生物工程下游技术期末复习题fyib.docx

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1、生物工程程下游技技术复习习题一、 基本知识识点1、经典典的蛋白白质测定定方法有有 凯凯氏定氮氮法、TTCA比比浊法、福福林-酚酚法和紫紫外法。2、蛋白白质分子子是含有有可带正正电荷的的氨基、亚亚氨基、酰酰氨基等等和可带带负电荷荷的羧基基、苯酚酚基、巯巯基等的的两性生生物大分分子。3、色谱谱柱是进进行色谱谱分离的的主要场场所。4、色谱谱，从基基质材料料的角度度来看，可可以分为为有机基基质和无无机基质质。5、目前前常见的的液相色色谱填料料，按其其物理形形态，一一般分为为多孔型型、非多多孔型和和薄壳型型三中结结构类型型。6、等电电聚焦法法可以测测定蛋白白质的等等电点，同同时又能能鉴定蛋蛋白质的的纯度

2、。7、天然然人白细细胞介素素-2（IIL-22）由1133个个氨基酸酸组成，其其中有一一个游离离半胱氨氨酸（位位于第1125位位），而而第588位和第第1055位的半半胱氨酸酸形成二二硫键，此此二硫键键为活性性所必须须，而二二硫键的的错配对对，可降降低其生生物活性性和形成成抗原性性。8、带有有正电荷荷的蛋白白质分子子在电场场作用下下，向阴阴极移动动。9、径向向色谱应应用于生生化分离离，具有有快速、压压降低两两个明显显的优势势。10、羟羟基磷灰灰石晶体体是骨骼骼和牙齿齿等生物物体硬组组织的主主要无机机成分，它它与生物物体组织织有特异异的亲和和力和相相容性。11、肽肽谱技术术是指蛋蛋白质被被酶解或

3、或化学降降解后肽肽段的分分离分析析和制备备。12、高高速珠磨磨法中，影影响珠磨磨破碎的的操作参参数有转转速、进进料速度度、珠子子直径与与用量、细细胞浓度度、冷却却温度等等。13、超超声破碎碎的效率率与声频频、声能能、处理理时间、细细胞浓度度及菌种种类型等等因素有有关。14、空空化现象象是在强强声波作作用下，让让气泡形形成，胀胀大和破破碎的现现象。15、切切向流过过滤又称称错流过过滤、交交叉流过过滤、十十字流过过滤，（ccrosss-ffloww fiiltrratiion）就就是一种种维持恒恒压下高高过滤速速度的技技术。16、离离子交换换法按照照其操作作方式可可以分为为间隙式式分批操操作及柱柱

4、式洗脱脱两种。17、在在膜分离离过程中中，浓差差极化与与膜污染染是经常常发生存存在的两两种现象象，也是是影响膜膜分离技技术在某某些方面面应用的的拦路虎虎。18、泡泡沫分离离技术是是一种基基于溶液液中溶质质（或颗颗粒）间间表面活活性的差差异进行行分离的的一种方方法，表表面活性性强的物物质优先先吸附于于分散相相（气体体）与连连续相（液液面）的的界面处处，被气气泡带出出连续相相而达到到浓缩。19、膜膜分离技技术具有有设备简简单、操操作方便便、无相相变、无无化学变变化、处处理效率率高和节节省能量量等优点点，已作作为一种种单元操操作日益益受到人人们极大大重视。20、可可依在分分离时一一次进样样量的多多少

5、，将将色谱分分为分析析色谱（110mgg）、中中等规模模制备色色谱亦即即半制备备色谱（110-550mgg）、制制备色谱谱（0.1-11g）和和工业生生产规模模色谱（大大于200g/dd）4大大类。21、离离子交换换色谱，按按所使用用的离子子交换剂剂可分为为，强阴阴离子、强强阳离子子、弱阴阴离子、弱弱阳离子子交换方方式。22、在在色谱单单元纯化化条件的的最优化化中，首首先解决决的问题题是要对对所用的的色谱柱柱的种类类进行选选择，这这取决于于试样和和目标产产物的性性质。一一般来说说，期望望目标产产品尽可可能多的的保留，而而杂蛋白白不保留留，因此此需选择择目标产产品与固固定相作作用力强强、廉价价的

6、色谱谱柱。23、色色谱和电电泳是目目前所知知最好的的两种分分离方法法。其理理论塔板板数可达达百万数数量级。24、基基质材料料（或称称载体）是是色谱填填料的支支撑骨架架，它直直接决定定了填料料的颗粒粒大小与与分布、颗颗粒强度度、孔径径大小与与分布、孔孔结构形形态、颗颗粒内部部的化学学结构与与其稳定定性等，也也直接影影响到对对颗粒表表面（包包括内孔孔表面）化化学修饰饰方法的的实施。25、基基质包括括细胞生生长所需需各种营营养成分分，其消消耗主要要有三个个方面：一是细细胞的生生长，合合成新的的细胞；二是细细胞维持持生命要要消耗能能源物质质；三是是合成次次级代谢谢产物。26、径径向色谱谱：是采采用了径

