HIV病毒学检测及质量保证指南5096.docx

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1、本指南由中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心艾滋病参比实验室组织有关专家撰写，由中国疾病预防控制中心批准执行。编写主持人：蒋岩编写人员： 潘品良 蒋蒋岩 李敬云云 钟平 尚尚红 李太生生审核咨询专家及及技术人员：邵一鸣 康来来仪 朱效科 王佑春 汪宁 朱红 郭志宏 季阳阳 刘海林 肖瑶瑶 邱茂锋 马春涛编写单位：中国国疾病预防控控制中心性病病艾滋病预防防控制中心 参编单单位：中国人人民解放军军军事医学科学学院上海市疾病预防防控制中心中国医科大学北京协和医院技术顾问：Miike Usssery, Hao Zhhang美国国立卫生研研究院 过敏敏及传染病研研究所James WW. Breem

2、er美国Rush 大学医学中中心VQA实实验室Trever Peterr克林顿基金中国国艾滋病防治治项目实验室室专家Donald J. Brrambillla美国华盛顿大学学新英格兰研研究所Franciss F. MMandy加拿大公共卫生生局疾病预防防控制中心国国家免疫学实实验室前 言随着HIV-11病毒载量检检测在艾滋病病临床辅助诊诊断和抗病毒毒治疗监测以以及艾滋病科科研工作中的的广泛应用，我我国开展该项项检测工作的的实验室日益益增多。自11997年艾艾滋病实验室室首次引进HHIV-1病病毒载量检测测技术，截至至2007年年底，全国已经经配备了近1120台HIIV-1病毒毒载量检测仪仪，覆

3、盖了疾疾控、医院、检检疫、军队等等系统。目前前，虽然许多多实验室已经经将病毒载量量检测纳入艾艾滋病相关辅辅助诊断和治治疗监测工作作，但大多数数实验室开展展工作的时间间较短，经验验不足，因此此，急需加强强该领域的培培训和质量控控制工作，以以保证检测结结果的准确性性和可靠性。为了加强质控和和保证检测质质量，并得到到国际上的认认可，艾滋病病参比实验室室2004年年开始参加美美国NIH组组织的HIVV-1病毒载载量检测能力力验证工作。在在通过考核和和积累经验的的基础上，22005年启启动了国内HHIV-1病病毒载量检测测能力验证工工作。在积极极组织实验室室能力验证的的同时，艾滋滋病参比实验验室也对实验

4、验室技术人员员进行培训，积积极开展室内内质控。这些些工作对提高高HIV-11病毒载量的的检测技术，保保证质量起到到了重要作用用。为了进一一步规范艾滋滋病实验室HHIV-1病病毒载量检测测，建立标准准化质量控制制程序，准确确开展各项检检测及质量控控制工作，特特制定本指南南。本指南是根据各各种HIV-1病毒载量量检测方法的的技术要求，结结合现行的国国内外相关技技术规范而制制定。本指南南针对HIVV-1病毒载载量检测的实实验室设置、样样品管理、检检测技术、质质量控制、生生物安全等方方面提出指导导。本指南自20006年初正式式开始编写，性性病艾滋病预预防控制中心心多次组织了有有国内外专家家参加的指南南

5、编写专项技技术咨询会，与与会专家对指指南提出了很很多建设性意意见和建议，美美国NIH病病毒载量检测测质量保证实实验室专家多多次对指南进进行认真的审审阅和具体指指导。指南编编写过程中，也也认真听取了了实验室一线线检测人员的的具体需求和和建议，并补补充了大量的的实验数据，包包括HIV-1病毒载量量检测值的稳稳定性、冻融融影响实验与与不同检测方方法之间比较较的实验数据等等。在此基础础上，经过多多次修订、补补充和审定，于于2007年年11月完成成HIV-1病病毒载量检测测及质量保证证指南的最最后定稿。由于国内外还没没有可作为参参考的HIVV-1病毒载载量检测及质质量控制的相相关指南，因因此本指南主主要

6、提出一些些原则上的参参考建议，其其中定有不妥妥之处，希望望广大同仁提提出意见，以以便不断完善善。致 谢在本指南的编写写过程中，世世界卫生组织织、克林顿基基金中国艾滋滋病防治项目目和美国NIHH等国际组织织与机构给予了了大力支持，全全国HIV-1病毒载量量检测实验室室一线操作人人员提出了许许多建设性的的意见和具体体需求，艾滋滋病参比实验验室工作人员员毛玮、陶晓晓霞进行了大大量的补充实实验和文字编编辑工作，才才保证本指南南的编写顺利利完成，在此此一并向他们们表示真诚的的感谢。中国疾病预防控控制中心性病病艾滋病预防防控制中心主主任吴尊友研究员员在本指南编编写过程中提提出了重要的的修改意见，在在此特别

