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1、中药指纹图谱 第一章第一章 中药指纹图谱技术与中药质量控制中药指纹图谱技术与中药质量控制 1.1 指纹图谱的起源与发展指纹图谱的起源与发展 现现代代指指纹纹鉴鉴定定始始于于19世世纪纪末末20世世纪纪初初的的范范罪罪学学和和法法医医学学。每每个个人人的的指纹在微小的细节构造上各有不同，可以据以鉴别每个人的特征。指纹在微小的细节构造上各有不同，可以据以鉴别每个人的特征。指指纹纹图图谱谱技技术术应应用用于于植植物物药药质质量量控控制制，是是从从20世世纪纪70年年代代，色色谱谱技技术术的的发发展展，人人们们大大量量采采用用薄薄层层色色谱谱（TLC）方方法法，将将植植物物中中化化学学成成分分展展载载

2、于于由由各各种种担担体体铺铺成成的的薄薄层层板板上上。根根据据薄薄层层板板上上的的斑斑点点的的位位置置、斑斑点点大大小小、斑斑点点颜颜色色、斑点数目的多少进行定性鉴别，这种薄层鉴别方法具备了指纹图谱的特征。斑点数目的多少进行定性鉴别，这种薄层鉴别方法具备了指纹图谱的特征。20世世纪纪70年年代代及及80年年代代，出出现现薄薄层层扫扫描描仪仪，日日本本和和我我国国部部分分学学者者用用薄薄层扫描仪得到复方成药扫描图作为色谱指纹图尝试应用于药材及成药分析。层扫描仪得到复方成药扫描图作为色谱指纹图尝试应用于药材及成药分析。20世世纪纪80年年代代及及90年年代代，高高效效液液相相技技术术得得到到发发展

3、展，同同时时植植物物药药中中化化学学成成分分的的分分离离鉴鉴定定、活活性性成成分分的的不不断断阐阐明明，高高效效液液相相广广泛泛应应用用于于定定性性、定定量量分分析。析。西西方方普普遍遍采采用用高高效效液液相相色色谱谱法法对对植植物物药药中中已已知知及及未未知知组组分分进进行行控控制制，并并形形成成相相应应的的规规范范。目目前前高高效效液液相相色色谱谱法法已已成成为为当当前前研研究究指指纹纹图图谱谱的的主主要要手手段。段。1.2 中药指纹图谱的定义中药指纹图谱的定义 中药指纹图谱鉴别借用了法医学的指纹鉴定的概念。中药指纹图谱鉴别借用了法医学的指纹鉴定的概念。定定义义：运运用用现现代代分分析析技

4、技术术对对中中药药化化学学信信息息以以图图形形（图图像像）的方式进行表征并加以描述。的方式进行表征并加以描述。由由次次生生代代谢谢产产物物组组成成的的中中药药提提取取物物的的色色谱谱指指纹纹图图谱谱不不仅仅具具备备个个体体的的绝绝对对的的惟惟一一性性，更更强强调调的的是是物物种种特特征征的的惟惟一一性性与与同同种种植植物中的相似性。物中的相似性。现现代代分分析析技技术术：包包括括光光谱谱、波波谱谱、色色谱谱、核核磁磁共共振振、X射射线衍射及各种技术的联用。线衍射及各种技术的联用。中中药药化化学学信信息息：植植物物药药（包包括括来来源源于于植植物物的的中中药药材材）的的提提取取物物（包包括括中中

5、药药的的汤汤药药）与与化化学学合合成成药药最最根根本本的的区区别别是是，它它（即即使使是是单单味味药药材材）是是多多种种化化学学成成分分的的混混合合体体。这这种种多多种种化化学学成成分分的的综综合合体体构构成成了了“中中药药化化学学信信息息”。由由于于中中药药的的疗疗效效由由多多种种成成分分协协同同作作用用或或“相相克克作作用用”，中中药药中中的的化化学学信信息息有有一一定定的的模模糊糊性性。只只有有部部分分化化学学信信息息（包包括括已已知知的的活活性性成成分分、已已知知的的非非活活性性成成分分、一一部部分分未知成分）可表征于指纹图谱中。未知成分）可表征于指纹图谱中。表征和描述表征和描述：“表

