09级细胞生物学技术iyp.docx

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1、1细胞培培养的概概念？习习惯上泛泛指所有有的体外外培养，即即器官培培养，组组织培养养，和细细胞培养养的总称称。 在在无菌条条件下,从动物物(植物物也可)或在人人体中取取出组织织或细胞胞,置于于模拟体体内的生生理环境境中(无无菌,适适当的温温度和一一定的营营养条件件)使之之生存和和增殖生生长的技技术方法法。用于于研究细细胞、组组织的代代谢、增增殖、分分化、形形态和功功能变化化，各种种理化因因子对活活细胞的的影响。2体外细细胞的分分化特点点？细胞胞分化：在个体体发育过过程中，子子代细胞胞产生形形态、结结构和功功能差异异的过程程。（细细胞的形形态结构构、生化化特征、生生理功能能为细胞胞分化的的三项指

2、指标），由于体体外培养养细胞失失去了神神经、激激素等体体液的调调节和细细胞间相相互影响响，经多多次传代代增殖，久久之则发发生如下下变化:分化现现象逐渐渐减弱或或不显，形形态与功功能趋于于单一化化，或传传一定代代数后衰衰老死亡亡；发生生转化，获获不死性性而成为为能无限限传代的的连续细细胞系或或恶性细细胞系。 3体外培培养细胞胞的分型型 ？并并说明各各自的形形态特点点?分型:1贴壁型型细胞(上皮细细胞型,成纤维维细胞型型,游走走细胞型型) 22悬浮型型细胞.形态特特点1.上皮样样细胞型型:仅形态态上似体体内上皮皮细胞，实实际上不不完全等等于体内内同名的的细胞。来来源：来来源于外外胚层，内内胚层细细

3、胞如：皮肤及及其衍生生物 ；消化道道，乳腺腺，肺泡泡；上皮皮性肿瘤瘤形态：类似体体内的上上皮细胞胞。扁平平，不规规则多角角形，中中有圆形形核。生生长特点点：易相相连成片片，相靠靠紧密相相连成薄层层铺路石石状。生生长时呈呈膜状移移动，很很少脱离离细胞群群而单个个活动。2.成纤维样细胞型名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的细胞来源：由中胚层间质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞；心肌，平滑肌，成骨细胞形态：似体内成纤维细胞的形态胞体梭形或不规则三角形胞质向外伸出23个长短不等的突起中有卵圆形核.生长特点：排列成放射状，漩涡状并不紧靠连成片，细胞细胞接触易断开而单独行动,游离的单独的成纤维样细胞，

4、常有几个伸长的细胞突起.3.游走型细胞(不定型)：本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且不规则.常见于羊水细胞培养的早期.4悬浮生长型细胞概念：培培养时不不贴附于于底物而而呈悬浮浮状态生生长或以以机械方方法使保保持悬浮浮状态下下生长.来源:来自血血，脾或或骨髓，尤尤以血中中白细胞胞多见，癌癌肿细胞胞也可能能。特点点：在悬悬浮液中中生长良良好、细细胞圆形形，单个个或小细细胞团。优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)易于收获可获得稳定状态.缺点：观察不方便很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)4那些培培养条件件改变时时，细胞胞

5、形态可可有变化化？（见见表一）组织和细胞供体年龄。培养条件。细胞的粘附。培养技术方法。促生长因子。组织和细胞供体年龄：幼年个体比老年者易于培养，所有动物的胚胎组织都是最好的培养对象。来自同一个体的组织，分化低的比分化高的容易培养。培养条件：不同的细胞对培养基需求不同，当前尚无一种培养基是万能的，应选择相应的培养基。应了解所培养细胞的生物学形状和特殊需求成分。血清，Hela：高血清成纤维细胞样低血清上皮样细胞。pH，Hela：太酸或太碱，成纤维细胞样；标准pH，上皮样细胞。细胞密度 3T3：低密度，成纤维细胞样，高密度，上皮样细胞。生长状态改变：悬浮或贴附：悬浮时圆形 ，贴附成纤维或上皮样。转化