7、径向流动动技术，样样品和流流动相沿沿径向流流动，而而不是如如传统色色谱柱（既既轴向色色谱）样样品和流流动相是是从柱的的一段流流向另一一端。流流动相和和样品可可以从色色谱柱的的周围流流向柱圆圆心，也也可以是是从色谱谱柱圆心心流向柱柱的周围围的一种种色谱技技术。27、全全交换容容量：指指每克干干介质或或每毫升升湿介质质具有的的功能基基的含量量。28、工工作容量量：也称称有效容容量，是是指每克克干介质质或每毫毫升湿介介质在一一定操作作条件下下交换吸吸附蛋白白质的实实际容量量。29、有有效柱长长：溶质质从开始始迁移至至其迁移移速度等等于流动动相速度度时，溶溶质在色色谱柱上上迁移的的距离成成为有效效迁移

8、距距离，也也成为有有效柱长长。30、最最短柱长长：混合合溶质中中使一对对最难分分离的溶溶质1和和溶质22的分离离度Rss=1时时所需的的最短长长度。31、氨氨基酸分分析可以以分为 柱后反反应法 和 柱柱前衍生生法 两两大类。32、柱柱的填充充目前主主要采用用干法和和湿法两两种33、生生物反应应器变量量的控制制除了设设备值要要由工艺艺及动力力学优化化确定以以外，具具体实施施要靠33个部分分：测量量装置、控控制器和和执行器器。34、在在动物细细胞培养养系统中中有许多多因素限限制了细细胞生长长。限制制细胞密密度的主主要因素素是培养养条件和和最优控控制。两两个关键键是细胞胞代谢物物（乳酸酸、氨等等）毒

9、害害和营养养物质的的耗竭。35、无无论是贴贴壁细胞胞还是悬悬浮细胞胞，就操操作方式式而言，深深层培养养可分为为分批式式、流加加式、半半连续式式、连续续式、和和灌注式式5种方方式。36、目目前，径径向色谱谱柱使用用的填料料主要有有离子交交换树脂脂和亲和和色谱型型两种。37、蛋蛋白质的的生物活活性与其其长链的的结构有有很大关关系，外外界条件件的变化化（如温温度、溶溶液离子子强度、ppH值、有有机溶剂剂等）都都会影响响它的三三维空间间结构，严严重时使使三维结结构破坏坏而发生生“变性”，有事事就复活活不了。38、吸吸附过程程主要分分为两大大类：化化学吸附附和物理理吸附39、蛋蛋白质的的化学分分析技术术

10、主要有有 色谱谱、电泳泳、质谱谱技术等等。40、贴贴壁依赖赖型动物物细胞在在微载体体表面增增殖，可可分为贴贴壁、生生长和扩扩展成单单层3个个阶段。41、 测定蛋白白质的以以及结构构的主要要方法有有：蛋白白质化学学方法（主主要是EEdmaan降解解法测定定N端和和用羧肽肽酶或化化学法从从C端测测起）和和从cDDNA演演绎的方方法。其其它方法法有质谱谱法和二二维核磁磁共振法法。42、电电泳系统统中影响响冷却的的有以下下三个因因素：冷冷却面积积、热传传递系数数、热传传递的推推动力-温差。43、凝凝胶过滤滤的骨架架主要分分为天然然多糖类类及合成成大分子子两大类类。44、通通气系统统的基本本形式有有浸没

11、式式鼓泡器器、表面面通气装装置和膜膜反应器器。45、流流体流动动性质依依其切变变速率与与剪切力力之间的的关系可可分为牛牛顿型流流体和非非牛顿型型流体。46、目目前常用用的鉴定定蛋白质质纯度方方法有 聚丙丙烯酰胺胺凝胶电电泳和SSDS-PAGGE、毛毛细管电电泳、等等电聚焦焦、HPPLC等等。47、 径向色谱谱柱填料料的形态态可以分分为颗粒粒、膜和和连续床床层3种种。48、制制备羟基基磷灰石石的方法法通常有有干法、水水热法和和湿法。49、空空间排阻阻色谱（SSEC）方方法按其其淋洗体体系通常常分为两两大类，既既水相SSEC和和有机相相SECC。50、凝凝胶过滤滤是利用用凝胶的的网状结结构根据据分

12、子大大小进行行分离的的一种方方法。51、双双向凝胶胶电泳的的分辨力力很高，比比如细胞胞中的蛋蛋白质能能用双向向电泳分分辨成220000-30000个个点，而而在色谱谱和毛细细管电泳泳中，一一般只能能分辨上上百个峰峰。52、带带有负电电荷的蛋蛋白质分分子在电电场作用用下向阳阳极移动动。53、任任何两种种不同的的物质，只只要它们们存在有有不同的的物理、化化学或生生物学性性质上的的差异，且且这些差差异还可可表现于于在不同同物相上上分配系系数的差差异，他他们便可可以在色色谱分离离中得到到分离、分分析或测测定。54、 生物反应应器常用用的控制制方法是是反馈调调节55、高高压均浆浆法所用用设备是是高压匀匀

