中药有效成分及其类似物对乙酰胆碱酯酶的抑制作用研究hwsj.docx

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1、中药有效效成分及及其类似似物对乙乙酰胆碱碱酯酶的抑制作作用研究究鲍雅丹 马 林林*基金项目：中山大学化学与化工学院第三届创新化学实验基金项目（批准号：02002）资助第一作者：鲍雅丹（1980年出生），女，中山大学化学与化工学院材料化学专业99级指导教师：马林 Email：cesmal中山大学学化学与与化工学学院有机机化学研研究所，广广州 5510227摘要本研研究对从从中药提提取的有有效成分分及合成成的一系系列类似似物进行行了抑制制乙酰胆胆碱酯酶酶的活性性测试.发现具具有苯环环或共轭轭结构的的化合物物对乙酰酰胆碱酯酯酶有显显著的抑抑制作用用，特别别是吲哚哚喹啉化化合物119c的抑制制效果最最

2、好(IIC500=4.8M)，可可以作为为治疗阿阿尔茨海海默氏病病的先导导药物。关键词乙乙酰胆碱碱酯酶 抑制制剂 IC550 动力力学阿尔茨海海默氏病病(Allzheeimeerss diiseasee,ADD)是常常见的一一种中枢枢神经系系统退行行性病变变，发病病率较高高。主要要临床表表现为记记忆、智智力和识识别功能能的不同同程度的的减退或或丧失,目前临临床上用用于改善善AD患患者认知知障碍的的药物主主要是乙乙酰胆碱碱酯酶抑抑制剂。在在大规模模、多中中心、双双盲和安安慰剂的的对照试试验中,这类化化合物对对AD病病人认知知能力及及生活质质量均有有统计学学显著改改善。美国Waarneer lla

3、mbber 公司开开发的他他克林(taccrinne)1是一种种乙酰胆胆碱酯酶酶的非竞竞争性抑抑制剂,19993年经经FDAA批准上上市, 成为第第一个用用于治疗疗AD的的ACh EE剂类药药物。此此后又有有数种AACh EE抑制剂剂经FDDA批准准上市或或进入临临床试验验, 如如Vellnacctinne、AAmirridiine等等。但它它们均有有不同程程度的毒毒副作用用, 这这些毒副副作用严严重影响响了它们们在临床床上的应应用, 这使得得有必要要开发疗疗效高毒毒副作用用更小的的ACh EE抑制剂剂。乙酰胆碱碱酯酶(aceetyllchoolinnestteraase,AChh E, EC

4、C3 . 1 . 11 . 7. )的主主要生理理功能为为通过快快速水解解神经传传递介质质乙酰胆胆碱（AACh），中中止胆碱碱能突触触中的脉脉冲传递递，故 AChh E又又称乙酰酰胆碱水水解酶 (accetyylchholiine hyddrollasee)22。CH3CCOOCCH2CH2N+(CHH3)3+ACCh EE CH33CO-AACh E + HOOCH22CH2N+ (CCH3)3CH3CCOO-+H+ACCh EE 为为了筛选选出高效效、低毒毒的ACCh EE抑制剂剂，我们们参考各各种ACCh EE抑制剂剂的结构构类型，研研究了从从中药山山芝麻和和筋骨草草分离出出的有效效成分

5、及及其类似似物对AACh EE的抑制制作用。1 实验验部分1.1 材料与与仪器乙酰胆碱碱酯酶 (Accetyylchholiinessterrasee,ACCh EE, EEC3 .1.1.77.)、硫硫代乙酰酰胆碱 (Accetyylthhiocchollinee)、55, 55 -二硫代代双 (2 -硝基苯苯甲酸 ) (DTNNB)购购于Siigmaa公司；其它试试剂为分分析纯试试剂，未未经进一一步纯化化。主要要测试仪仪器：UUV-225011PC 型紫外外光谱仪仪、Orrionn Moodell 7220A型型pH计计、Guunt w288 恒温温水浴锅锅。1.2方方法1.2.1 抑抑制

6、剂的的制备：全合成成化合物物19 (a-j) 由本实实验室周周金林博博士提供供；化合合物1-18由由郭新东东博士提提供从中中药山芝芝麻和筋筋骨草中中分离的的有效成成分，结结构如下下：1 22 3 4 55 67 88 910 11 122 113 14 155 166 117 181.2.2 化化合物对对乙酰胆胆碱酯酶酶的抑制制活性测测定取5支11.5 mL分分别装有有8400 m L 0.11 M pH 8.00磷酸盐盐缓冲溶溶液的梨梨型管，依依次加入入0，55，100，200，355，500 m L 1.00 mMM的样品品DMSSO溶液液，并用用DMSSO补齐齐至总体体积为8890 m