6、与否：未转化，成纤维样，转化后，可成上皮样。 5简述每每代贴附附生长细细胞的生生长过程程分哪几几期？游游离期 ： 细细胞接种种后在培培养液中中呈悬浮浮 状态态也称称悬浮期期此时细细胞质回回缩，胞胞体呈圆圆球形。贴壁期：细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟4小时贴壁。潜伏期此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为624小时。对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。机制：接触抑制、密度依赖性。（接触抑制：当一个贴壁生长的体外正常细胞生长至与另一个细胞的表面相互接触时，便停止了分裂增殖，

7、相互虽然紧密接触，但不形成交叉重叠生长，也不进入S期。密度抑制（density inhibition）：细胞数量到一定数量后引起抑制增殖的现象。6影响贴贴壁的因因素和促促进细胞胞粘附措措施有哪哪些？11因素：（1）各各种细胞胞强弱： (附附着最强强)巨噬噬细胞、成成纤维细细胞；上上皮细胞胞、血细细胞(最最弱)。（22）生物物因素：血清、培培养液中中的促附附着因子子。（33）机械械，物理理等因素素（离心心：促进进附着。流流动：培培养液流流动可阻阻止细胞胞附着。低低温：可可抑制附附着）22措施：（1）包包被：对对分化程程度高、生生长能力力差的细细胞，可可在培养养瓶皿表表面包被被有利于于细胞粘粘附和

8、生生长的生生物活性性物质. 血清清内含有有多种能能够促进进细胞粘粘附的成成分，细细胞本身身也可能能产生一一些粘附附分子。（22）减少少接种时时培养液液的量：待细胞胞粘附和和贴壁之之后，再再补充足足够的培培养液。（33）减少少培养液液中血清清的含量量，使培培养液黏黏度降低低。（44）培养养液中离离子成分分及其浓浓度。如如，培养养液中的的Ca22+含量量过低时时不利于于细胞的的粘附、贴贴壁和铺铺展。（55）培养养液的温温度: 低温会会减低细细胞的活活动，妨妨碍黏附附和贴壁壁 。7原代培培养的概概念：取自体体内新鲜鲜组织并并置于体体外条件件下生长长的细胞胞在传代代之前称称为原代代培养。原原代培养养与

9、体内内原组织织很相似似，具异异质性，相相互依存存性强，细细胞克隆隆形成率率低。此此期一般般持续114周。8简述体体外培养养细胞的的分期？原代培培养期:取自体体内新鲜鲜组织并并置于体体外条件件下生长长的细胞胞在传代代之前称称为原代代培养原原代培养养与体内内原组织织很相似似，具异异质性，相相互依存存性强，细细胞克隆隆形成率率低。此此期一般般持续114周。传代期期:细胞在在培养器器皿中生生长一定定时间后后，被分分开接种种到新的的培养器器皿中（不不论稀释释与否）。持持续时间间最长，其其特 点是是细胞增增殖旺盛盛，并能能维持二二倍体核核型。衰退期期:此期细细胞仍然然生存，但但增殖很很慢或不不增殖，细细胞

10、形态态轮廓增增强，最最后衰退退凋亡。9举例说说明细胞胞生长曲曲线的制制作方法法？计算细细胞浓度度2次，得得出细胞胞浓度平平均值。然然后，将将细胞悬悬液等量量加入培培养板的的每个孔孔中，培培养时间间7天。每隔24小时吸去3个孔的培养板，加入消化液，混悬细胞，计算细胞数目。每个孔计数2次，得出细胞浓度平均值。绘制细胞生长曲线，横坐标为培养时间，纵坐标为细胞浓度。10. 体外培培养细胞胞生长的的条件（1）细胞的的营养需需要：氨氨基酸、单单糖、维维生素、无无机离 子、微微量元素素、激素素、生长长因子等等。（2）细胞的的生存环环境：温温度: 37 、O2、CO2: 5% CCO2 +H2O HH2CO3

11、 H+ + HCOO3-、pH: 7.2-77.4、渗渗透压。（3）无污染。（4）无毒11. 选择血血清需注注意事项项有哪些些？注意意事项：血清质质量好坏坏是实验验成败的的关键。常用血清有胎牛血清（剖腹产）、新生牛血清（小于24h）、小牛血清（1030D）、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56 ，30 分钟。血清的消毒：过滤除菌一般说来含5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死但支持细胞生长一般需加 10血清对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清