6、征表征”是将中药化学信息通过色谱图（液是将中药化学信息通过色谱图（液相色谱图、气相色谱图或薄层色谱图）等方式进行表达；相色谱图、气相色谱图或薄层色谱图）等方式进行表达；“描描述述”是对指纹图谱经过计算、分析、比较、评价等过程，以技是对指纹图谱经过计算、分析、比较、评价等过程，以技术参数、指纹特征等加以说明。术参数、指纹特征等加以说明。中药指纹图谱研究须经过制备、分析、比较、评价和校中药指纹图谱研究须经过制备、分析、比较、评价和校验等过程。验等过程。分析色谱指纹图要求分析色谱指纹图要求“准确的辨认准确的辨认”，不是，不是“精密的测量精密的测量”；比较供试品与对照品的色谱指纹图谱是要求比较供试品与

7、对照品的色谱指纹图谱是要求“相似相似”，而不是，而不是“相同相同”；评价色谱比较的结果，是根据色谱指纹图谱的模糊属性，评价色谱比较的结果，是根据色谱指纹图谱的模糊属性，着眼于宏观的规律性的特征分析，即着重辨认完整色谱的着眼于宏观的规律性的特征分析，即着重辨认完整色谱的“图图貌貌”，而不是求索细枝末节。，而不是求索细枝末节。分析比较的结果，是对供试品与对照品之间的差异或一分析比较的结果，是对供试品与对照品之间的差异或一致性作出评价。致性作出评价。1.3中中药药指指纹纹图图谱谱与与中中药药安安全全、有有效效、稳稳定定和和可控的关系可控的关系 药药物物研研究究的的主主要要内内容容包包括括药药物物安安

8、全全性性、有有效效性性、稳定性和可控性，四者缺一不可。稳定性和可控性，四者缺一不可。已已生生产产并并临临床床使使用用的的注注射射剂剂等等中中成成药药，由由于于经经过过了了药药效效学学测测试试、临临床床评评价价，安安全全性性与与有有效效性性没没有有，但但是是，现现有有的的质质量量控控制制方方法法的的不不全全面面性性及及生生产产过过程程中中的的不不稳稳定定性性导导致致各各批批次次产产品品之之间间质质量量出出现现差差异异，在在临临床应用过程中往往出现非正常的医疗事故。床应用过程中往往出现非正常的医疗事故。一致性一致性安全性安全性指纹图谱指纹图谱可控性可控性有效性有效性 1.4 中药指纹图谱建立的意义

9、与原则中药指纹图谱建立的意义与原则 中中药药指指纹纹图图谱谱建建立立的的是是全全面面反反映映中中药药内内在在化化学学成成分分的的种种类类与与数数量量，进进而而反反映映中中药药的的质质量量。现现阶阶段段中中药药的的有有效效成成分分绝绝大大多多数数没没有有明明确确，采采用用中中药药指指纹纹图图谱谱的的方方式式，将将有有效效地地表表征征中中药药质质量量。指指纹纹图图谱谱已已为为国国际际社会所认可，有利于中药及产品进入国际市场。社会所认可，有利于中药及产品进入国际市场。中中药药指指纹纹图图谱谱的的建建立立，应应以以系系统统的的化化学学成成分分和和药药理理学学研研究究为为依依托托，应应体体现现系系统统性

10、性、特特征征性性、重重现现性性三个基本原则。三个基本原则。系统性系统性：“系系统统性性“是是指指指指纹纹图图谱谱所所反反映映的的化化学学成成分分应应包包括括中中药药有有效效部部位位所所含含大大部部分分成成妥妥的的种种类类，或或指指标标成成分分的的全部。全部。如如：中中药药人人参参中中所所含含的的有有效效成成分分多多为为皂皂苷苷类类化化合合物物，则则其其指指纹纹图图谱谱应应尽尽可可能能多多地地反反映映其其中中的的皂皂苷苷成成分分；银银杏杏叶叶中中的的有有效效成成分分是是黄黄酮酮和和银银杏杏内内酯酯类类，则则其其指指纹纹图图谱谱可可采采用用两两种种方方法法针针对对这这两两类类成成分分，分分别别分分