13、浆器，它它基本上上由高压压泵和匀匀浆阀组组成。56、正正向色谱谱：色谱谱技术中中，当固固定相极极性大于于流动相相极性时时，称之之为“正向”色谱。反向色谱谱：色谱谱技术中中，当固固定相极极性小于于流动相相极性时时，称之之为“反向”色谱。57、 离子交换换法：是是通过带带电的溶溶质分子子与离子子交换剂剂中可交交换的离离子进行行交换而而达到分分离纯化化的方法法。58、 线性色谱谱：在色色谱学中中，如果果流动相相中样品品的浓度度与固定定相中样样品的浓浓度之间间呈线性性关系，那那么在这这种情况况下的色色谱分配配过程就就称为线线性色谱谱。59、 非线性色色谱：在在色谱学学中，如如果流动动相中样样品的浓浓度

14、与固固定相中中样品的的浓度之之间不存存在线性性关系，而而是出现现其他的的函数关关系，那那么相应应的色谱谱分离过过程就称称为非线线性色谱谱。60、 吸附等温温线：是是指在一一定温度度下物质质分子在在两相界界面上进进行的吸吸附过程程，达到到平衡时时他们在在两相中中浓度之之间的关关系。61、 文献上常常见的发发酵罐比比拟放大大法仍以以近似法法则与因因次分析析的结合合为主。二、 综合知识识点1、硅胶胶的化学学修饰和和改性硅胶本身身只能充充作正向向色谱填填料，它它必须经经过种种种化学修修饰或改改性，才才能改变变其表面面的化学学性质，成成为适用用于不同同分离模模式的色色谱填料料。1、 表面硅羟羟基的化化学

15、修饰饰硅可以与与诸多元元素形成成稳定的的共价键键，这是是形成品品种繁多多的含硅硅化合物物已经硅硅胶进行行化学修修饰的基基础。硅硅羟基的的化学修修饰通常常采取以以下三种种途径：通过氯氯化反应应：除去去了物理理吸附水水的硅胶胶，可以以将硅羟羟基转化化为活泼泼的表面面硅氯基基。通过氯氯硅烷与与硅羟基基的反应应通过氯硅硅烷可以以将各种种烷基链链引入硅硅胶表面面，特别别是引入入长链正正烷基链链或芳香香基以制制备反向向固定相相。通过烷烷氧基硅硅烷与硅硅羟基的的反应烷氧基硅硅烷与硅硅胶额可可以进行行缩合反反应，使使硅胶表表面带上上环氧基基或氨基基等官能能团，在在此基础础上可以以很方便便的进一一步进行行反应或

16、或修饰。2、 包敷与涂涂层可以通过过不同的的途径以以制备稳稳定的聚聚合物涂涂层，也也可以将将含双键键的聚合合物涂于于硅胶表表面，使使其表面面带上双双键。令令其与随随后涂敷敷上去的的第二单单体进行行共聚，便便可在硅硅胶表面面上形成成致密的的聚合物物膜。3、 整体修饰饰所谓整体体修饰，指指的是利利用不同同官能团团的卤代代硅烷或或烷氧基基硅烷的的水解、缩缩聚反应应，以直直接制出出空间交交联型、含含不同RR基的硅硅胶。4、 硅烷化试试剂硅胶的化化学修饰饰方法中中，表面面硅羟基基的修饰饰仍然是是主要的的途径，所所使用的的组要试试剂是各各种取代代硅烷，既既硅烷化化试剂。氯氯硅烷是是常用的的硅烷化化试剂，但

17、但它有一一些很明明显的缺缺点。相相比之下下烷氧基基硅烷对对环境和和人体的的危害性性要小的的多。2、 蛋白质工工程中，常常用的蛋蛋白质复复性方法法蛋白质工工程中常常会遇到到包含体体问题，包包含体基基本是由由蛋白质质组成，其其中大部部分是克克隆表达达的产物物，这些些产物在在一级结结构上是是正确的的，但在在立体构构型上却却是错误误的，因因此没有有生物学学活性。因因此要涉涉及到蛋蛋白质复复性问题题。蛋白白质的复复性主要要有以下下几种方方法：1、 稀释复性性与透析析复性使蛋白质质最常用用的有两两种方法法。一种种方法是是将溶液液稀释，导导致变性性剂浓度度降低，蛋蛋白质开开始复性性。另一种方方法是用用透析、