7、致谢谢。HIV-1病毒毒载量检测及及质量保证指指南（20007版）目录第一章 总则第二章 实验室设置第三章 样品的采集、处处理、保存、运输第四章 常用HIV-11病毒载量检检测方法简介介第五章 室内质量控制第六章 外部质量控制第七章 实验室生物安全全附表1 常见见问题分析和和处理附表2 HIIV-1病毒毒载量检测样样品送检及接收单附表3 HIIV-1病毒载量量检测能力验验证样品接收收专用单附表4 HIIV-1病毒毒载量检测报报告单附表5 HIIV-1病毒毒载量能力验验证结果专用用报告单（NAASBA)附表6 HIIV-1病毒毒载量能力验验证结果专用用报告单（RTT-PCR)参考文献缩略语第一章

8、 总总 则1.1意义 HIVV-1病毒载载量是艾滋病病防治工作中中一项重要的的实验室检测指标。检测HIVV-1病毒载载量可以监控和预预测病程，指指导艾滋病患患者的抗病毒治疗疗，包括确定治疗疗时机、选择择治疗方案、评价治疗效效果；结合疾疾病临床症状状和其它实验指标，可作为早期感染诊断的辅助手段；还还可用于婴儿儿早期感染的的辅助诊断以及及采供血机构样品的窗窗口期检测。为了准准确地检测HHIV-1病病毒载量，必必须对开展HHIV-1病病毒载量检测测的实验室进行规规范化管理和和质量控制，才能保证检测结果的准确性和可靠性。1.2目的 指导HHIV-1病病毒载量检测测工作，规范范实验室质量量控制与管理。1

9、.3适用范围围 适用于于我国开展HHIV-1病病毒载量检测测工作的所有有实验室。第二章 实验室室设置各种HIV-11病毒载量检检测方法需要要相应的辅助助设备才能完完成检测。以以下为HIVV-1病毒载载量检测实验验室不同分区区内必备的辅辅助设备及耗耗材。2.1样品处理理区：2.1.1生物物安全柜：二二级2.1.2离心心机（320000g，可离心11.5mL 管子子）2.1.3冰箱箱：4，-20，-802.1.4水浴浴箱：准确度度小于0.552.1.5加样样器1套（20L、200L、10000L），为专用用设备2.1.6有滤滤芯的一次性性吸头（无DDNA和RNA酶）2.1.7计时时器2.1.8旋涡

10、涡振荡器：震震动频率可调调2.1.9 一一次性工作服服、帽、口罩罩、无粉手套套、鞋套2.2试剂准备备区：2.2.1超净净工作台（或或密闭工作台台）2.2.2加样样器1套（20L、200L、10000L），为专用设备备2.2.3离心心机（180000g，可离心11.5mL 管子）2.2.4冰箱箱：4，-202.2.5 计计时器2.2.6旋涡涡振荡器，震动频率可可调2.2.7有滤滤芯的一次性性吸头（无DDNA、RNA酶）2.2.8 11.5mL 管子（无DNNA和RNA酶）和和1.5mLL 试管架2.2.9一次次性工作服、帽帽、口罩、无无粉手套、鞋鞋套2.3扩增产物物分析区：2.3.1 HHIV-

11、1病病毒载量检测测仪2.3.2加样样器1套（220L、200L、10000L）2.3.3冰箱箱：4，-202.3.4水浴浴箱 ( 41 )2.3.5旋涡涡振荡器：震震动频率可调调2.3.6有滤滤芯的一次性性吸头（无DDNA、RNA酶）2.3.7一次次性工作服、帽帽、口罩、无无粉手套、鞋鞋套2.4 HIVV-1病毒载载量检测实验验室设备分布示意图HIV-1病毒毒载量检测实实验室设备分分布示意图病毒载量仪,加样器离心机冰箱-20，4水浴箱洗手池紫外灯扩增产物分析区区生物安全柜加样器离心机冰箱-80，-20冰箱水浴箱洗手池紫外灯样品处理区超净工作台加样器漩涡振荡器冰箱-20，4实验台紫外灯试剂准备区

12、2.4.1总体体原则：各区区独立、控制制风向、因地地制宜、方便便工作。具体体来说： 2.4.1.11各区必须是是相互独立的的，有条件各各区内可分别别设置缓冲间间，以保证不不同区之间始终完全全分隔开。2.4.1.22各区的仪器器设备以及各各种物品必须须是专用的。2.4.1.33 试剂准备备区和样品处处理区可保持持低度正压（或或常压）状态态，使空气流流向始终由室室内向外，以以避免扩增污污染物进入此此区域。2.4.1.44 扩增产物物分析区可保保持低度负压压状态，使空空气流向始终终由室外向内，以以防止扩增产产物造成其他他区域的交叉叉污染。可安安装排风扇或或其他排风装装置。2.4.1.55扩增产物分分