11、析析，以以达达到系统、全面的目的。到系统、全面的目的。特征性特征性：“特特征征性性“是是指指指指纹纹图图谱谱中中反反映映的的化化学学成成分分信信息息（具具体体表表现现为为保保留留时时间间或或位位移移值值）是是具具有有高高度度选选择择性性的的，这这些些信信息息的的综综合合结结果果，将将能能特特征征地地区区分分中中药药的的真真伪与优劣，成为中药自身的伪与优劣，成为中药自身的”化学条码化学条码“。如如：北北五五味味妇妇的的高高效效液液相相色色谱谱和和薄薄层层色色谱谱指指纹纹图图谱谱，不不仅仅包包括括多多种种已已知知的的五五味味子子木木脂脂素素成成分分，而而且且还还有有很很多多未未知知成成分分，这这些

12、些成成分分之之间间的的顺顺序序、比比值值在在一一定定范范围围内内是是固固定定的的，并并且且随随药药材材品品种种的的不不同同而而不不同同。通通过过这这些些整整体体信信息息，可可以以很很好好地地区区分分北北五五味味子子与与南南五五味味子子以以及及其其它它来来源源的的五五味味子子药药材材，辨辨别别药药材材的的真真伪伪与与优优劣。劣。重现性重现性：“重重现现性性“是是指指所所建建立立的的指指纹纹图图谱谱，在在规规定定的的方方法法与与条条件件下下，不不同同的的操操作作者者和和不不同同的的实实验验室室应应能能作作出出相相同同的的指指纹纹图图谱谱，其其误误差差应应在在允允许许的的范范例例内内，这这样样才才可

13、可以以保保证证指指纹纹图图谱谱的的使使用用具具有有通通用用性性和和实实用用性性，也也是是作作为标准方法所必备的特征之一。为标准方法所必备的特征之一。实实现现指指纹纹图图谱谱的的重重现现性性，除除在在样样品品制制备备方方法法、分分析析过过程程、结结果果处处理理待待环环节节规规范范操操作作外外，还还应应建建立立相相应应的的评评价价机机制制，对对指指纹纹图图谱谱进进行行客客观观评评价价，并并公公布布标标准准指指纹图谱。纹图谱。实实现现中中药药指指纹纹图图谱谱的的三三原原则则，保保证证其其标标准准化化，做做到到统统一一规规范范，这这样样才才可可以以使使中中药药指指纹纹图图谱谱得得以以推推广广应应用。用

14、。1.5 国外植物药指纹图谱的应用国外植物药指纹图谱的应用 美美国国FDA：允允许许草草药药保保健健品品申申报报资资料料可可以以提提供供色色谱指纹图；谱指纹图；WHO：1996年年草草药药评评价价指指导导原原则则中中规规定定，如如果果草草药药的的活活性性成成分分不不明明，可可以以提提供供色色谱谱指指纹纹图图谱谱以以证证明明产产品品质量的一致。质量的一致。欧欧共共体体：在在草草药药质质量量指指南南中中称称，单单靠靠测测定定某某有有效效成成分分考考察察质质量量的的稳稳定定性性是是不不够够的的，因因为为草草药药及及其其制制剂剂是是以以整整体体为为活活性性物物质质。在在欧欧共共体体药药品品申申请请注注

15、册册表表格格中中植植物物药药制制品品的的“药药物物专专家家报报告告“要要求求通通过过已已知知的的具具有有治治疗疗作作用用的活性物质对原料、中间体及成品进行标准化控制。的活性物质对原料、中间体及成品进行标准化控制。第二章第二章 中药指纹图谱研究方法学中药指纹图谱研究方法学 2.1 常用指纹图谱研究的方法与技术常用指纹图谱研究的方法与技术 研究对象的不同，指纹图谱研究的方法与技术也不同，研究对象的不同，指纹图谱研究的方法与技术也不同，并都随着现代科技技术的发展而发展。并都随着现代科技技术的发展而发展。中药指纹图谱研究所采用的方法大致分为：色谱法、光中药指纹图谱研究所采用的方法大致分为：色谱法、光谱