18、超超滤或电电渗析除除去变性性剂。2、 色谱复性性色谱复性性的方法法很多，且且原理各各不相同同，依据据其抑制制凝聚的的特点，将将其分为为两大类类。一类类是以凝凝胶过滤滤为代表表的非吸吸附型色色谱复性性。另一一类是吸吸附型色色谱复性性，其中中常用的的吸附色色谱复性性包括金金属螯合合色谱复复性、亲亲和色谱谱复性、离离子交换换色谱复复性、疏疏水相互互作用色色谱复性性等。凝胶过过滤是通通过分子子筛效应应将变性性蛋白质质与变性性剂分离离，从而而使变性性蛋白质质进入复复性溶液液进行复复性。金属螯螯合色谱谱复性主主要是针针对Hiistiine tagg（组氨氨酸标签签）的基基因工程程蛋白质质。将含含有带组组氨

19、酸标标签蛋白白质的裂裂解液流流过含有有镍的亲和和层析柱柱，组氨氨酸就可可以与镍镍螯合从而而结合在在柱子上上，而裂裂解液中中其他蛋蛋白质由由于没有有组氨酸酸标签而而直接流流出柱子子，从而而达到分分离目的的。亲和色色谱复性性是利用用抗原抗抗体相互互作用、酶酶与底物物相互作作用或其其他特异异性相互互作用帮帮助蛋白白质复性性。其它吸吸附色谱谱复性方方法。离离子交换换色谱、疏疏水作用用色谱等等色谱技技术，通通过选择择合适的的条件，溶溶解了的的包含体体可以通通过各种种作用达达到复性性。3、 微囊化动动物细胞胞及其应应用目前微囊囊化细胞胞可以在在两方面面应用，意意识培养养微囊化化动物细细胞以生生产一些些药物

20、；二是作作为药物物直接用用于治疗疗或作为为筛选药药物之用用。一、 生产药物物上的应应用1、 单克隆抗抗体的生生产微囊化哺哺乳动物物的主要要应用是是单克隆隆抗体的的生产。微微囊工艺艺已生产产以克计计的单克克隆抗体体。2、 高值生化化药物的的生产一些生化化药物的的生产，总总生产率率可达培培养瓶生生产的55被以上上。而且且，产物物在电泳泳上显示示纯度明明显高。3、 干扰素的的生产通过对一一些培养养生产干干扰素发发现，细细胞在微微囊中生生长比悬悬浮胖或或单层培培养更旺旺盛。二、 在治疗及及药物筛筛选上的的应用1、 人工器官官微囊化动动物细胞胞在排除除免疫反反应上可可能有普普遍意义义。人们们已将某某些器

21、官官的细胞胞微囊化化并植入入体内以以期待能能代替这这些器官官的功能能。2、 抗癌药物物的筛选选微囊化的的肿瘤细细胞用于于估价抗抗癌药物物对活体体的作用用。人的的肿瘤细细胞经微微囊化后后注入小小鼠腹腔腔中，服服用受检检的抗癌癌药，检检测微囊囊化的肿肿瘤细胞胞对药物物的反应应，结果果发现抗抗癌药能能穿透微微囊的膜膜作用于于微囊中中的肿瘤瘤细胞，抑抑制和杀杀灭的水水平与其其他体外外和体内内测定的的药效一一致。4、同无无机基质质的填料料相比较较，有机机高分子子类型填填料的普普遍特征征同无机基基质的填填料相比比，有机机高分子子类型填填料普遍遍具有如如下特征征：它们的的基质微微球可以以广泛选选择各种种天然

22、的的多糖为为原料来来制备，也也可以广广泛使用用各种的的单体和和交联剂剂来制备备。这些些高分子子材料一一般都容容易进行行化学改改性处理理，所得得到的填填料普遍遍具有良良好的色色谱选择择性。它们对对于被分分离样品品有较强强的负载载能力，有有较高的的色谱容容量。这这对于不不哦他能能够规模模的制备备色谱来来说是尤尤为适宜宜的。他们具具有良好好的耐酸酸、耐碱碱和耐溶溶剂处理理的化学学稳定性性，可以以在广泛泛的pHH值范围围内使用用，并且且有较长长的柱寿寿命和较较好的再再生能力力。它们不不易产生生不可逆逆的非特特异性吸吸附作用用，特别别对于生生物大分分子的分分离有较较好的相相容性，能能有效地地保持样样品的

23、生生物活性性。诸多优点点，决定定了有机机高分子子类型填填料广阔阔应用发发展前景景，尤其其是对于于分离纯纯化生化化物质所所表现出出的良好好性能，已已越来越越受到研研究者和和应用者者的重视视。当然，需需要指出出的是，有有机高分分子类型型填料的的颗粒刚刚性还普普遍不如如无机基基质填料料那样好好，孔结结构也往往往比较较复杂，在在淋洗体体系的变变化过程程中可能能或多或或少的会会产生膨膨胀或收收缩现象象，所有有这些影影响色谱谱性能的的因素，仍仍然有待待于研究究解决。5、常用用的膜分分离技术术的分离离原理以以及常见见的膜材材料和种种类。膜分离技技术是用用半透明明作为选选择障碍碍层，允允许某些些组分透透过而保