13、析区可以设设在远离其他他各区的地方方。2.4.1.66工作时必须须遵循单一工工作流向进行行，即工作流流向只能从试试剂准备区开开始，到样品品处理区，然然后再到扩增增产物分析区区。第三章 样品的的采集、处理理、保存和运输 样品采集集、处理、保保存和运输，按照所所使用检测方方法的要求严格执行行。用于HIIV-1病毒毒载量检测的的样品推荐采用抗凝凝血浆。3.1 样品的的采集3.1.1 采样器材：一次次性抗凝真空采血管、持针针器、蝶形针针等。3.1.2 抗凝剂： 通常常采用EDTTA（乙二胺胺四乙酸）或或ACD（枸橼酸钠） ，并符合不同检测方法法对样品的要要求。3.1.3 样品标识：在采采血管上贴对对应

14、的样品编号，并填写HIV-1病毒载量量检测样品送送检及接收单（附表2）。3.1.4 样品采集量：通通常采集全血血35mll, 采集的样品量应尽可能与定量采血管的的刻度一致，采集量过多或不不足，会造成成血液凝固或被稀释。3.1.5 样品的混匀：采采集血液后，立即轻轻轻上下颠倒抗凝凝管约10次，使血血液与抗凝剂剂充分混匀。3.1.6 获取其它信息：包括采集对对象的基本信信息和流行病病学资料，抗抗病毒药物使用情况，以往的的实验室检测测结果，在HIV-11病毒载量检检测样品送检检及接收单（附表2）上备注栏注明。3.2 样品的的处理3.2.1 一一般要求在采采血后6小时时内进行离心，室室温下8000-1

15、2000xg离心110分钟。3.2.2 分分离后，吸出出血浆，分装装到无菌的聚丙丙烯螺口冻存存管中，并注明分装时间。在冻存管上上贴样品编号号。3.2.3 血血浆样品不能灭活。3.2.4 做做好样品处理理记录。3.3 样品的的保存3.3.1保存存条件：根据血浆检检测时间而定定，4天内可可在4暂时保存，3个月以内应冻存于-220以下，3个月以上应应置于-700以下。不推荐使用自动动除霜冰箱。3.3.2血浆浆样品冻融不应超过过3次。3.3.3监控控并记录保存存温度以及样品品状态的变化化。3.3.4防止止样品变质、泄泄漏及污染。3.4 样品的的运输根据可感染人人类的高致病病性病原微生生物菌（毒）种种或

16、样本运输输管理规定的要求运输，并严格控制运输的冷冻状态，防止样品冻融。3.5 样品的的发送和接收收3.5.1发送送样品时必须须填写样品HIV-1病毒载量量检测样品送送检及接收单单（附表2）。3.5.2接收收样品时，核对样品数数量，检查样品状状况，按HIV-11病毒载量检检测样品送检检及接收单（附表2）核对。3.5.3 样样品管破损造成样品溢出、出现明显溶溶血、凝血的样品，不宜作HIIV-1病毒毒载量检测；如果样品已已经融化， 4保存并尽快快检测，记录录冻融一次。第四章 常用HHIV-1病病毒载量检测测方法简介目前常用的HIIV RNAA测定方法为为核酸序列依依赖性扩增(NASBAA) 技术，代

17、表产品为NucliiSens ECL 及其升级产品荧光光实时PCRR技术NuccliSenns EassyQ仪；逆逆转录PCRR系统（RTT-PCR）技术，代表产品为AMPLICOR HIV-1 MONITOR assay；分枝DNA信号放大系统（bDNA）技术，代表产品为bDNA 340分析仪；实时荧光定量PCR扩增技术（real-time PCR），M2000与国产试剂盒均属此类技术。41 核酸酸序列依赖性性扩增(NAASBA)技技术最早产品为NuucliSeens EECL定量RRNA测定方方法，最近被被NucliiSens EasyQQ新一代荧光光实时定量PPCR所取代代。NASBBA

18、技术是一一种等温扩增增系统，其扩扩增基础在于于系统内的混混合酶系统，此此系统内含有有逆转录酶AAMV-RTT和T7-DDNA多聚酶酶在体外模拟拟逆转录病毒毒体内复制过过程。此方法可分成四四个步骤：核核酸释放、提提取、扩增和和测定。扩增增后的产物使使用NASBBA QR电电化学发光（EECL）系统统进行检测和和定量，此系系统包括亲和和素标记的磁磁珠、生物素素标记的核苷苷酸片段（此此片段可与新新合成的RNNA产物的一一端互补结合合）及可特异异与四种产物物结合的探针针（探针上标标记有铷元素素），这四种种探针可分别别与不同的RRNA产物结结合。将四种种探针分别置置于不同的反反应管内，在在适当的条件件下