16、法及其它。谱法及其它。色谱法包括：薄层色谱法（色谱法包括：薄层色谱法（TLC）、液相色谱法（）、液相色谱法（LC）、）、气相色谱法（气相色谱法（GC）、高效毛细管电泳法（）、高效毛细管电泳法（CE）；）；光谱法包括：紫外光谱法（光谱法包括：紫外光谱法（UV）、红外光谱法（）、红外光谱法（IR）、近）、近红外光谱法（红外光谱法（NIR）；）；X射线衍射法、核磁共振法（射线衍射法、核磁共振法（NMR）等。）等。（1）X射线衍射法及核磁共振法射线衍射法及核磁共振法 这这两两种种方方法法能能给给出出药药效效物物质质基基础础的的结结构构信信息息，部部分分信信息息也也可可能能与与特特定定化化学学成成分分直

17、直接接关关联联。但但该该两两种种方方法法所所使使用用的的仪仪器器在在国国内内尚尚未未普普及及，不不适适应应该该方方法法的的应应用用与与推推广广。在在中中药药指指纹纹图图谱谱研研究究过过程程中中不不建建议议采采用用X射线衍射法及核磁共振法。射线衍射法及核磁共振法。（2）紫外可见分光光度法和红外光谱法紫外可见分光光度法和红外光谱法 这这两两种种方方法法能能够够给给出出药药效效物物质质基基础础的的结结构构信信息息，但但所所给给出出的的信信息息是是所所有有化化学学物物质质结结构构结结构构信信息息的的加加和和，不不具具备备指指纹纹特特征征，但但可可作作为为中中药药指指纹纹图图谱谱研研究究的的辅辅助助方法

18、。方法。（3）近红外光谱法近红外光谱法 此此方方法法与与红红外外光光谱谱法法原原理理相相同同，但但检检测测时时采采用用近近红红外外波波长长，所所给给出出的的信信息息是是所所有有化化学学物物质质结结构构信信息息的的加加和和，通通过过一一系系列列样样本本的的检检测测（必必须须预预先先知知道道样样品品中中相相关关成成分分的的含含量量或或样样本本的的定定性性归归属属），运运用用化化学学计计量量学学手手段段，建建立立了了样样本本与与信信息息之之间间的的数数学学模模型型。运运用用该该模模型型即即可可对对未未知知样样本本（如如：新新近近购购进进的的原原药药材材或或新新生生产产的的成成品品等等）进进行行辨辨别

19、别分分析析（给给出出结结果果：合合格格与与否否、含量多少等）。含量多少等）。优优点点：检检测测速速度度快快（通通常常为为1 min）、操操作作简简单单、适适宜宜过过程程控制等。控制等。数据处理需掌握一定的化学计量学知识。数据处理需掌握一定的化学计量学知识。近红外技术在农药、化工、农业等相关领域已广泛应用，近红外技术在农药、化工、农业等相关领域已广泛应用，方法的成熟度较高，在中药质量控制方面有较好的应用前景，方法的成熟度较高，在中药质量控制方面有较好的应用前景，可大力推广近红外技术在原材料质量控制中的应用。可大力推广近红外技术在原材料质量控制中的应用。（4）薄层色谱法薄层色谱法 薄薄层层色色谱谱

20、法法为为传传统统的的定定性性、定定量量分分析析方方法法，广广泛泛应应用用于道地药材的定性鉴定。于道地药材的定性鉴定。2000版版中中国国药药典典，采采用用薄薄层层色色谱谱法法进进行行定定性性鉴鉴别别，列列于于【鉴鉴别别】项项下下；采采用用薄薄层层扫扫描描法法进进行行含含量量测测定定，列列于于【含量测定】项下。含量测定】项下。优点：操作简单、分析速度快、一次分析样品数量多。优点：操作简单、分析速度快、一次分析样品数量多。缺点：重现性、精密度差。缺点：重现性、精密度差。可作为中药指纹图谱研究的借鉴与补充。可作为中药指纹图谱研究的借鉴与补充。（5）液相色谱法液相色谱法 最最常常用用的的指指纹纹图图谱