24、保留混合合物中其其他组分分，从而而达到分分离目的的的技术术。常用的膜膜分离技技术的分分离原理理主要有有：1、 微滤利用筛分分原理分分离、截截留直径径为0.05-10m大小小的粒子子的膜分分离技术术，既微微滤。膜膜的孔径径为0.05-10m，采采用压力力为0.05-0.55MPaa.2、 超滤超滤的分分离原理理也可基基本理解解为筛分分原理，但但在有些些情况下下受到粒粒子荷电电性及其其与荷电电膜相互互作用的的影响。它它可分离离分子量量从30000到到100000000Daa的可溶溶性大分分子物质质，对应应孔径为为0.0001-0.005mm。采用用压力为为0.11-1MMPa。3、 反渗透在高于溶

25、溶液渗透透压的压压力作用用下，只只有溶液液中的水水透过膜膜，而所所有溶液液中大分分子、小小分子有有机物及及无机盐盐全被截截留住。4、 电渗析它是通过过在点位位差下用用荷电膜膜从水溶溶液中分分离离子子的过程程。5、 渗透蒸发发它的基本本原理是是利用膜膜与被分分离有机机溶液混混合物中中各组分分的亲和和力不同同而有选选择地优优先吸附附溶液某某一组分分及各组组分在膜膜中的扩扩散速度度不同来来达到分分离的目目的。膜的分类类上，分分离膜按按照膜的的荷电性性可分为为中性膜膜，荷电电膜两种种，荷电电膜又分分为荷正正电膜与与荷负电电膜。按按膜材料料亲疏水水性可分分为亲水水膜与疏疏水膜。膜材料上上，目前前国内研研

26、究与生生产设计计的微滤滤和超滤滤膜材料料有二乙乙酸纤维维素、三三乙酸纤纤维素、氰氰乙基纤纤维素。聚聚砜、磺磺化聚砜砜等。反渗透膜膜以芳香香聚酰胺胺和聚呱呱嗪类复复合膜为为主，也也有二乙乙酸纤维维素、三三乙酸纤纤维素等等不对称称反渗透透膜生产产。电渗析用用离子交交换膜有有异相膜膜和均相相膜之分分，材料料有聚烯烯烃、聚聚偏氯乙乙烯等。渗透蒸发发膜主要要是亲水水性聚合合物与硅硅橡胶类类等。6、 HPLCC柱对介介质的要要求和羟羟基磷灰灰石填料料的性能能。HPLCC柱对于于介质的的要求和和羟基磷磷灰石作作为色谱谱填充介介质的性性能主要要表现在在以下几几个方面面：1、 高机械强强度 在HPPLC柱柱中流

27、动动相一般般在高压压下通过过柱，因因而要求求填充介介质具有有高的机机械强度度。现在在使用的的羟基磷磷灰石，尤尤其是球球型颗粒粒可以在在15MMPa压压力下使使用，通通过强化化方法制制备的羟羟基磷灰灰石既所所谓陶瓷瓷羟基磷磷灰石可可在几十十兆帕以以上的压压力下使使用。2、 粒子大小小、形状状和孔隙隙填充介质质的粒子子大小、形形状以及及表面结结构与HHPLCC柱的理理论塔板板数直接接相关，通通常要求求有高的的理论塔塔板数。球球型羟基基磷灰石石颗粒大大小、性性质和孔孔隙可满满足HPPLC柱柱的要求求。3、 化学和热热稳定性性色谱过程程是流动动相与固固定相既既填充介介质之间间频繁强强烈接触触中完成成的

28、，因因此要求求填充介介质在流流动相中中有很好好的化学学稳定性性。羟基磷灰灰石是磷磷酸钙盐盐中最稳稳定的相相，在中中性或碱碱性水相相中非常常稳定。羟羟基磷灰灰石在114000才发生生相变，热热稳定性性好。4、 非可逆吸吸附为有稳定定的柱效效和足够够长的使使用周期期，HPPLC柱柱要求填填充介质质具有低低的非可可逆吸附附。羟基基磷灰石石的非可可逆吸附附非常低低，满足足这一要要求。5、 表面化学学修饰为用于高高效亲和和色谱，要要求在填填充介质质表面配配接相应应的功能能基团。羟羟基磷灰灰石表面面较易进进行各种种化学修修饰。总之，羟羟基磷灰灰石作为为色谱柱柱填充介介质能提提供专一一的选择择性、高高的键和