19、（410C）几种成分分将结合在一一起，形成复复合体。这些些复合体可在在ECL读数数仪中被分别别读取铷元素素的激发信号号，根据野生生型病毒核酸酸测定值与其其他三个内标标物测定值的的比较可得到到野生型病毒毒的拷贝数。Nucliseens EaasyQ 结结合NASBBA（核酸序序列基础分析析）技术与分分子荧光探针针技术（Moolecullar Beeacon）检检测血浆中的的HIV RRNA水平。这这种结合的方方法使用了实实时扩增分析析（reall-timee ampllificaation assayy），提高了了对诊断质量量的要求。42 逆转录录PCR系统统技术目前用得最广泛泛的仪器为CCOB

20、AS AMPLIICOR和相相应的检测试试剂COBAAS AMPPLICORR HIV-1 MONNITORTTM 1.55版。聚合酶链反应人人类免疫缺陷陷病毒HIVV-1定量检检测试剂盒11.5版是在在聚合酶链反反应全自动诊诊断仪上定量量测定人血浆浆中人类免疫疫缺陷病毒II型（HIVV-1）RNNA水平的体体外核酸扩增增检测试剂盒盒。该检测试试剂盒可以通通过两种样品品处理程序进进行检测，即即标准的和超超敏感的操作作步骤，定量量测定含量为为50-7550,0000拷贝/毫升升 HIV-1 RNAA。标准的样样品处理程序序中，HIVV-1 RNAA通过应用裂裂解液裂解病毒颗颗粒从而直接接从血浆中

21、分分离出来，然然后用乙醇沉沉淀RNA。采采用超敏感的制备备方法，血浆浆中HIV-1病毒颗粒粒首先通过高高速离心浓缩缩，然后用裂裂解试剂裂解解病毒颗粒。再再用乙醇沉淀淀RNA。COBAS AAMPLICCOR HIIV-1 MMONITOORTM试剂剂盒1.5版版包括5个主主要步骤：试试剂准备；样样品制备；靶靶RNA的逆逆转录产生ccDNA；用用HIV-11特异互补引引物进行靶ccDNA PPCR扩增；通过比色与与探针结合的的扩增产物的的测定。HIIV-1病毒毒RNA的定定量检测是采采用HIV-1定量标准准品来完成的的。HIV-1定量标准准品是包括作作为HIV-1 靶RNNA引物结合合部位和HI

22、IV-1扩增增子单一探针针结合区的非非感染性RNNA 转录物物。将已知拷拷贝数的HIIV-1定量量标准品加到到每一个样品品中和HIVV-1靶序列列一起共同进进行样品制备、逆逆转录、PCCR扩增、杂杂交和检测并并和HIV-1靶序列一一起扩增。CCOBAS AMPLIICOR 分分析仪根据HHIV-1定定量标准品的的数据计算每每一个样品的HIVV-1 RNNA的含量。该该定量标准品品补偿了抑制制因素的影响响并且扩增过过程的质控使使每一个样品品的HIV1 RNAA得以准确定定量。43 分枝DDNA（bDDNA）技术术分枝DNA测定定技术基于其其独特的信号号放大系统，即即分枝DNAA信号放大系系统，这

23、是一一个人工合成成的分枝DNNA，分枝DDNA的分枝枝可结合多个个酶标记物，从从而将病毒的的信号放大，以以便进行检测测。此检测系系统不涉及核核酸扩增反应应。本方法定定量系统中没没有内标记物物，每次实验验设置一系列列外部标记，通通过实验样品品反应强度与与外部标记样样品强度的比比较确定实验验样品的病毒毒拷贝数。每一种bDNAA检测都有各各自的步骤或或试剂。bDDNA检测通通常包括以下下步骤：（11）将患者血血清或血浆连连同含有特异异的合成寡聚聚核苷酸靶探探针的裂解液液加到微孔中中；（2）孵孵育。此步骤骤可释放病毒毒核酸，降解解RNA酶或或使DNA变变性, 然后后靶探针结合合到靶RNAA或DNA并并

