牛栏山酒厂清香大曲及酒醅中地衣芽孢杆菌的分离鉴定fgou.docx
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1、牛栏山酒酒厂清香香大曲及及酒醅中中地衣芽芽孢杆菌菌的分离离鉴定作者: 刘桂君君 闻泽泽喜 胡胡建华 郝文军军 刘红红霞 李李兰英 关闭本页 转载于:中国酿酒工业协会发布时间:2009-06-02T11:25:00 牛栏山山酒厂清清香大曲曲和酒醅醅中共分分离出223株芽芽孢杆菌菌,通过过一系列列生理生生化实验验包括柠柠檬酸盐盐与丙酸酸盐利用用实验、产产酶实验验、需厌厌氧实验验、V.P实验验、酪素素水解实实验、酪酪氨酸水水解实验验、酸性性培养基基实验、耐耐盐性实实验、生生长温度度实验、产产酱香实实验,综综合各项项实验性性能指标标,鉴定定出122株地衣衣芽孢杆杆菌,鉴鉴定结果果与中国国发酵工工业研究
2、究院分子子鉴定结结果一致致,本文文为地衣衣芽孢杆杆菌的鉴鉴定提供供一套比比较简便便、易行行的方法法。 关关键词 地衣衣芽孢杆杆菌、牛牛栏山酒酒厂、生生理生化化实验、基基酒 芽孢杆杆菌是大大曲中常常见微生生物,也也是重要要类群之之一。地地衣芽孢孢杆菌一一直以来来被认为为是酱香香型白酒酒高温大大曲中特特有的微微生物,就就我们研研究发现现,在牛牛栏山酒酒厂生产产用的多多种清香香大曲、出出池酒醅醅中同样样存在地地衣芽孢孢杆菌,对对分离出出23株株芽孢杆杆菌进行行生理生生化实验验,鉴定定出122株地衣衣芽孢杆杆菌,鉴鉴定结果果与中国国食品发发酵工业业研究院院分子鉴鉴定结果果一致。本本文主要要介绍地地衣芽
3、孢孢杆菌的的生理生生化鉴定定实验方方法,为为地衣芽芽孢杆菌菌的鉴定定提供比比较完备备的一套套方法。 1 地衣芽孢杆菌的分离 1.1材料 牛栏山酒厂生产用清香大曲、酿酒车间酒醅 1.2分离用培养基 肉汁培养基:牛肉膏0.3,蛋白胨1.0,NaCl 0.5,琼脂2.0,pH 7.0-7.2,121,灭菌30min。 1.3分离方法 取大曲干粉或酒醅0.5g,加入带有玻璃珠的无菌水三角瓶中,摇床培养30min,60水浴30min,然后用接种环蘸取,在肉汁培养基平板上划线分离。挑取单菌落继续划线分离,直到得到单菌落纯菌株为止。 2 地衣芽孢杆菌生理生化鉴定实验 根据上述分离培养基和分离方法,共计分离得
4、到芽孢杆菌23株,编号分别为1、2、3、422、23,接下来通过实验对这些菌株进行筛选和鉴定。地衣芽孢杆菌鉴定参考伯杰氏细菌鉴定手册及常见细菌系统鉴定手册(东秀珠,蔡妙英等编著)的方法,有所改进,以下为具体的生理生化实验鉴定方法。 2.1柠檬酸盐与丙酸盐利用实验 某些细菌能利用柠檬酸盐或丙酸盐作为唯一碳源,并利用磷酸铵作为氮源,将柠檬酸分解为二氧化碳,则培养基中由于有游离钠离子存在而呈碱性。培养基配方:柠檬酸钠(或丙酸钠)0.2,NaC1 0.5,MgSO47H2O 0.01,(NH4)2HPO4 0.1,K2HPO43H2O 0.1,1%溴百里酚蓝水溶液10ml,琼脂2。以上成分除指示剂外其
5、余加热溶解,调节pH6.8-7.0,并加入指示剂,使培养基呈草绿色,分装试管,灭菌后摆斜面。取幼龄菌种接种于斜面上,适温培养3-7d,培养基呈碱性(蓝色)者为阳性反应,不变者为阴性。只有地衣芽孢杆菌可以利用丙酸钠,为阳性反应,而其他芽孢杆菌均不能利用丙酸钠,为阴性反应,但很多种芽孢杆菌都可以利用柠檬酸钠。 2.2产酶酶实验 2.22.1过过氧化氢氢酶实验验过氧化化氢酶又又称接触触酶,能能催化过过氧化氢氢分解水水和氧。将将芽孢杆杆菌接种种于肉汁汁培养基基斜面上上,适温温培养118-224h。取取干净的的载玻片片,在上上面滴11滴3-5的的H2OO2,挑挑取1环环培养118-224h的的菌苔,在在
6、H2OO2溶液液中涂抹抹,若有有气泡(氧氧气)出出现,则则为过氧氧化氢酶酶阳性,无无气泡者者为阴性性。也可可将过氧氧化氢溶溶液直接接加到菌菌种斜面面上,观观察气泡泡的产生生。 22.2.2淀粉粉酶实验验 某些些细菌可可以产生生分解淀淀粉的酶酶,把淀淀粉水解解为无色色糊精等等小分子子,或进进一步水水解为麦麦芽糖或或葡萄糖糖。淀粉粉水解后后,遇碘碘不变蓝蓝色。 培养基基:在肉肉汤蛋白白胨琼脂脂中添加加0.22的可可溶性淀淀粉,分分装三角角瓶,1121 200minn灭菌备备用。卢卢戈氏(Luggol)碘液:碘片11g,碘碘化钾22g,蒸蒸馏水3300mml,先先将碘化化钾溶解解在少量量水中,再再将