29、和容量、低低的非可可逆吸附附以及化化学稳定定性和热热稳定性性好，完完全满足足HPLLC柱的的要求。7、细胞胞破碎技技术研究究的发展展方向细胞破碎碎技术的的目的是是释放内内含物，其其方法很很多，按按照是否否存在外外力可分分为机械械法和非非机械法法两大类类。在实实际使用用中，不不管是机机械法还还是非机机械法，各各种方法法都有自自身的局局限性，机机械法因因高效、价价廉、简简单而得得以工业业化应用用，但敏敏感性物物质的失失活问题题，碎片片去除以以及杂蛋蛋白太多多等问题题有待解解决，因因此细胞胞破碎技技术远未未完善。总总体上看看，细胞胞破碎技技术研究究的发展展方向体体现在一一下几个个方面：1、 多种破碎

30、碎方法相相结合化学法与与酶法取取决于细细胞壁的的化学组组成，机机械法取取决于细细胞结构构的机械械强度，而而化学组组成又决决定了结结构的机机械强度度，组成成的变化化必然影影响到强强度的差差异，在在实际使使用中，化化学法或或酶法与与机械法法相结合合可以大大大提高高破碎效效果。2、 与上游过过程相结结合在发酵培培养中，培培养基、生生长期、操操作参数数（如ppH、温温度、通通气量、稀稀释率）等等因素对对细胞破破碎都有有影响，因因此细胞胞破碎与与上游培培养有关关。另外一方方面，用用基因工工程的方方法对菌菌种进行行改造也也是非常常重要的的。这方方面的工工作包括括以下内内容。克隆噬噬菌体溶溶解基因因：在细细

31、胞内引引入噬菌菌体基因因，控制制一定条条件（如如温度等等），细细胞自内内向外溶溶解，释释放出内内含物。 耐高高温产品品的基因因表达 在破碎碎和分离离过程中中，为防防止产品品失活而而消耗的的制冷费费时相当当可观的的。如果果产品能能表达成成耐高温温型，杂杂蛋白仍仍然保持持原特性性，那么么在较高高的温度度下就可可以将产产品与杂杂质分开开，这样样既可以以节省了了冷却费费用，又又简化了了分离步步骤。3、 与下游过过程相结结合细胞破碎碎与固-液分离离紧密相相关，对对于可溶溶性产品品来讲，碎碎片必须须除净，否否则将造造成层析析柱和超超滤膜的的堵塞，缩缩短设备备的寿命命。因此此，在破破碎细胞胞的同时时，要考考

32、虑所造造成的细细胞碎片片对后分分离的影影响。8、微囊囊化方法法适用于于动物细细胞必须须具备的的条件及及聚赖氨氨酸/海海藻酸微微囊化方方法的原原理。自20世世纪600年代固固定化酶酶技术问问世以来来，用微微囊化方方法包埋埋生物大大分子及及细胞的的方法很很多，但但并不是是所有的的方法都都能适合合于动物物细胞，用用于动物物细胞的的微囊话话方法必必须具备备以下一一些条件件：1、 微囊化的的过程要要温和，快快速，不不损伤细细胞，尽尽可能在在液体状状态和生生理条件件下制备备。2、 微囊化所所用的试试剂和膜膜材料必必须对细细胞无毒毒害作用用。3、 微囊化所所形成的的膜必须须能使营营养物和和代谢产产物自由由通

33、过，膜膜的孔径径可以控控制。4、 膜应具有有足够的的机械强强度以抵抵抗培养养过程中中的搅拌拌，不至至使微囊囊破裂。总观目前前的方法法用得最最多的是是聚赖氨氨酸/海海藻酸法法，其原原理如下下：海藻酸是是以1，44键连接接的聚醛醛酸，其其主要成成分是甘甘露糖醛醛酸和古古罗糖醛醛酸。当当它的水水溶液以以钙盐的的形式存存在时，则则成凝胶胶状态。而而用螯合合剂将钙钙离子去去除后，则则海藻酸酸又回复复到溶液液状态。当当海藻酸酸钙凝胶胶用聚赖赖氨酸处处理后，其其接触部部分不再再被螯合合剂去钙钙而溶解解。据此此，先将将动物细细胞与海海藻酸钙钙混合，经经过微囊囊发生器器滴入CCaCll2溶液液中形成成凝胶微微珠

34、，然然后用聚聚赖氨酸酸溶液处处理微球球表面，最最后再用用柠檬酸酸去除微微珠的钙钙离子，这这样，微微珠内的的海藻酸酸层液态态，动物物细胞悬悬浮其中中，而微微珠表面面由于受受到聚赖赖氨酸的的处理而而不再溶溶解，形形成一层层薄膜，动动物细胞胞就被这这层膜包包在微囊囊里了，如如此就可可以制成成细胞微微囊。9、凝胶胶介质应应具备的的条件凝胶过滤滤是生物物化学中中应用最最广泛的的分离纯纯化技术术之一，它它具有设设备简单单、易于于操作、活活性物质质回收率率高、重重现性好好等优点点。凝胶胶过滤介介质的性性能是获获取上述述优点的的基本保保证，凝凝胶介质质应具备备以下条条件。1、 介质本身身为惰性性物质，在在应用