21、谱研研究究方方法法，其其中中高高效效液液相相色色谱谱法法（HPLC）具具有有分分离离效效能能高高、选选择择性性高高、检检测测灵灵敏敏高高、分分析析速速度快、应用范围广等特点。度快、应用范围广等特点。中中药药样样品品中中含含有有的的成成分分绝绝大大多多数数可可在在高高效效液液相相色色谱谱仪仪上上进进行行分分析析检检测测，方方法法成成熟熟，中中药药指指纹纹图图谱谱研研究究应应优优先先考考虑虑高效液相色谱法。高效液相色谱法。（6）气相色谱法气相色谱法 气气相相色色谱谱法法主主要要用用于于分分析析气气体体、挥挥发发性性和和半半挥挥发发性性液液体体以以及及能能够够产产生生足足够够蒸蒸气气压压的的固固体体

22、，或或者者沸沸点点在在500以以下下，相对分子质量相对分子质量400以下的物质。以下的物质。在在中中药药质质量量控控制制中中主主要要用用于于挥挥发发油油、极极性性较较小小的的成成分分或衍生化后的可挥发性成分（如脂肪酸的酯）。或衍生化后的可挥发性成分（如脂肪酸的酯）。特特点点：灵灵敏敏度度高高、分分离离度度好好、分分析析速速度度快快，定定量量分分析析的的精精密密度度优优于于1%，但但分分析析范范围围只只局局限限于于低低沸沸点点成成分分是是其其主主要要不不足。为中药指纹图谱研究的主要方法之一。足。为中药指纹图谱研究的主要方法之一。（7）高效毛细管电泳法高效毛细管电泳法 高高效效毛毛细细管管电电泳泳

23、法法是是以以毛毛细细管管为为分分离离通通道道、以以高高压压直直流流电电场场为为驱驱动动力力的的新新型型分分离离分分析析技技术术。适适用用于于中中药药中中带带电电荷荷的的化化合合物物（蛋蛋白白质质、氨氨基基酸酸、黄黄酮酮、生生物物碱碱）、有有机机酸酸、单单糖糖及及一些中性分子的分离分析，可作为中药指纹图谱研究的补充。一些中性分子的分离分析，可作为中药指纹图谱研究的补充。（8）其它其它 高高效效液液相相色色谱谱与与质质谱谱联联用用（HPLC-MS）、气气相相色色谱谱与与质质谱联用（谱联用（GC-MS）、毛细管电泳与质谱联用（）、毛细管电泳与质谱联用（CE-MS）等。）等。这这些些方方法法可可在在指

24、指纹纹图图谱谱中中的的部部分分色色谱谱峰峰在在无无标标准准物物质质验验证证的的情情况下，起到定性鉴别的作用。况下，起到定性鉴别的作用。最最 常用为：常用为：TLC、HPLC、GC。2.2 指纹图谱研究常用的仪器与设备指纹图谱研究常用的仪器与设备 2.2.1 薄层扫描仪薄层扫描仪 （1）薄层扫描流程薄层扫描流程点样点样 洗脱展开洗脱展开 扫描检测扫描检测 数据处理数据处理 （2）薄层扫描仪主要部件薄层扫描仪主要部件 典典型型的的薄薄层层扫扫描描仪仪主主要要由由机机械械扫扫描描装装置置和和数数据据处处理理两两部部分分组成，新型的薄层扫描仪配有自动点样器等。组成，新型的薄层扫描仪配有自动点样器等。（

25、3）主要厂家及仪器型号主要厂家及仪器型号 日本岛津日本岛津CS系列；美国系列；美国Schoeffel SD3000等。等。2.2.2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪2 2.2.3 气相色谱仪气相色谱仪 2.3 指纹图谱研究对高效液相色谱仪的要求指纹图谱研究对高效液相色谱仪的要求 2.3.1 柱外效应柱外效应 应特别注意应特别注意“柱外效应柱外效应”对分析结果的影响。对分析结果的影响。由由于于样样品品分分子子在在液液体体流流动动相相的的扩扩散散系系数数比比在在气气体体中中小小45个个数数量量级级，液液体体流流动动相相的的流流速速也也比比气气相相慢慢12个个数数量量级级，因因此此，样样品品注注入入色