7、L。分分别加入入50m L 44 mgg/mLL 5, 5-二硫代代双 (2 -硝基苯苯甲酸 )和110 mL乙乙酰胆碱碱酯酶溶溶液（00.1mmg/mml），并并在377保温115 mmin。立立即加入入50L2 mg/mL硫硫代乙酰酰胆碱溶溶液，摇摇匀后测测其在= 4412 nm处处的A值值(Ann)。参参比用00.1 M ppH 88.0磷磷酸盐缓缓冲溶液液。以未未加样品品所测得得的Acconttroll值作为为1000个活力力单位：相对酶活活力(An /AAconntrool)1000然后以酶酶的相对对活力对对抑制剂剂浓度作作图，根根据抑制制曲线求求得各种种化合物物的ICC50值（抑抑

8、制酶活活力500时的的抑制剂剂浓度）。1.2.3 乙乙酰胆碱碱酯酶的的抑制动动力学测测定取5支11.5 mL分分别装有有8400，8555，8865，8880，8885 mLL 0.1 MM pHH 8.0磷酸酸盐缓冲冲溶液的的梨型管管，加入入一定量量的样品品溶液，并并用DMMSO补补齐至总总体积的的5。分分别加入入50 mLL 4 mg/mL 5, 5 -二硫硫代双 (2 -硝基基苯甲酸酸 )和和10mLL乙酰胆胆碱酯酶酶溶液，并并在377保温115 mmin。立立即分别别加入550，335，225，110，55mL2 mg/mL硫硫代乙酰酰胆碱溶溶液，摇摇匀后测测其在=4112 nnm处的

9、的时间扫扫描曲线线。曲线线的斜率率即为反反应的初初速度V，然然后以11/VV对11/SS作图图，以不不加抑制制剂的为为控制线线。2 结果果与讨论论2.1 吲哚喹喹啉生物物碱衍生生物对AACh E的抑抑制活性性表1 吲吲哚喹啉啉衍生物物对ACCh EE的抑制制IC550值ComppounndXnRIC500(mM)pH=77pH=8819aNH2N(CHH3)2384219bO2N(CHH3)27389.5519cNH3N(CHH3)24.841.5519dO3N(CHH3)2576819eNH223.772919fO2202219gNH2OH213019hO2OH5376.55Comppoun

10、ndXnRIC500(mM)pH=77pH=8819iNH-4623519jO-58163从他克林林等化合合物的结结构可以以看出，它它是一种种喹啉衍衍生物，具具有三环环结构，而而我们所所合成的的吲哚喹喹啉衍生生物在结结构上与与他可林林有许多多相似之之处，为为此我们们研究了了它们对对乙酰胆胆碱酯酶酶的抑制制活性，结结果见表表1。实验结果果表明，吲吲哚喹啉啉类衍生生物（119a-19jj）对乙乙酰胆碱碱酯酶均均有明显显的抑制制作用，化化合物119c的的抑制效效果最好好(ICC50=44.8mMM) 。五五元环上上X原子子为NHH的抑制制效果比比O好，原原因是NNH可增增加环的的共轭性性，使四四个环

11、在在一个平平面上；而O使使环面不不在同一一个平面面上，增增加了空空间位阻阻，对酶酶的抑制制作用降降低。化化合物119c比比19aa侧链上上多了一一个碳原原子，抑抑制酶效效果增强强，说明明碳链的的长短对对抑制活活性起作作用。另另外，抑抑制剂侧侧链上有有亲脂性性的阳离离子头能能更好的的被酶的的作用位位点吸附附而较好好地抑制制酶的活活性，化化合物119b，119e的的抑制活活性都没没有199c好可可能是由由于199b的羟羟基不易易以正离离子形式式存在，而而19ee苯酚不不是脂肪肪族侧链链，且位位阻较大大，也没没有阳离离子头，较较难产生生抑制作作用。此此外，该该系列化化合物的的pKaa值都在在8左右右

12、。pHH7时时化合物物以盐的的形式存存在，环环上的NN带正电电荷；ppH=88时化合合物没有有成盐，不不能很好好抑制酶酶的活性性。可以以看到上上表中所所有化合合物都在在pH7的酸酸碱体系系中有更更好的抑抑制效果果。 由以上讨讨论，我我们可得得出以下下几个影影响抑制制剂抑制制活性的的因素：（1）分分子中心心存在一一个吲哚哚喹啉的的共轭环环；（2）侧侧链上存存在一个个亲脂性性阳离子子头；（3）脂脂肪族侧侧链大于于两个CC原子；（4）合合适的体体系pHH值。2.2 中药有有效成分分（化合合物1-18）对对ACh E的活活性抑制制由表2可可以看出出，五环环三萜类类化合物物4、5、6和7具有较较好的活活

13、性，与与这些化化合物的的大分子子结构有有关，其其中化合合物5的的抑制活活性最好好(IC500=13.2mM)，可能能由于它它的大分分子结构构容易和和酶的活活性部位位结合。其其次是化化合物110整个个分子形形成了大大共轭结结构，具具有很好好的活性性(IC500=233.8mMM)。合成的的醌类化化合物和和中间体体对ACCh EE的抑制制活性都都比较差差，或者者是没有有活性，或或者是由由于化合合物分子子太小，不不能与乙乙酰胆碱碱酯酶发发生结合合，因而而不能有有效抑制制酶的活活性；而而同样是是萘醌结结构的化化合物具具有较好好的活性性，可能能是化合合物122中含一一个二氢氢呋喃环环，使分分子形成成三环