12、楚血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。12. 简述完完全培养养基的组组成及配配制方法法?组成：基础培培养基880一一95血血清 55一200碳酸氢钠钠2.00 g/L青、链链霉素各各1000单位毫升.配制方方法:认真阅阅读说明明书配制时时要保证证充分溶溶解，各各种物质质要在培培养基完完全溶解解后添加加配制水水应为双双蒸水或或三蒸水水所用器器皿应十十分清洁洁配制好好后马上上过滤，低低温无菌菌保存。13.什什么时候候需要进进行过滤滤除菌？简述过过滤除菌菌的全过过程？将液体体或气体体用微孔

13、孔虑膜过过滤,使大于于孔径的的的细菌菌等微生生物颗粒粒阻留,达到除除菌的目目的.常用于于不易高高压灭菌菌的物品品。如：培养液液、各种种酶类等等。14.细细胞培养养实验中中，使用用过的玻玻璃和塑塑料制品品应如何何处理后后重复使使用？11. 常常用玻璃璃器皿清清洗：浸泡（自自来水）-刷洗（洗洁精）-酸泡5盐酸过夜（不少于6小时）-流水冲洗-蒸溜水浸泡和冲洗（注满水倒空）-50烘干-121高压蒸汽灭菌20min2. 塑塑料制品品的清洗洗： 料料自制品品现多是是采用无无毒并已已经特殊殊处理的的成品，打打开包装装即可用用,多为为一次性性物品。必必要时用用：2% NaaOH浸浸泡过夜夜-自来来水充分分冲洗

14、，清清洁液洗洗刷 55%盐酸酸溶液浸浸泡300分钟-自来水水和蒸馏馏水冲洗洗（15520遍）-晾干干备用 ,紫外外线直接接照射或或辐照灭灭菌15无无菌操作作的注意意事项？1.凡是是带入超超净工作作台内的的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75酒精擦拭瓶子的外表面2.靠近酒精灯火焰操作。3.器皿使用前必须过火灭菌4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染16. 分别指指出下列列物品通通常使用用那种消消毒方法法进行消消毒？（培培养室、工工作台、

15、，玻玻璃制品品、，金金属器械械、，塑塑料制品品，橡胶胶制品，培培养用液液、，布布类）.消毒方方法分为为三类：（A）物理灭灭菌法（紫紫外线、湿湿热、过过滤等）。（B）化学灭菌法（各种化学消毒剂）。 （ C）抗生素。1. 紫外线消毒：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒和培养器。紫外线灯应距地面已2.0米为宜，且消毒的物品不宜相互遮档，照射不到的地方起不到消毒作用。时间30分钟。2. 温热消毒：即高压蒸气消毒，是一种使用最广泛、效果最好的消毒方法。常用物品消毒压力及时间：培养液、橡胶制品10磅10分钟；布类、玻璃制品、金属器械18磅20分钟。3. 过滤消毒：将液体或气体用微孔虑膜过滤,使大

16、于孔径的的细菌等微生物颗粒阻留,达到除菌的目的.常用于不宜高 压灭菌的物品。如：培养液、各种酶类等。4化学消毒法：利用消毒剂来消毒那些不能用物理方法消毒的物品和场地。最常见的是75%酒精及1的新洁而灭，前者主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理。后者则主要用器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒。5抗生素消毒：即抗生素灭菌，主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染。17. 你认为为细胞培培养中微微生物污污染主要要是通过过那些途途径导致致的，并并简要说说明。(1)空空气：空气是是微生物物传播的的最主要要途径。如净化工作台使用过久，滤器受尘埃阻塞，可使净化工作不能正常进行。工作时不戴口罩

17、或面对操作野大声讲话、咳嗽等使外界气流过强。污染空气可侵入操作野，造成污染。因此工作时减少空气流动是防止污染的重要环节。(2)器材：各种培养器皿及器械清洗消毒不彻底，例如洗刷不干净污物残留及培养用液等灭菌不彻底都可以引入有害物质。另外需要注意的是CO2温箱由于温箱内湿度大，温度适宜，取存细胞时不慎将培养液漏出，易使细菌、霉菌孽生，而CO2温箱内是开放式培养如不定期消毒,可形成污染. (3）操作：实验操作无菌观念不强、动作不准确、使用污染的器具或封瓶时不严，都可发生污染。培养两种以上细胞时，操作不规范、交叉使用吸管或营养液瓶等有可能导致细胞交叉污染。(4)血清：有些血清在生产时就已被支原体或病毒