26、色谱谱柱柱后后，在在柱柱子子以以外外任任何何死死空空间间（如如进进样样器器、柱柱接接连连接接管管和和检检测测器器）中中，样样品品分分子子的的扩扩散散和和滞滞留留都都会会显显著著引引起起色色谱谱峰峰的的扩散，而使柱效降低，所以柱外死体积的影响量不能忽略。扩散，而使柱效降低，所以柱外死体积的影响量不能忽略。在在制制造造和和使使用用高高效效液液相相色色谱谱仪仪时时，应应使使柱柱外外效效应应减减至至最最小小,以获得理想的分析结果。以获得理想的分析结果。建议建议：色谱柱及检测器前：色谱柱及检测器前死体积应最小死体积应最小。2.3.2 流动相的脱气流动相的脱气 流流动动相相在在使使用用前前必必须须进进行行

27、脱脱气气处处理理，以以除除去去其其中中溶溶解解的的气气体体（如如O2），防防止止在在洗洗脱脱过过程程中中，因因压压力力降降低低而而产产生生气气泡泡。若若在在低低死死体体积积检检测测池池中中存存在在气气泡泡，会会增增加加基基线线噪噪声声，严严重重时时会会造造成成分析灵敏度下降而无法进行分析。分析灵敏度下降而无法进行分析。溶解在流动相中的氧气会造成荧光猝灭，影响荧光检测器溶解在流动相中的氧气会造成荧光猝灭，影响荧光检测器的检测；可导致样品中的某些级组分被子氧化或使柱中固定相的检测；可导致样品中的某些级组分被子氧化或使柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。发生降解而改变柱的分离性能。常用的脱气方法有

28、常用的脱气方法有离线式脱气离线式脱气和和在线式脱气在线式脱气。离离线线式式脱脱气气：吹吹氦氦脱脱气气法法、加加热热回回流流法法、抽抽真真空空脱脱气气法法、超超声声波波脱脱气气法法等等。离离线线式式脱脱气气会会因因流流动动相相存存放放时时间间的的延延长长以以致致有有空空气重新溶解在流动相中；气重新溶解在流动相中；在线式脱气在线式脱气技术是把真空脱气装置串接到贮液系统中，并结合技术是把真空脱气装置串接到贮液系统中，并结合膜过滤器，实现流动相在进入输液泵前的连续脱气。在线式脱膜过滤器，实现流动相在进入输液泵前的连续脱气。在线式脱气法的脱气效果明显优于离线式脱气法，并适用于多元溶剂体气法的脱气效果明显

29、优于离线式脱气法，并适用于多元溶剂体系。系。建议建议：选择：选择在线脱气在线脱气。2.3.3 梯度洗脱梯度洗脱 梯梯度度洗洗脱脱是是流流动动相相中中含含有有两两种种或或两两种种以以上上的的不不同同极极性性的的溶溶剂剂，在在洗洗脱脱过过程程中中连连续续或或间间断断改改变变流流动动相相的的组组成成，以以调调节节它它的的极极性性，使使每每个个流流出出的的组组分分获获得得最最理理想想的的分分离离效效果果，并并使使样样品品中中的的所所有有组组分分可可在在最最短短的的分分析析时时间间内内，以以适适用用的的分分离离度度获获得得圆圆满满的的选选择择性分离。分为高压梯度和低压梯度两种方式进行操作。性分离。分为高

30、压梯度和低压梯度两种方式进行操作。由由于于高高压压梯梯度度装装置置中中，每每种种溶溶剂剂是是分分别别由由泵泵输输送送的的，进进入入混混合合器器后后，溶溶剂剂的的可可压压缩缩性性和和溶溶剂剂混混合合时时的的热热力力学学体体积积的的变变化化，可可能能影影响响输输入入到到色色谱谱柱柱的的流流动动相相的的组组成成，因因此此高高压压梯梯度度洗洗脱脱过过程程中中为保证流速稳定必须使用恒流泵，否则很难获得重复性结果。为保证流速稳定必须使用恒流泵，否则很难获得重复性结果。低压梯度是在常压下将多元溶剂输至混合器中。低压梯度是在常压下将多元溶剂输至混合器中。优优点点是是：仅仅需需要要使使用用一一个个高高压压输输液