7、碘片片溶解在在碘化钾钾溶液中中,混匀匀,定容容。 将将灭菌后后放入培培养基冷冷却到550左左右,倒倒成平板板,凝固固后,取取18-24hh的纯培培养物点点于平板板上,每每皿可点点种3-5个菌菌株,适适温培养养2-44d,形形成菌落落后,在在平板上上滴加卢卢戈氏碘碘液,以以铺满菌菌落周围围为度,平平板成蓝蓝色。如如果菌落落周围有有无色透透明圈出出现,说说明淀粉粉已经被被水解,实实验为阳阳性,否否则为阴阴性。透透明圈的的大小一一般说明明水解淀淀粉的能能力。 2.22.3 纤维素素酶实验验 采用用刚果红红染色法法,如果果有刚果果红存在在,刚果果红可以以与纤维维素结合合成红色色螯合物物,培养养基颜色色
8、为红色色。如果果培养基基中有能能够产纤纤维素酶酶的细菌菌,将纤纤维素分分解,不不能形成成螯合物物,在菌菌落周围围形成透透明圈。这这样可以以鉴定产产纤维素素酶的细细菌。 培养基基的配制制:CMMC-NNa 55-100g,酵酵母膏 1g,KKH2PPO4 0.225g,琼琼脂155g,将将上述物物质溶解解后,用用蒸馏水水定容到到10000mll,加入入5mll 100mg/ml的的刚果红红溶液,1121,灭菌菌20mmin,冷冷却倒平平板,凝凝固后待待用。取取18-24hh的培养养物点于于平板上上,每皿皿可点种种3-55个菌株株,适温温培养22-4dd,形成成菌落后后,观察察产生透透明圈情情况,
9、产产生纤维维素酶的的菌落周周围将会会出现明明显的透透明圈,否否则为阴阴性。 2.22.4明明胶液化化实验 明胶是是一种动动物性蛋蛋白,明明胶的水水解是由由于有些些细菌具具有明胶胶酶(亦亦称类蛋蛋白水解解酶),能能将明胶胶先水解解为多肽肽,又进进一步水水解为氨氨基酸,失失去凝胶胶性质而而液化。明明胶培养养基本身身低于220凝凝固,高高于244则自自行液化化。明胶胶分解后后,其分分子变小小,虽在在低于220的的温度下下也不再再凝固。培培养基:蛋白胨胨5g,明明胶1220g,蒸蒸馏水110000ml,调调节pHH7.22-7.4,分分装试管管,培养养基高度度约4-5cmm,1115 20mmin灭灭
10、菌。 挑取118-224h培培养物,以以穿刺法法接种于于试管中中央,于于20-22培养。每每天观察察结果,液液化为阳阳性,否否则为阴阴性。 2.33需厌氧氧实验 在培养养基中加加入还原原剂,如如巯基醋醋酸钠和和甲醛合合次硫酸酸钠等,以以除去培培养基中中的氧气气或氧化化型物质质,使厌厌氧菌能能在有氧氧情况下下生长。培培养基:酪素水水解物220g,NNaC11 5gg,巯基基醋酸钠钠HSCH22COOONa 2g,甲甲醛合次次硫酸钠钠HOCCH2SO22Na 1g,琼琼脂155g,蒸蒸馏水110000ml,调调节pHH 7.2,分分装试管管1211灭菌菌20mmin,培培养基不不摆斜面面。 用用1
11、环肉肉汤菌液液,穿刺刺接种到到上述培培养基中中,必须须穿刺到到管底。330培培养3-7d观观察结果果。如细细菌在琼琼脂柱表表面上生生长者为为好氧菌菌,如沿沿着穿刺刺线生长长者为厌厌氧菌或或兼性厌厌氧菌。 2.4乙酰甲基甲醇实验(V.P实验) 某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸缩合,脱羧成乙酰甲基甲醇,后者在强碱环境下,被氧化为二乙酰,二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物,称V.P阳性反应。培养基:蛋FS:PAGE白胨5g,葡萄糖5g,NaC1 5g,蒸馏水1000ml。调节pH7.0-7.2,分装试管,每管约装4-5ml,115灭菌20min。试剂:40NaOH(或
12、KOH),肌酸。 接种于上述培养液中,适温培养4-6d。如为阴性,可适当延长培养时间。取培养液(约2ml)和等量的40NaOH相混合,加少量(约0.5-1.0mg)肌酸,充分振荡2-5min,如培养液出现红色即为阳性。有时需放置更长时间或在热水中稍加热,以加速反应进行。2.5酪素素水解实实验 牛牛奶平板板的制备备:取55g脱脂脂奶粉加加入500ml蒸蒸馏水中中(或用用50mml脱脂脂牛奶),取取1.55g琼脂脂溶于550mll蒸馏水水中,将将两溶液液分开灭灭菌。待待冷至445-550时时,将两两液混匀匀倒平板板,即成成牛奶平平板。将将平板倒倒置过夜夜,使表表面水分分干燥,然然后将菌菌种点接接在
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