18、等污染，即可成为污染的来源。(5）组织样本：原代培养的污染多数来源于组织样本；另一方面手术时使用碘酒消毒，这些混入组织中的碘可以影响细胞生长。18.常常用清洁洁液的配配制成分分有哪些些？配制制时需注注意什么么？（见见表二）19.常常用的胰胰蛋白酶酶的浓度度是多少少？应如如何配制制?如何何终止其其活性？胰蛋白白酶作用用于与赖赖氨酸或或精氨酸酸相连接接的肽健健，除去去细胞间间粘蛋白白及糖蛋蛋白，影影响细胞胞骨架，从从而使细细胞分离离。胰蛋蛋白酶液液浓度越越高，作作用越强强，但超超过一定定限度会会损伤细细胞。胰胰蛋白酶酶是一种种黄白色色粉末，溶溶解及作作用的最最佳PHH是89，用无无Ca22+、Mg

19、22+的PBSS缓冲液液配制，常常用的胰胰蛋白酶酶液浓度度是0.25。用滤滤器过滤滤除菌。胰胰蛋白酶酶液消化化时间：2-110分钟钟。用含含血清培培养液终终止其对对细胞的的消化作作用（1）EDDTA液液：常用用浓度为为 0.02，配制制时采用用无Caa2+、Mg2+平衡盐盐液溶解解，高压压灭菌后后即可使使用。（22）胰蛋蛋白酶、EDTA:胰蛋白酶和EDTA联合使用可提高消化率，但需注意EDTA不能被血清中和，消化后要彻底清洗，否则细胞易脱壁。（3）胶原酶：适于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织，可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害。钙、镁离子和血清成分不会影响胶原酶的消化作用，因而可用BSS或含

20、血清的培养液配制，这样实验操作简便同时提高细胞成活率。但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。胶原酶的常用剂量为 200 Uml（约为 lmgml）或 00303。最佳PH是6.5。20.名名词解释释：细胞胞株 密密度抑制制 接触触抑制 原代培培养 传传代1细胞株株（ceell strrainn）：通过过选择法法或克隆隆形成法法从原代代培养物物或细胞胞系中获获得的具具有特殊殊性质或或标志的的培养物物称细胞胞株。2密度抑抑制（dennsitty iinhiibittionn）：细胞胞数量到到一定数数量后引引起抑制制增殖的的现象3接触抑抑制（conntacct iinhiibittionn）：细

21、细胞汇合合相互接接触后失失去运动动的现象象。4原代培培养（priimarry ccultturee）：从从体内取取出细胞胞或组织织的第一一次培养养。5传代（passsagge）也称再再培养无无论是否否稀释，将将细胞从从一个培培养瓶转转移或移移植到另另一个培培养瓶即即称为传传代或传传代培养养。也称称再培养养。21细细胞冻存存与复苏苏的基本本原则是是什么？1慢冻快快融2当细胞胞冷到零零度以下下，可以以产生以以下变化化：细胞胞器脱水水，细胞胞中可溶溶性物质质浓度升升高，并并在细胞胞内形成成冰晶。3如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和

22、破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。22冻冻存液的的作用是是什么？（1）保保存种子子细胞，以以便随时时取用。这这是保存存细胞的的最主要要目的。（22）减少少细胞被被微生物物污染的的危险性性。（33）减少少细胞之之间交叉叉污染的的危险性性。（44）减少少细胞因因传代培培养而引引起的遗遗传变异异和形态态改变。（55）避免免有限细细胞系出出现衰老老或恶性性转化。降低人力和物力。23为为什么细细胞计数数时，细细胞悬液液逸出槽槽外时要要重做？公式中中除以44因为计计数了44个大格格的细胞胞数。 公式中中乘以22因为细细胞悬液液于染液液是1：1稀释释。 公公式中乘乘以1004

23、因为为计数板板中每一一个大格格的体积积为： 1.00mm（长长）1.00mm（宽宽）0.11mm（高高）00.1mmm3 而 1mll10000mmm3 24. 在细胞胞培养中中如何防防止污染染？（11）使用用抗生素素清除细细菌和真真菌。预预防用药药一般用用双抗生生素，污污染后清清除用药药需采用用大于用用量510倍倍的冲洗洗法。于于加药后后作用224448小时时，再换换常规培培养液。（2）用MRA（mycoplasma removal agent）处理细胞，每4天换一次液，连续处理15天清除支原体效果好。另外将受支原体污染的细胞放置在41作用510h最长不超过18h，以杀灭支原体25. 培养细