24、固定在固相相板上；（33）冷却洗板板；（4）加加信号放大探探针(bDNNA)到各孔孔内；（5）孵孵育. 此步步骤使bDNNA杂交到靶靶探针的相应应部位；（66）冷却洗板板；（7）加加标记探针到到各孔内；（88）孵育，此此步骤使酶标标记的探针杂杂交到bDNNA上；（99）冷却洗板板；（10）加加化学发光底底物到各孔中中；（11）孵孵育，此步骤骤让酶和底物物相互作用，产产生化学发光光信号。发射射的光强以相相对光量值(RLUs)表示。产生生的光强直接接与各样品中中病毒RNAA或DNA的的载量成正比比。各样品中中病毒核酸的的含量由与样样品一同处理理的标准所制制作的标准曲曲线计算获得得。44 实时（re

25、al-time）荧光定量PPCR扩增实时荧光定量PPCR技术，是是指在PCRR反应体系中中加入荧光基基团，利用荧荧光信号积累累实时监测整整个PCR进程，最最后通过标准准曲线对未知知模板进行定定量分析的方方法。每个反反应管内的荧荧光信号到达达设定的域值值时所经历的的循环数Ctt值与该模板的的起始拷贝数数的对数存在在线性关系。利利用已知起始始拷贝数的标标准品可作出出标准曲线，其其中横坐标代代表起始拷贝贝数的对数，纵纵坐标代表CCt值）。因因此，只要获获得未知样品品的Ct值，即即可从标准曲曲线上计算出出该样品的起起始拷贝数。实时荧光定量PPCR扩增的的实验检测过过程可分为：（1）样品制备,抽提和浓缩

26、缩目标RNAA分子，并除除去可能存在在的抑制因子子。（2）Reaal-timme PCRR，检测PCRR的产物使用用荧光标记的的寡核苷酸探探针。检测的的原理基于荧荧光信号增长长曲线与循环环数相关。（33）RT-PPCR反应，病毒RNAA利用逆转录录酶将RNAA逆转录为ccDNA，然然后通过DNNA聚合酶对对特定片段进进行扩增。（44）扩增产物物的检测，基于检测阈阈值的设定，当当病毒载量高时时，低循环数数即能检测到到荧光信号，当病毒载量低时时，高循环数数时才能检测测到荧光。循循环数与样品品载量成线性性关系。利用用标准品制作作循环数与载载量的标准曲曲线就能对样样品载量进行行定量检测。第五章 室内质

27、质量控制内部质量控制是是在良好实验验室整体环境境支持下，从样品接收收到发出报告告整个过程每每个环节的管管理过程，包括：（1）人员员；（2）实实验室分区和环境；（3）仪器器；（4）检检测过程（试试剂、操作过过程，质控品品使用）；（55）数据。5.1人员HIV-1病毒毒载量检测人人员分为检验验人、复核人、签发人。5.1.1 所所有相关检验人员需经经操作培训，能能独立熟练地地操作，并经经考核合格，持持证上岗。5.1.2复核核人、签发人应具备对检测过过程进行分析析、解决问题题的能力。5.2实验室分分区和环境5.2.1实验验室分区的功功能HIV-1病毒毒载量检测实实验室原则上上应分为三个独立工作作区：试

28、剂准准备区、样品品处理区、扩扩增产物分析区，并并设在不同房房间。不同检检测方法的分分区功能和要求可有所不同。5.2.1.11 试剂准备备区：扩增试试剂的配制、分分装和保存；5.2.1.22 样品处理理区：样品登登记、分装，核酸提取、保保存和加样；5.2.1.33 扩增产物分析区：产物扩增的的测定、结果果分析、登记记及报告。严格要求三区的的空气流向：从试剂准备备区到样品处处理区，然后后到扩增产物物分析区，不能能逆向流动。实实验室的设置置及辅助设备备的具体要求求参见第二章。5.2.2 实实验室环境的的要求5.2.2.11实验室有足足够的空间；5.2.2.22采光好，应应避免阳光直直射设备；5.2.

29、2.33室温控制在在18255；5.2.2.44室内相对湿湿度控制在55070%；5.2.2.55电源稳定，HIV-1病毒载量检测仪应配备稳压电源；5.2.2.66室内保持干干净整洁，无无灰尘。5.2.2.77实验前后，用用75%乙醇醇或0.1%次次氯酸钠及时处理操作作台面。5.3 仪器设设备质控5.3.1加样样器、温湿度计须经计量量部门校准，每每年一次。每每季度期间核核查一次。5.3.2 HHIV-1病病毒载量检测测仪、离心机机可以委托公司校准准，每年一次次。5.3.3冰箱箱、水浴箱用用校准合格的的温度计测量量温度，并做做好记录。5.4检测过程程质控 5.44.1试剂质质控5.4.1.11

30、所有试剂剂盒须严格按按要求条件保保存。5.4.1.22试剂盒拆封封时，要记录录拆封时间，所有试剂严严格控制在有有效期内使用用。5.4.1.33使用经中国国食品药品监监督管理局注注册的试剂。5.4.2 实实验用水：要求使用无DNA和RNA酶的水。5.4.3 操操作过程质控控严格执行仪器和和试剂的标准操作程程序（SOPP），不得擅擅自修改。5.4.4质控控品的使用每次实验需同时时使用试剂盒内内的质控品以以及一个HIIV-1 RRNA为50000-155000拷贝贝/毫升的外外部质控品。5.4.4.11外部质控品的的制备按实际使用量的的要求配制大样品量量的血浆（推荐每次配置置量可使用两两年），用0.