31、液泵泵；减减小小了了溶溶剂剂可可压压缩缩性性的的影影响响，并并能能完完全全消消除除由由于于溶溶剂剂混混合合引引起起的的热热力力学学体体积积变变化化带带来来的误差。的误差。建议建议：选择：选择低压梯度低压梯度。2.3.4 样品进样样品进样 进样器有以下几种：进样器有以下几种：（1）停流进样装置停流进样装置 为为防防止止在在带带压压操操作作下下引引起起流流动动相相泄泄露露，此此装装置置要要求求进进样样前压降至常压下再进样，操作繁琐，已较少使用。前压降至常压下再进样，操作繁琐，已较少使用。（2）六通阀进样装置六通阀进样装置 该方法重现性较好，较常用。该方法重现性较好，较常用。（3）自动进样器自动进样

32、器 自自动动进进样样器器由由计计算算机机自自动动控控制制定定量量阀阀，按按预预先先编编制制的的注注射射样样品品操操作作程程序序工工作作。取取样样、进进样样、复复位位、样样品品管管路路清清洗洗和和样样品品盘盘的的转转动动，全全部部按按预预定定程程序序自自动动进进行行，一一次次可可进进行行几几十十个个或上百个样品的分析。或上百个样品的分析。自自动动进进样样的的样样品品量量可可连连续续调调节节，适适合合大大量量样样品品分分析析，节节省人力。省人力。（4）建建议议：中中药药指指纹纹图图谱谱研研究究过过程程中中，由由于于对对样样品品的的进进样样量量精精确确度度要要求求不不高高，因因此此对对进进样样器器的

33、的选选择择可可结结合合研研究究者者的的实实际情况，建议选择际情况，建议选择六通阀手动进样装置六通阀手动进样装置。2.3.5 色谱柱色谱柱2.3.6 柱温柱温 不不同同柱柱温温下下同同一一成成分分在在的的保保留留时时间间往往往往发发生生迁迁移移，有时还影响成分之间的分离效果。有时还影响成分之间的分离效果。由由于于中中药药样样品品成成分分的的复复杂杂性性，尤尤其其是是中中药药指指纹纹图图谱谱技技术术要要求求色色谱谱峰峰的的相相对对保保留留时时间间、峰峰面面积积比比值值的的相相对对恒恒定定，对对柱柱温温的的要要求求应应严严格格控控制制，以以保保证证分分析析方方法法的重现性。的重现性。建议建议：选择：

34、选择柱温箱柱温箱。2.3.7 检测器检测器 （1）紫外线检测器紫外线检测器 应用最广，要求分析样品必须在紫外线区有吸收。应用最广，要求分析样品必须在紫外线区有吸收。特特点点：灵灵敏敏度度高高、线线性性范范围围宽宽，可可做做成成很很小小池池体体积积的的流流通通，对对流流动动相相的的流流速速和和温温度度变变化化不不太太敏敏感感，易易操操作作，不不破破坏坏样样品，波长可以选择及可用于梯度洗脱。品，波长可以选择及可用于梯度洗脱。（2）示差折光检测器示差折光检测器 示示差差折折光光检检测测器器是是通通用用型型检检测测器器，对对在在可可见见光光或或紫紫外外线线区区无无吸吸收收的的样样品品一一般般选选用用。

35、不不破破坏坏样样品品，缺缺点点是是对对温温度度变变化化敏感，不能用低梯度洗脱，灵敏度低，不能用于痕量分析。敏感，不能用低梯度洗脱，灵敏度低，不能用于痕量分析。（3）荧光检测器荧光检测器 （4）电化学检测器电化学检测器 （5）二极管阵列检测器二极管阵列检测器 光光束束通通过过流流通通池池、分分光光系系统统后后，使使所所有有波波长长在在二二级级管管阵阵列列检检测测器器同同时检测器，可得三维的时间时检测器，可得三维的时间-色谱信号色谱信号-吸收光谱图。吸收光谱图。特特点点：可可进进行行全全波波长长检检测测，一一次次进进样样可可以以检检测测到到样样品品中中不不同同波波长长下下的的所所有有组组分分；光光