24、细胞的生生长测定定方法11,细胞计计数法22,台盼兰染染色法33,MTTT比色法法4,细胞生生长曲线线法5,3HH-TTdR(3HH-胸胸腺嘧啶啶核苷）掺掺入法66,BrddU (5-bbrommo-22deooxyuuriddinee，5-溴脱氧氧尿嘧啶啶核苷 ）掺入入法26. 如何估估计是否否传代及及传代的的方式？估计:(1)细胞没没有生长长到足以以覆盖瓶瓶底壁的的大部分分表面以以前，不不要急于于传代。(2)原代培养时细胞多为混杂生长，上皮样细胞和成纤维样细胞并存的情况很多见传代时不同的细胞有不同的消化时间，因而要注意观察及时进行处理。并可根据不同细胞对胰蛋白酶的不同耐受时间而分离和纯化所

25、需要的细胞。另外，早期传代培养的细胞较已经建系的培养消化时间相对较长。吹打细胞时动作要轻巧尽可能减少对细胞的损伤。 (3)首次传代时细胞接种数量要多一些使细胞能尽快适应新环境而利于细胞生存和增殖。随消化分离而脱落的组织块也可一并传入新的培养瓶。细胞传代过程需注意的问题：操作全过程注意无菌操作；胰酶消化时间要适度；吹打细胞时用力要适度，尽量减少气泡。在传代期培养时应注意：为保持二倍体细胞性质，细胞应在传代后早期冻存（不出10代内冻存）。少数细胞系在此期可能发生自发或诱发转化，获得不死性而成为无限细胞系，此时细胞核型多变成异倍体。方式:1.悬浮生长细胞传代.离心法传代：离心（1000转/分）去上清

26、，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l223，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2 .半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹 打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3.贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。27组组织细胞胞取材及及培养的的基本要要求1、取取材的组组织最好好尽快培培养。22、取材材时应严严格无菌菌操作。33、防止止细胞机机械损伤伤：取材材和原代代细胞制制作时耍用锋锋利的器器械，44、避免免组织干干燥：要要仔细去去除所取取材料上上的血液液(血块块)、脂脂肪

27、、坏坏死组织织及结缔缔组织，切切碎组织织时应避避免组织织干燥，可可在含少少量培养养液的器器皿中进进行。55、原代代培养，特特别是正正常细胞胞的培养养，应采采用营养养丰富的的培养液液。6、一一般来讲讲胚胎胎组织较较成熟个个体的组组织容易易培 养分分化低的的较分化化高的组组织容易易生长、肿肿瘤组织织较正常常组织容容易培养养。取材材时应尽尽量选用用易培养养的组织织进行培培养。77、为了了便于以以后鉴别别原代组组织的来来源和观观察细胞胞体外培培养与原原组织的的差异性性原代代取材时时要同时时留好组组织学标标本和电电镜标本本，并详详细记录录。28. 简述原原代细胞胞培养方方法及注注意事项项?常用的的有两种

28、种: 细胞胞培养法法 和 组织块块法细胞培养养法(11)按组组织的消消化分离离法收获获细胞。(2）在消化过程中可随时吸取少量消化液在镜下观察。(3)已过滤的消化液，800一1000rpm，低速离心5min后，去除上清，加含血清培养液，轻轻吹打形成细胞悬液。如果用胶原酶或EDTA应先用缓冲液洗。组织块法法（1）取材材、修剪剪、组织织剪或切切成1mmm3左右的的小块。(2)将剪切好的组织小块用眼科镊送入培养瓶内。25ml培养瓶(底面积约为17.5cm2）以20一30小块为宜。(3）放置24h待组织小块贴附后将培养瓶慢慢翻转平放、静止培养。注意事事项组织块块接种后后l33天，由由于游出出细胞数数很少