35、过过程中它它不与溶溶质、溶溶剂分子子发生任任何作用用。2、 应尽量减减少介质质内含的的带电离离子基团团，以减减少非特特异性吸吸附，提提高蛋白白质的收收率。但但是由于于绝大部部分的多多糖类骨骨架中都都或多或或少的含含有一些些带电基基团（如如羧基）等等，这些些基团在在低离子子强度时时，对带带电荷的的溶质发发生作用用，将带带正电的的物质滞滞留，产产生非特特异吸附附作用。对对大多数数分子而而言，采采用离子子强度大大于0.02mmol/L的缓缓冲液即即可消除除这种效效应。3、 介质内孔孔径大小小要分布布均匀，既既孔径分分布较窄窄，在分分级分离离中这点点尤为重重要。4、 凝胶珠粒粒大小均均匀，既既粒径的的

36、均一性性好，均均一系数数越接近近1越好好。为提提高柱效效，根据据实验目目的及条条件选用用适合的的粒径。细细粒径分分辨率高高，但流流速慢，压压力降大大，粗粒粒径适用用于高流流速低压压色谱及及间隙操操作。5、 介质要具具有优良良的物理理化学稳稳定性及及较高的的机械强强度，易易于消毒毒，以增增加使用用寿命。凝胶过滤滤介质在在各种分分离介质质中占有有特殊的的地位。由由于它有有上述优优点，能能满足生生化分离离的基本本要求，将将其进行行化学改改性可衍衍生出种种类繁多多的层析析介质，可可以制备备各种离离子交换换剂及缓缓冲离子子交换剂剂；可以以制备疏疏水色谱谱介质及及螯合介介质；可可以作为为亲和层层析吸附附剂

37、的载载体。10、在在物质的的分离纯纯化中，和和其它方方法相比比，色谱法法基本特特点色谱学是是一门以以物理化化学为基基础的分分离与纯纯化科学学，与其其他分离离纯化法法相比，它它具有以以下几个个基本特特点。1、 分离效率率高色谱分离离的效率率之高是是其他分分离技术术所无法法相比的的，尤其其是细颗颗粒多孔孔球型的的高效填填料问世世后，使使色谱柱柱的柱效效有更大大的提高高。每米米可达几几十万的的理论塔塔板数。2、 应用范围围广HPLCC的应用用范围之之广也是是其他分分离技术术无法相相比的，从从极性到到非极性性，离子子型到非非离子型型，小分分子到大大分子，无无机到有有机及生生物活性性物质，以以及其他他热

38、稳定定性或热热不稳定定性的化化合物，可可以说无无所不包包。尤其其是对生生物样品品的分离离分析，是是其他方方法无法法代替的的。3、 操作参数数多色谱的可可变操作作参数之之多也是是其他分分离技术术无法相相比的。流流动相可可用气体体、液体体或超临临界流体体。在气气、液、流流体中又又有许多多不同的的物质可可选用。固固定相可可用液、固固两大类类。在加加上流动动相的ppH值、离离子强度度、有机机溶剂的的含量、分分离温度度等参数数的变化化，使整整个分离离过程随随着上述述各种参参数的变变化适应应于各种种不同的的样品分分离的需需要，应应用于各各种困难难复杂的的场合。4、 高灵敏度度在线检检测与其他分分离手段段相

39、比，色色谱具有有高灵敏敏度在线线检测的的特性。根根据不同同的物理理与化学学的原理理，HPPLC具具有不同同的高灵灵敏度的的检测器器，适用用于多种种千差万万别样品品的需要要。这些些检测器器不但稳稳定性好好，信噪噪比高，同同时都能能进行连连续的在在线检测测，及时时掌握分分离与纯纯化过程程中的情情况，保保证在要要求的纯纯度下得得到最高高的产率率。5、 快速分离离HPLCC由于采采用了高高压溶剂剂传输系系统，即即使采用用高效细细颗粒填填料，也也能保证证分离过过程在一一定的线线速下进进行，而而且由于于单位柱柱长的柱柱效提高高，柱长长可以大大大缩短短，更加加快了分分离的速速度，从从而可以以提高单单位时间间

40、的产量量。6、 连续自动动化操作作电脑用于于色谱分分离过程程以后，从从最初的的简单数数据处理理发展到到目前作作为控制制操作的的中心，使使大量的的样品可可以按照照事先设设置好的的程序进进行完全全自动连连续的操操作。色谱法正正是由于于上述这这些特点点，在生生物技术术蓬勃发发展、迫迫切需要要有效的的分离纯纯化方法法的今天天，人们们还是认认为色谱谱是最理理想的也也是最有有发展前前景的一一种分离离与纯化化生物大大分子的的方法。11、动动物细胞胞培养的的生物反反应器及及培养方方式。各种细胞胞及其代代谢产物物的生产产过程都都要通过过细胞的的培养，而而细胞培培养所用用的装置置就是反反应器。在在实验室室培养用用