14、的的平面结结构，扩扩大了分分子的面面积能与与乙酰胆胆碱酯酶酶内的多多个位点点作用，而而有较好好的活性性；甾醇醇8和甾醇醇糖甙99没有共共轭结构构，对AACh E没有有抑制作作用。表2 中中药有效效成分对对AChh E抑抑制的IIC500值ComppounndIC500(mM)ComppounndIC500(mM)1169.6777.882160.48No3No9No463.5513170.8513.2217162.7655.6614140.81228.3315No1023.8816No1149.6618NoNo表示示没活性性2.3 乙酰胆胆碱酯酶酶的抑制制动力学学研究为了研究究这些化化合物对对

15、乙酰胆胆碱酯酶酶的抑制制动力学学行为，我我们选取取了化合合物199c、119f、119g、119i、55、100、17和113进行行实验。根根据不同同浓度的的抑制剂剂和底物物存在下下所测得得的数据据绘制的的Linneweeaveer-BBurkk曲线见见图1。图1 化化合物与与乙酰胆胆碱酯酶酶反应的的Linneweeaveer-BBurkk图数据表明明化合物物19gg、199i、110对乙乙酰胆碱碱酯酶的的抑制为为混和型型抑制剂剂；化合合物199c、119f、113、117为非非竞争性性抑制剂剂，与酶酶的调控控部位结结合；大大分子化化合物55为竞争争性抑制制剂进入入酶的活活性中心心发生抑抑制作

16、用用。以上的结结果表明明化合物物19cc的抑制制效果最最好（IIC500=4.8mM），可可以作为为先导化化合物；而化合合物5（IIC500=133.2mMM）与目目前临床床用的抑抑制剂他他克林（IIC500=133.0mMM）具有有类似的的抑制效效果；由由于齐敦敦果酸型型的五环环三萜类类化合物物具有消消炎、增增强免疫疫、抑制制血小板板降集、降降糖以及及治疗急急性黄胆胆型肝炎炎和慢性性病毒肝肝炎的作作用112，我我们可以以将它作作为具有有多种功功能的药药物来开开发。其其次是具具有苯环环和共轭轭的萘醌醌类化合合物122（ICC50=228.33mM）和110（IIC500=233.8mMM）及吲

17、吲哚喹啉啉衍生物物，它们们也有较较好的抑抑制活性性，可以以将它们们作为先先导化合合物，在在分子中中引入带带正电荷荷基团如如氨/胺胺基，增增强分子子与ACCh EE的作用用，提高高它们的的抑制效效果。致谢本研研究是在在马林教教授，郭郭新东和和周金林林两位博博士的悉悉心指导导和帮助助下完成成的，他他们对科科学严谨谨的态度度和孜孜孜不倦的的精神使使我受益益菲浅，在在此对他他们表示示衷心的的感谢。同同时还要要感谢化化工学院院创新基基金对本本研究提提供的资资助。参 考 文 献献1 Barttus BT, Deean Rl, Poonteecorrvo MJ, ett all. TThe choolinn

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19、ypicc accetyylchholiine-binndinng pprotteinn. SScieencee, 119911, 2235:87223 Plgaar LL., Hullaszz P. Cuurreent proobleems in meccha-nissticc sttudiies of serrinee annd ccystteinne pprotteinnasees. Bioocheem. J., 19982 ,2007:11-1004 董悦生, 郑智智慧, 张谦等等. 微微生物来来源的乙乙酰胆碱碱酯酶抑抑制剂NN98-10221A的的研究. 中国国抗生素素杂志, 200

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24、tt all. AAcettylcceollineesteerasse iinhiibittingg trriteerpeenoiidall allokaaoidds ffromm Buuxuss hyyrcaana. Heeterrocyyclees, 49, 4881-4488Studdiess onn Innhibbitiionffor AChh Ebby AActiive Commpouundss annd AAnallogss inn Chhineese Traadittionnal MMediicinneBao Yaddan Maa Liin*(Schhooll off Chhem

25、iistrry aand Cheemiccal Enggineeeriing, ZhonngshhanUUnivverssityy,Guaangzzhouu 51102775)AbsttracctChhineese Traadittionnal Meddiciine is inccreaasinnglyy a foccus of atttenttionn ass a pottenttiall soourcce oof nnew druugs. Inn ouur rreseearcch , soome commpouundss (ssepaaratted andd syynthhesiizedd

26、) wweree ussed to exaaminne ttheiir aantii-chholiinessterrasee acctivvityy. Thhe ppressencce oof aarommatiic rringg annd cconjjugaate strructturee waas ffounnd tto hhavee goood choolinnestteraase inhhibiitorry aactiivitty wwhenn teesteed ffor thee innhibbitiion of eleectrric eell aceetyllchoolinnestteraas. Amoong theem , coompooundd 199c sshowwed thee moost pottentt innhibbitoory acttiviity (ICC50=44.8M).Keywwordds acettylcchollineesteerasse , innhibbitoor , ICC50 , dyynammicss19