE检测测和皮肤肤试验两两者的结结果高度度一致具具有较好好的相关关性，因因此认为为两种方方法联合合检测可可提高诊诊断的结结果判断断的敏感感性和准准确性。过敏试验

36、验出现阳阳性或可可疑阳性性，以及一些些具有潜潜在致敏敏性的物质，建议进进行本试试验。6、试验验方法可参见附附录中试试验方法法。（三）、型和超敏反反应试验验型变态态反应又又称细胞胞毒或溶溶细胞型型。药物物分子进进入机体体后附着着在细胞胞膜（通通常是血血细胞）上上，并刺刺激免疫疫系统产产生相应应抗体，参参与的抗抗体主要要是IggG和IIgM，特特点是由由抗体直直接与靶靶细胞膜膜上的抗抗原结合合而导致致细胞溶溶解。临临床可表表现为药药物性溶溶血性贫贫血、粒粒细胞减减少和血血小板减减少性紫紫癜等。型变态态反应又又称免疫疫复合物物型或血血管炎型型。药物物分子进进入机体体刺激免免疫系统统产生相相应抗体体（

37、IggG, IgMM），当当抗原抗抗体两者者呈一定定比例时时形成免免疫复合合物，沉沉积于组组织的血血管基底底膜上，导导致血管管壁的损损伤及炎炎症反应应。常见见反应如如血清病病、变应应性肾小小球肾炎炎、全身身性红斑斑狼疮样样反应等等。尚无标准准的临床床前试验验进行预预测。当药理学学和毒理理学试验验结果提提示有潜潜在的III和IIII型超敏反反应时，建议可进行进一步的相关试验研究。可参照附附录中的的试验方方法。型变态态反应试试验方法法放在附录录中引起型型变态反反应的抗抗原需持持续存在在，以利利于与相相应抗体体结合形形成免疫疫复合物物。可采采用家兔兔（最易易形成AArthhus反反应）或或大鼠AAr

38、thhus反反应试验验进行评评价。将将受试物物或阳性性药卵白白蛋白和和Freeundds完全全佐剂给给家兔每每周肌肉肉注射11ml，共共4次。末末次注射射后第110天，背背部剪毛毛后皮内内注射受受试物或或1%卵卵白蛋白白，每点点注射00.2mml，抗抗原攻击击后2，33，4，66，8，112，224小时时观察每每点局部部皮肤红红肿的最最大直径径与反应应程度，求求平均值值。反应应程度按按分级进进行分析析、判断断。受试物的的给药途途径和给给药时间间由受试试物的药药效学、临临床拟用用药情况况等特点点决定。（四五）、IV型型变态反反应试验验又称迟发发型。药药物直接接作用于于T淋巴巴细胞使使之致敏敏，当

39、同同一药物物再次接接触已致致敏的淋淋巴细胞胞，则激激发致敏敏淋巴细细胞释放放介质而而导致组组织损伤伤。 此此类反应应无抗体体参与，发发生较慢慢，一般般在再次次接触相相同抗原原2448-772小时时后才出出现临床床表现。主主要表现现为药疹疹、接触触性皮炎炎、剥脱脱性皮炎炎等。介绍型型变态反反应包括括的试验验方法，方方法学的的优缺点点，目前前被各国国接受和和认可的的程度。（请请李波老老师帮助助撰写）可参照具具体方法法学放在在附录中中的试验验方法。1 Buehhlerr分析和和豚鼠最最大值法法（GPPMT）试验动物物皮内或或涂皮给给予诱导导剂量，经经过100144天的诱诱导期，此此时免疫疫反应发发生

40、，然然后给予予激发剂剂量，以以观察是是否出现现了过敏敏反应。在在诱导期期和攻击击期的皮皮肤反应应及其程程度均应应进行对对比，并并与伪处处理组进进行比较较。31实实验动物物：最好好选择年年轻成年年的豚鼠鼠。动物物数量和和性别取取决与所所选择的的试验方方法，两两种性别别均可使使用。如如果使用用雌性动动物，应应选择未未产和未未孕的动动物。BBuehhlerr试验试试验组不不少于220只、对对照组不不少于110只。GGPMTT试验试试验组不不少于110只、对对照组不不少于55只。32对对照：推推荐的阳阳性对照照物有巯巯基苯并并噻唑，苯苯佐卡因因，二硝硝基氯苯苯，3331环氧氧树脂等等。为确确保激发发反

41、应源源于过敏敏性而非非刺激性性，应设设立溶剂剂对照组组，所选选择的溶溶剂应不不干扰或或改变试试验结果果的判断断。33给给药剂量量：取决决与所选选择的方方法。BBuehhlerr试验中中，致敏敏剂量应应足够高高，以产产生轻微微的刺激激性，激激发剂量量为不产产生刺激激性的最最高剂量量。GPPMT试试验中，致致敏剂量量应足够够高以产产生轻中的皮皮肤刺激激性且能能很好地地全身耐耐受，激激发剂量量为不产产生刺激激性的最最高剂量量。34结结果观察察：皮肤肤反应应应分级并并在方法法学所确确定的激激发时间间进行判判定和记记录，一一般为224和448小时时。对于于异常的的反应，应应相应地地调整时时间。应应记录开

42、开始和结结束时动动物的体体重。35试试验步骤骤：（1） Bueehleer试验验在第00，6-8和113-115天用用封闭片片局部给给药以诱诱导，在在第277-288天在未未给药的的胁腹部部贴6小小时以局局部激发发。去除除封闭片片24和和48小小时后观观察结果果。如果果结果难难以判定定，一周周后再次次激发，可可采用原原来的对对照组或或新的对对照组。（2）GGMPTT试验采采用皮内内注射给给药，使使用或者者不使用用佐剂进进行诱导导，局部部诱导558天天后，第第2022天天给予激激发剂量量24小小时，在在去除激激发剂量量24和和48小小时后观观察结果果。同BBuehhlerr试验一一样，如如果结果

43、果难以判判定，一一周后再再次激发发，如果果初试选选择的动动物数量量只有110只而而结果难难以判断断，应再再增加110只试试验动物物和5只只对照动动物。 36数数据分析析：试验验数据建建议以表表格的形形式整理理，包括括每一动动物的皮皮肤反应应，根据据方法所所确定的的诱导和和激发的的时间。至至少应该该包括红红斑和水水肿的分分级资料料和异常常反应的的记录，提提供每一一组过敏敏的比例例和每一一动物过过敏程度度（轻、中中、重）。2啮齿齿类局部部淋巴结结试验（LLLNAA）产生皮肤肤过敏的的受试物物可刺激激所管辖辖的淋巴巴结内的的淋巴细细胞增生生，在合合适的条条件下，这这种增生生与剂量量成比例例。该项项试验可可客观、定定量的对对受试物物引起的的过敏反反应进行行评价。21试试验动物物：应选选择812周周CBAA/Caa orr CBBA/JJ系雌性性小鼠（未未产和未未孕），按按年龄配配对（最最好相差差不到一一周）。22受受试物的的制备：固体受受试物使使用前应应用合适适的溶剂剂或赋形形剂溶解解和稀释释。液体体受试物物可直接接进行试试验和稀稀释以后后使用。23溶溶剂选择择：根据据受试品品的最大大浓度选选择溶剂剂，推荐荐的溶剂剂有丙酮酮/橄榄榄油（44：1 v/vv）, N，NN-二甲甲基甲酰酰胺,丁丁酮, 丙烯, 乙二二醇, 二甲亚亚砜，其其它合适适的溶剂剂也可以以选择。所所