41、的方瓶瓶、锥形形瓶是反反应器，扩扩大所用用的各种种发酵装装置也是是反应器器，就连连菌种保保存用的的琼脂斜斜面在培培养阶段段也是反反应器。动物细胞胞培养所所用的生生物反应应器，由由于细胞胞比较娇娇嫩，对对培养条条件要求求更高一一些，因因而在选选用及设设计是要要特别考考虑以下几点点：1、避免免或减低低由于机机械搅拌拌而产生生的剪切切力对细细胞的损损伤。2、气泡泡的表面面张力可可对细胞胞造成伤伤害，在在通气时时要防止止气泡与与细胞接接触。3、在进进行pHH调节或或补料时时要严格格防止化化学环境境的急剧剧变化对对细胞的的伤害。根据这样样一些考考虑已有有悬浮培培养或中中空纤维维细胞培培养等不不同类型型的

42、反应应器。动物细胞胞体外培培养的有有两种类类型。一一种是非非贴壁依依赖型细细胞，来来源于血血液、淋淋巴组织织的细胞胞。另一一种是贴贴壁依赖赖型细胞胞，大多多数动物物细胞，包包括非淋淋巴组织织的细胞胞和许多多异倍体体细胞属属于这一一类型，他他们需要要附着于于带适量量正电荷荷的固体体或半固固体表面面上生长长。动物细胞胞的培养养方式大大体可以以分为三三种1、 贴壁培养养：成纤纤维细胞胞和上皮皮细胞等等贴壁依依赖性细细胞在培培养中要要贴附于于壁上，原原来是圆圆形的细细胞一经经贴壁就就迅速铺铺展，然然后开始始有丝分分裂，并并很快进进入对数数生长期期。一般般在数天天后铺满满生长表表面，形形成致密密的细胞胞

43、单层。大大多数动动物细胞胞属于贴贴壁依赖赖性细胞胞，如hhelaa, VVeroo等。2、 悬浮培养养：所谓谓悬浮培培养，是是指细胞胞在培养养器中自自由悬浮浮生长的的过程。主主要用于于非贴壁壁依赖性性细胞培培养，如如杂交瘤瘤细胞等等。3、 固化培养养：悬浮浮培养适适用于非非贴壁依依赖性细细胞，贴贴壁培养养适用于于贴壁依依赖性细细胞。除除此之外外，还可可以采取取固定化化培养。包包括包埋埋、微囊囊化等培培养方式式。12、微微载体培培养的优点以及及优良微微载体须须具备的的特征所谓微载载体培养养是指直直径在660-2250m、能能够适用用于贴壁壁细胞生生长的微微球。采用微载载体培养养动物细细胞有以以下

44、优点点：1、表面面积/体体积（SS/V）大大，如11.0gg Cyytoddex 1微载载体能提提供50000-60000cmm2表面积。2、由于于采用均均匀悬浮浮培养，把把悬浮培培养和贴贴壁培养养融合在在一起，具具有两种种培养优优点，简简化了细细胞生长长各种环环境因素素的检测测和控制制，培养养系统重重新性好好。3、 用简便便的显微微镜即能能够监测测出细胞胞在微珠珠上的生生长情况况。4、 培养基利利用率高高。5、 收获细胞胞过程不不复杂。6、 放大容易易，国外外已经发发展到110000L规模模培养生生产-干扰扰素用的的人体二二倍体细细胞。7、 劳动强度度小。8、 培养系统统占有空空间小。根据微

45、载载体悬浮浮培养的的特点，概概括来说说，一种种优良的的微载体体须具备备以下特特性。1、 微载体须须不含有有毒细胞胞的成分分。2、 微载体须须与细胞胞有良好好的相容容性，使使细胞容容易贴壁壁。3、 微载体密密度应略略大于培培养基，一一般要求求在1.03-1.005之间间，最大大不宜超超过1.1。4、 微载体粒粒径在440-1120m（干干态），经经生理颜颜色溶胀胀后增大大到600-2550m，粒粒度分布布均匀，径径差不大大于200-255m，表表面光滑滑以利于于细胞铺铺展。5、 微载体须须具有良良好的光光学透明明性，便便于显微微镜观察察细胞生生长情况况。6、 能在PBBS中耐耐1200-1225、200-300minn热压灭灭菌。7、 基质应是是非刚性性材料，避避免在培培养过程程中相互互碰撞而而损伤细细胞。8、 不吸附培培养基中中的一样样成分，特特别是血血清。9、 收获细胞胞或细胞胞制品容容易，不不影响蛋蛋白制品品分离纯纯化。10、价价廉，能能重复使使用。