31、2m滤膜过滤除除菌，充分混混匀。用无菌冻存管管定量分装，标记，封口，冻存于-80以下非自动除除霜冰箱内。5.4.4.22外部质控品的的定值随机选出10管管外部质控品，按按照实验室的的检测条件进进行HIV-1病毒载量量检测，将拷拷贝值换算成成Log100值，计算算算术平均值（m）和标准偏差（s）。5.4.4.33质控图的绘绘制和使用根据外部质控品品的定值，绘绘制质控图。在在质控图上显显示所有100次质控品检检测值的Loog10值、平均值以及及1.5s 值范围。每次次检测都应带带1个外部对对照，将得到到的外部对照照Log100值标在质控控图上，根据据是否在1.5s 值范围判判断实验结果果是否有效，

32、每每次测得值在在平均值1.5S内内方为有效。使用新批次的外外部对照质控控品时，必须重重新绘制质控控图。5.4.5 试试剂盒质控品品的使用每次实验按照试试剂盒说明书书的要求使用用试剂盒提供的的质控品，并并满足质控品品的要求。5.5 数据分分析、结果报报告5.5.1 在在试剂盒及外部部质控品结果果满足要求的的前提下，对对样品进行分分析。5.5.2 外外部质控品不不合格，样品品需要重新检检测。5.5.3 结结果超过检测测上限的样品品应稀释以后重重新检测。5.5.4 复复核人对检测结果果进行仔细复复核并对结果果提出结论、签字。5.5.5 签签发人对结果的结结论进行审核核、分析、总总结、签字。5.5.6

33、 按按不同方法的的要求，以拷拷贝/毫升或或国际单位/毫升为单位位报告样品的的HIV-11病毒载量值值。第六章 外外部质量控制HIV-1病毒毒载量检测的的外部质量控制制可以通过参加外部部质量评价，提提高实验结果果的可比性，发发现系统误差差，改进实验验室工作，提提高检测质量量。艾滋病参参比实验室自自2004年年开始参加由由美国国立卫卫生研究院（NIH）组织的HIV-1病毒载量检测考核工作，考核盘有5个样品组成，分别考核实验室检测的灵敏度、特异性、稳定性和准确性，通过将结果与国际上参与考核的所有实验室结果进行比对评估，给出综合评估结果。通过参加考核，保证艾滋病参比实验室的不同HIV-1病毒载量检测系

34、统的有效性。目前，艾滋病检检测实验室通通过参加艾滋滋病参比实验验室组织的HHIV-1病病毒载量检测测能力验证来来实施外部质质量控制。6.1 HIIV-1病毒毒载量检测能能力验证（PPT）的组织艾滋病参比实验验室为HIV-11病毒载量检检测能力验证证（PT）的的组织者，负负责制定国内内HIV-11病毒载量检检测能力验证证的计划并组组织实施。建议国内所有从从事HIV-1病毒载量量检测的实验验室参加该PPT项目，在规定定时间内使用用有效试剂与与实验样品一一起检测，填填写HIV-1病毒载量量实验结果报告告单（附表4-6），上上报艾滋病参参比实验室。鼓励有条件的实实验室参加国国际组织的PT活动。 6.2

35、 HIIV-1病毒毒载量检测能能力验证（PPT）的实施施6.2.1 PPT样品组成：每次5份。包括阴性、不同拷贝数的阳性样品。6.2.2 PPT频率：一年年2次，分别为3月和9月。6.2.3 PPT样品的接收收与保存：要要求参加PTT的实验室收收到考核样品品后，立即进进行核对、检查，填填写HIV-1病毒载量量检测能力验验证样品接收收专用单（附附表3），3天内将接收专用单传回艾滋病参参比实验室。如发现考核核样品缺失、量量不足、空管等情情况，及时书面回报，艾滋病参参比实验室负负责补寄或更更换。收到样样品后应及时时检测或在-70度以下下保存。6.2.4 PPT样品的检测测：要求将考考核样品同实实验室