29、组织块块的粘贴贴不牢固固在观观察相移移动过程程中要注注意动作作轻巧尽量不不要引起起液体的的振荡而而产生对对组织块块的冲击击力使其其漂起。在在原代培培养的11一2d内要要持别注注意观察察，是否否有细菌菌、霉菌菌的污染染一旦旦发现，要要及时清清除，以以防给培培养箱内内的其它它细胞带带来污染染。 对对原代培培养要及及时观察察发现现细胞游游出后要要照像记记录。原原代培养养355d需换换液一次次去除除漂浮的的组织块块和残留留的血细细胞，因因为已漂漂浮的组组织块及及很多细细胞碎片片含有有有毒物质质，影响响原代细细胞的生生长，要要及时清清除。注注意事项项:1组织块块接种后后l33天，由由于游出出细胞数数很少

30、组织块块的粘贴贴不牢固固在观观察相移移动过程程中要注注意动作作轻巧尽量不不要引起起液体的的振荡而而产生对对组织块块的冲击击力使其其漂起。2在原代培养的1一2d内要持别注意观察，是否有细菌、霉菌的污染一旦发现，要及时清除，以防给培养箱内的其它细胞带来污染。3原代培养35d需换液一次去除漂浮的组织块和残留的血细胞，因为已漂浮的组织块及很多细胞碎片含有有毒物质，影响原代细胞的生长，要及时清除。29判判断细胞胞健康的的标准是是什么？1形态态学2细细胞染色色体分析析3同工工酶检查查4DNNA指纹纹技术检检测5抗抗原标记记6细胞胞生长实实验30. 培养过过程中支支原体和和病毒污污染的特特点是什什么？支支原

31、体是是介于细细菌与病病毒之间间能独立立生活的的最小微微生物，最最小直径径0.22um，一一般过滤滤除菌无无法去除除它，光光镜下难难以看清清它的形形态结构构。开始始不易发发现，能能在偏碱碱条件下下生存，对对青霉素素有抗药药性。多多吸附于于细胞表表面或散散在于细细胞之间间。培养养细胞受受支原体体污染后后，部分分敏感细细胞可见见细胞生生长增殖殖变慢，部部分细胞胞变圆，从从瓶壁脱脱落。但但多数细细胞污染染后无明明显变化化，或略略有变化化，若不不及时处处理，还还会产生生交叉污污染31.简简述流式式细胞术术的基本本概念。流式细胞术是二十世纪七十年代发展起来的高科学技术,流式细胞仪集计算机技术、激光技术、流

32、体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体,同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状, 还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析,在短时间内检测分析大量细胞, 并收集、储存和处理数据, 进行多参数定量分析;能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度95%。与传统荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点， 成为当代最先进的细胞定量分析技术。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。流式细胞仪的工作原理：待测样品制成单个细胞的悬液，经特异性荧光染料对细胞（或表面抗原等）染色后放入上样管中，在清洁气体的压

33、力下将待测样品压入流动室，与此同时，不含细胞的磷酸盐缓冲液（鞘液）在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。32.阐阐述流式式细胞仪仪的工作作原理。待测样品制成单个细胞的悬液，经特异性荧光染料对细胞（或表面抗原等）染色后放入上样管中，在清洁气体的压力下将待测样品压入流动室，与此同时，不含细胞的磷酸盐缓冲液（鞘液）在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方

34、向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。 流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。33.细细胞经过过荧光染染色，在在流式细细胞仪的的激

35、光束束照射下下，会产产生哪三三大信号号？这三三大信号号分别代代表什么么？1前向角角散射，即即FSCC，与细细胞直径径成正相相关，所所以我们们平时上上机的时时候，有有时用FFSC做做阈值，排排除碎片片及其它它颗粒，避避免干扰扰。2侧向角角散射，即即SSCC，是指指与激光光束正交交90度方方向的散散射信号号，它对对细胞膜膜、胞质质、核膜膜的折射射率更敏敏感，可可以提供供细胞内内结构及及颗粒性性质的信信息.这两种种信号同同时被前前向光电电二极管管和900方向的的光电倍倍增管接接收。前前向光散散射信号号在前向向小角度度进行检检测，这这种信号号基本上上反映了了细胞体体积的大大小。33荧光信信号的接接受方

36、向向与激光光束垂直直，经过过一系列列双色性性反射镜镜和带通通滤光片片的分离离，形成成多个不不同波长长的荧光光信号。这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。34.在在流式细细胞仪检检测中，鞘鞘液有哪哪些作用用？鞘液液的作用用有二：一是约约束样品品使之在在喷嘴中中心以提提高测量量精度；二是防防止样品品靠近喷喷孔壁以以避免堵堵塞喷