36、常规样样品一起检测，由常规规检测人员进进行，不应作为特特殊样品处理理。6.2.5 PPT结果的报告和处理：参加PT的实验室室必须在规定定的时间内（收收到样品3个月内），用用电子邮件报告告实验结果，并并将HIV-1病毒载量量实验结果报报告单（附表表4-6）和打印的仪器器原始记录一起起上报给艾滋病病参比实验室室，后者将负责结果录入和处处理。评分原则：比nn呢体要求参参加考核装和和保存。及抗抗病毒治疗66.2.6评分分原则：没有有任何问题者为优秀秀；出现6.2.6.1中的一条条为良好；出出现至少6.2.6.1中的的两条或至少6.22.6.2中的一条条为不合格。6.2.6.11次要问题：一个样样品结果

37、在1.522.0S内；一个假阳性；一个无效结果；一个抄写错误。6.2.6.22主要问题：两个样样品结果超过2.0S；两个及以上假阳阳性；两个及以上无效效结果；两个及以上抄写错错误。6.2.7 评评估结果反馈馈：艾滋病参参比实验室根根据各实验室室的两次考核核结果，每年年反馈最后的的评估结果。6.2.8抱怨怨和申诉：参参评实验室如如对评估结果或其它它方面存有异异议，可以在在收到结果后后10天内向向艾滋病参比比实验室提出出异议，后者者在核实情况况后予以答复复。6.2.9 现现场督导：根据考核情情况的需要，艾滋病参比比实验室组成成技术专家组组对不合格实实验室进行现现场检查。检检查内容包括括：实验原始始

38、数据、实验验室布局、仪器运运行状况、辅辅助设备校准准状况、实验验耗材质量、样样品保存、试试剂盒使用状状态、人员培培训状况、质质量保证和质质量控制等。第七章 实验室室生物安全7.1相关依据据病原微生物实实验室生物安安全管理条例例、实验验室生物安全全通用要求、可可感染人类的的高致病性病病原微生物菌菌（毒）种或或样品运输管管理规定、人人间传染的高高致病性病原原微生物实验验室和实验活活动生物安全全审批管理办办法和全全国艾滋病检检测技术规范范。7.2安全细则则7.2.1进入入实验室应穿穿工作服、戴戴口罩、戴一一次性乳胶手手套。严禁在在实验室内进进食、饮水和和吸烟以及使使用化妆品。7.2.2所有有样品包括

39、试试剂盒中的人人源性成份（如如阴、阳性对对照）都应在在生物安全柜柜内进行处理理。7.2.3样品品应盛装在有有螺旋盖的管管子中，以防防样品溅出或或产生交叉污污染。当具有有潜在传染性性的物质溢出出时，立即用用0.1%次氯酸酸钠溶液或其其它消毒剂处处理污染区及及器材；接触触过标本的器器材应置有专专用消毒剂的的容器，与一一次性物品一一起在丢弃前前进行高压灭灭菌处理。7.2.4避免免试剂盒中各各种有毒有害害化学成分（如如叠氮钠、二二甲基亚砜、异异硫氰酸胍）对对人体或环境境可能造成的的危害。7.3生物安全全培训7.3.1所有有涉及HIVV-1病毒载载量检测的人人员都应经过过严格的技术术培训，要掌掌握生物安

40、全全保障的原则则、措施。每每个人的安全全教育均应记记录在实验室室和人事档案案中。7.3.2省级级及以上疾控控中心艾滋病病实验室负责责HIV/AAIDS检测测生物安全培培训及HIVV-1病毒载载量检测培训训。7.3.3检测测相关人员应应主动接受实实验室生物安安全员以及安安全负责人的的监督。所有有实验室意外外事件均应进进行记录和报报告。7.3.4所有有人员要保护护自身和环境境的安全。7.3.5参照照实验室安全全指南和标准准操作程序的的有关规定执执行具体操作作。7.4职业暴露露处理7.4.1实验验室应建立完完善的艾滋病病职业暴露后后的预防机制制。7.4.2发生生职业暴露后后，首先进行行应急处理，然然

41、后根据暴露露级别和暴露露源头严重程程度，评估风风险级别，并并决定是否进进行预防性用用药和用药程程序，如需要要时，尽早开开始服用抗病病毒药物。7.4.3按规规定进行职业业暴露登记、检检测和报告，注注意做好保密密工作。附表1 常见见问题分析（一）NASBBA问题原因 处理方法血清或血浆样品品中有特殊物物质 化冻缓慢引起的的细胞裂解离心至上清清亮亮 硅胶难以重新悬悬浮 样品中核酸水平平太高 剧烈震荡混悬，由由于洗涤/洗洗脱效率不高高可影响敏感感度。样品最最多带有相当当于106个个细胞的DNNA。 硅胶干燥不佳 丙酮剩余太多 用100-10000 ll枪头吸干净净干燥温度太低 干燥时间最多延延长2分钟

42、 检查加热模块的的温度 加入硅胶的样品品离心后难以以溶解 硅胶孵育时间太太长 ( 12 miin) 增加震荡时间和和强度 无效结果；信号号太低 酶未完全溶解保证酶稀释和使使用前平衡至至室温，充分分溶解并在一一小时内使用用 磁珠未充分混匀匀或加入的量量太少每次加入前先震震荡混匀，保保证磁珠快速速沉在管底样品浓度太高 检查检测稀释液液、样品及已已稀释样品加加入的量 扩增时温度偏差差 调整加热温度，应应该在410.5CC. （二）RT-PPCR问题原因 处理方法QS_无效（QS_INVVALID）QS稀释系列的的A660数值未未在检测的吸吸光度范围内内。该样品检测的结结果无效。结结果无效的样样品应从

43、样品品和质控的制制备开始重新新进行逆转录录、扩增和检检测。靶序列吸光度偏偏低(TARGETTOD LOO)所有HIV-11的稀释度的的A660数值低低于检测的线线性范围。报告结果根据所所采取的标准准的或极度敏敏感的提取方方法可以是“HIV-11 RNA 没有检测到到（HIV-1 RNAA低于4000拷贝/毫升升）”或“HIV-11 RNA 没有检测到到（低于500拷贝/毫升升）”。靶序列吸光度偏偏高(TARGETTOD HII)所有HIV-11的稀释度的的A660数值高高于检测的线线性范围。报告结果形式为为“不能确定”。（1）如如果采用标准准样品处理程程序，用HIIV阴性的人人血浆稀释原原始样

44、品并用用标准的样品品处理程序重重新检测。报报告的结果应应乘以稀释因因子。（2）如果采采用极度敏感感的样品处理理程序，稀释释原始血浆样样品，用标准准的样品处理理程序重新检检测。报告的的结果应乘以以稀释因子。结果偏低（RESULTT_LO）计算的拷贝数低低于测定下限限。对于标准的样品品处理程序，结结果可以报告告为“检测到HIIV-1 RRNA, 含含量低于4000拷贝/毫毫升”。如果需要要定量的结果果，原始样品品应该使用极极度敏感的样样品处理程序序重新检测。对对于极度敏感感的样品处理理程序，可以以报告为“检测到HIIV-1 RRNA, 含含量低于500拷贝/毫升升”。结果偏高（RESULTT_HI

45、）计算的拷贝数高高于测定上限限。对于标准的样品品处理程序，结结果可以报告告为“HIV-11 RNA含含量高于7.5105拷贝/毫升升”。如果需要要定量的结果果，原始样品品可以用HIIV-1阴性性的人血浆稀稀释并重新检检测。报告的的结果应乘以以稀释因子。对对于极度敏感感的样品处理理程序，重新新检测。对于于极度敏感的的样品处理程程序，结果可可以报告为“HIV-11 RNA含含量高于1.0105拷贝/毫升升”。如果需要要定量的结果果，稀释原始始样品用标准准的样品处理理程序重新检检测。TARG_GAANGE所有靶模板的AA660数值都都不在线性测测定范围之内内。可以报告为“未未检出。”重新检测原原始样

46、品，重重复样品和质质控制备、逆逆转录、扩增增和检测步骤骤。OD_SEQUUENCE提示有不合乎稀稀释顺序的AA660值出现现。重复整个实验步步骤包括样品品和质控的制制备、扩增和和检测。QS_SEQUUENCE提示QS有不合合乎稀释顺序序的A6600值出现。重复整个实验步步骤包括样品品和质控的制制备、扩增和和检测。（三）Easyy Q问题原因 处理方法分子信标没有检检测绝对信号水平太太低用洗脱液重新检检测Q值设定（）的的大小不同于于WT值设定定（）的大小内参照数据设定定的大小不同同于WT数据据设定的大小小重新设定内参照照数据测定的曲线不连连续所测定曲线不连连续性用洗脱液重新检检测没有扩增内参照和WT最最大/最小信信号的比值都都低于阈值用洗脱液或者样样品再开始测测扩增弱曲线斜率太低用洗脱液重新检检测计算错误曲线拟合程序产产生错误用洗脱液重新检检测不正确的扩增动动力学拟合曲线没有正正确地描述所所观察的数据据用洗脱液重新检检测延迟时间太短起始荧光增加的的速度太快用洗脱液重新检检测。确信加加入酶和开始始此轮运行之之间的时间少少于8分钟。扩增弱内参照值和WTT值都没有达达到一个平台台值用洗脱液重新检检测没有测到内参照照。没加