37、孔孔。在这这种约束束作用下下，细胞胞排成单单列一个个跟随一一个地在在鞘液包包裹下由由流动室室下面的的喷嘴中中心喷出出，形成成细胞液液柱。液液柱与入入射的高高度聚焦焦的激光光束相交交，此时时，细胞胞上的荧荧光染料料被激发发而产生生特异性性荧光。在在与入射射激光和和液柱都都垂直的的方向设设置有荧荧光测量量系统，包包括透镜镜、光阑阑、滤片片、检测测器等，将将细胞的的荧光信信号变成成电信号号输出到到计算机机，用专专用软件件进行分分析。35.在在流式细细胞仪样样品制备备中，评评价一个个样品制制备的优优劣，有有哪三个个评价指指标？细胞的的密度，不不能低于于11066/mll 非特异异荧光，不不超过11.细

38、胞碎碎片和聚聚集体，不不能出现现肉眼可可见的团团块。36.列列举流式式细胞仪仪在生物物医学中中的应用用。1HLAA-B227分析析2细胞周周期分析析3凋亡分分析4淋巴细细胞亚群群分析55白血病病分型66细胞因因子分析析7血小板板分析88干细胞胞分析99流式细细胞仪在在其它方方面的应应用37.简简述流式式细胞仪仪检测HHLA-B277软件的的工作原原理。HHLA-B277基因表表达在所所有含核核的细胞胞上，尤尤其是淋淋巴细胞胞的表面面含量丰丰富。HHLA-B277软件首首先在FFSC-FL22的点图图上确定定CD33强阳性性细胞群群体的位位置，设设定一个个CD33+T淋淋巴细胞胞门，然然后再根根

39、据FSSC设定定光散射射门，去去除FSSC过大大或过小小的细胞胞，确保保门内至至少有550%的的CD33+T淋淋巴细胞胞，这样样通过二二者的结结合，将将随后进进行的分分析严格格地定位位在T淋巴细细胞上。在在检测之之前，仪仪器已经经CalliBRRITEE beeadss和HLAA-B227 ccaliibraatioon bbeadds调试试成功，并并通过试试剂批号号的后缀缀确定了了deccisiion marrkerr的位置置。38.简简述流式式细胞仪仪检测HHLA-B277的实验验步骤。（见表三）39.流流式细胞胞仪分析析的主软软件名称称？校准准仪器的的软件名名称？流流式细胞胞仪数据据显示

40、通通常有哪哪几种方方式？主主软件CCELLLQueest.仪器自自动校检检软件FFACSSCommp.存的数数据文件件虽然易易于加工工、处理理、分析析，但由由于数据据大，又又缺乏直直观性，不不利于观观察各参参数及其其相互的的关系。因因此，将将数据用用图形显显示更直直观，然然后再进进行统计计分析，这这是FCCM结果果分析中中最常用用的分析析方法。FCM数据显示通常有一维直方图、二维点图、二维密度图、二维等高图、假三维图等。40.FFACSSCallibuur流式式细胞仪仪（安装装4888和6335nmm激光）能能同时检检测到的的六大参参数分别别是什么么？41. 简述流流式细胞胞仪的特特点和检检测

41、范围围。1分析速速度快22 多参参数3当当代最先先进的细细胞定量量分析技技术4精精度高细胞结构构1细胞大大小2细胞粒粒度3细胞表表面面积积4核浆比比例5DNAA含量与与细胞周周期6RNAA含量77蛋白质质含量.细胞功功能1细胞表表面/胞胞浆/核核的特异异性抗原原2细胞活活性3细胞内内细胞因因子4酶活性性5激素结结合位点点6细胞受受体42. 在使用用流式细细胞仪进进行分析析时，为为什么要要进行光光谱重叠叠的校正正？当细细胞携带带两种荧荧光素如如PE和和FITTC, 受激光光激发而而发射出出两种不不同波长长的荧光光时，理理论上，可可选择滤滤片使每每种荧光光仅被相相应的检检测器检检测到，而而不会检检

42、测到另另一种荧荧光。但但由于目目前所使使用的各各种荧光光染料都都是宽发发射谱性性质，虽虽然它们们之间各各自发射射峰值各各不相同同，但发发射谱范范围有一一定的重重叠，FFITCC探测器器会探测测到少量量的PEE光谱，而而PE探探测器则则检测到到较多的的FITTC光谱谱。克服服这种误误差的最最有效方方法是使使用荧光光补偿电电路，利利用标准准已知样样品或荧荧光小珠珠，可合合理设置置荧光信信号的补补偿值。 43. 简述磷磷脂酰丝丝氨酸外外翻分析析(Annnexxin V法)联合PII法检测测细胞凋凋亡的原原理。磷磷脂酰丝丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细

43、胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为3536KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将正常细胞、凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开主要是通过PI与细胞

44、核DNA结合，测定细胞内DNA含量。亚二倍体峰的出现，实际上是由于细胞凋亡时DNA含量低于正常细胞，使其在直方图上表现为一个荧光强度比正常细胞要小的峰（亚二倍体峰），即凋亡细胞DNA对PI可染性降低。44.简简述TUUNELL法检测测细胞凋凋亡的实实验原理理细胞凋亡亡中染色色体DNNA的断断裂是个个渐进的的分阶段段的过程程，染色色体DNNA首先先在内源源性的核核酸水解解酶的作作用下降降解为550-3300kkb的大大片段。然然后大约约30 的染色色体DNNA在Ca +和和Mg+依赖赖的核酸酸内切酶酶作用下下，在核核小体单单位之间间被随机机切断，形形成18802000bp核核小体DDNA多多聚体

45、。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染色。45.简简述流式式细胞术术PI染色色进行细细胞周期期分析的的原理? PII ,即即碘化丙丙锭 ,可以与与细胞内内DNAA和RNAA结合 ,采用RNNA抑制制剂将RRNA消消化后 ,通过过流式细细胞术

46、检检测到的的与DNNA结合合的PII的荧光光强度直直接反映映了细胞胞内DNNA含量量的多少少。由于于细胞周周期各时时相的DDNA含含量不同同 ,通常常正常细细胞的GG1 /G0期期具有二二倍体细细胞的DDNA含含量 (2N) ,而而G2 /M期期具有四四倍体细细胞的DDNA含含量 (4N) ,而而S期的DNNA含量量介于二二倍体和和四倍体体之间。因因此 ,通过流流式细胞胞术PII染色法法对细胞胞内DNNA含量量进行检检测时 ,可以以将细胞胞周期各各时相区区分为GG1 /G0期期 ,SS期和G22 /MM期 ,并可可通过特特殊软件件计算各各时相的的百分率率。值得得注意的的是 ,PI不不能通过过细

47、胞膜膜完整的的细胞46、细细胞凋亡亡：凋亡（或或程序性性细胞死死亡）是是一个生生理性的的细胞自自我毁灭灭的过程程，在胚胚胎发育育、生物物体内环环境的稳稳定及多多细胞生生物防御御外在及及内在伤伤害方面面均起着着非常重重要的作作用。凋凋亡过程程的紊乱乱，可能能与许多多疾病的的发生有有直接或或间接的的关系，如如肿瘤、自自身免疫疫性疾病病、神经经退行性性变及局局部损伤伤等。能能够诱发发细胞凋凋亡的因因素很多多，如射射线、能能够引起起染色体体损伤的的药物、细细胞自身身表达的的一些受受体分子子等。47、显显微结构构:，细胞膜膜保持完完整一直直到形成成凋亡小小体, 染色质质聚集、分分块、位位于核膜膜上呈半半

48、月状，细细胞器无无明显变变化,细细胞体积积固缩变变小,凋凋亡小体体形成48、凋凋亡小体体49、细细胞坏死死:胞质内内线粒体体和内质质网肿胀胀、崩解解，结构构脂滴游游离、空空泡化，蛋蛋白质颗颗粒增多多，核发发生固缩缩或断裂裂在苏木木精/伊伊红染色色,胞质质呈均一一的深伊伊红色，原原有的微微细结构构消失。50、荧荧光激发发滤色镜镜分哪几几类?各各自的激激发波长长是多少少？激发滤色色镜为观观察不同同性质的的物体所所设计的的滤色镜镜或滤色色镜组，通通常可分分为紫外外激发(U激发发)、紫色色激发(V激发发)、蓝色色激发(B激发发)和绿色色激发(G激发发)等四种种。51、简简述细细细胞凋亡亡的形态态学特征征有哪些些？（见见表四）染色质聚集、分块、位于核膜上，胞质凝缩，最后核断裂， 凋亡小体内有结构