36、谱谱分分辨辨率率高高，可可以以检检测测色色谱谱峰峰的的纯纯度度；灵灵敏敏度度高高，线线性性范范围宽，基线噪声小。围宽，基线噪声小。可可得得到到所所有有组组分分的的全全波波长长扫扫描描图图，可可用用于于定定性性分分析析，通通过过对对三三维维色色谱图的分析，可以优化检测波长。谱图的分析，可以优化检测波长。（6）蒸发激光光散射检测器蒸发激光光散射检测器 通通用用性性检检测测器器。可可以以检检测测挥挥发发性性低低于于流流动动相相的的任任何何样样品品，可可作作于于无无生生色色团团物物质质的的检检测测，如如碳碳水水化化合合物物（多多糖糖）、类类脂脂类类（磷磷脂脂）、皂皂苷苷、不不进行衍生化的脂肪酸和氨基酸

37、，以及结构不明又无标准样品的未知物。进行衍生化的脂肪酸和氨基酸，以及结构不明又无标准样品的未知物。根根据据具具体体情情况况，进进行行选选择择。据据统统计计，95%的的中中药药组组分分在在可可见见光光或或紫紫外线区有吸收，可首选配置可编波长紫外线检测器（外线区有吸收，可首选配置可编波长紫外线检测器（VWD）。）。建建议议：在在指指纹纹图图谱谱研研究究过过程程中中，由由于于并并不不完完全全了了解解样样品品中中所所含含组组分分的的化化学学结结构构，尤尤其其是是复复方方制制剂剂所所含含组组分分结结构构类类型型不不一一，最最大大吸吸收收波波长长各各不不相同，很难一次成功地选择好检测波长。因此相同，很难一

38、次成功地选择好检测波长。因此最好选用二极管阵列检测器最好选用二极管阵列检测器。第三章第三章 中药色谱指纹图谱研究过程中的中药色谱指纹图谱研究过程中的关键问题关键问题 指纹图谱技术在植物药领域已应用十余年，研究指纹图谱技术在植物药领域已应用十余年，研究方法与研究思路相对成熟，已形成共识，普遍采用方法与研究思路相对成熟，已形成共识，普遍采用HPLC、TLC、GC或或NIR（近红外技术），对植物药（近红外技术），对植物药有效组分进行全成分质量控制，即指纹图谱技术。有效组分进行全成分质量控制，即指纹图谱技术。3.1 方案设计与思路方案设计与思路3.1.1 研究对象的确定研究对象的确定 植物药或中药的成

39、分可分为：蛋白质、脂类、糖及衍生物、有机酸、酚植物药或中药的成分可分为：蛋白质、脂类、糖及衍生物、有机酸、酚类、鞣质、醌类、内酯、香豆精、黄酮类、皂苷类、生物碱类、甾体类、萜类、鞣质、醌类、内酯、香豆精、黄酮类、皂苷类、生物碱类、甾体类、萜类、挥发油等。类、挥发油等。当当研研究究某某个个注注射射剂剂品品种种的的指指纹纹图图谱谱时时，首首先先必必须须调调研研相相关关的的文文献献、新新药药申申报报资资料料（质质量量部部分分和和工工艺艺部部分分）及及其其它它研研究究结结果果，尽尽可可能能详详尽尽地地了了解解药药材材、中中间间体体及及成成品品中中所所含含水水量量成成分分的的种种类类及及其其理理化化性性

40、质质，经经综综合合分分析析后后找找出出成成品品中中的的药药效效成成妥妥或或有有效效成成分分，作作为为成成品品或或中中间间体体指指纹纹图图谱谱的的研研究究对对象象，即即分分析析检测目标。检测目标。如如：黄黄芪芪含含黄黄酮酮、皂皂苷苷及及多多糖糖；黄黄芪芪多多糖糖注注射射液液是是以以黄黄芪芪中中的的多多糖糖为为原原料料，因因此此对对黄黄芪芪多多糖糖注注射射液液进进行行指指纹纹图图谱谱研研究究时时应应以以多多糖糖作作为为研研究究对对象象；研研究究其其中中间间体体时时也也应应以以多多糖糖为为研研究究对对象象；研研究究原原药药材材的的指指纹纹图图谱谱时时应应把把黄黄酮酮、皂皂苷苷及多糖作为研究对象。及多

41、糖作为研究对象。复复方方应应以以君君药药、臣臣药药中中有有效效成成分分作作为为主主要要研研究究对对象象，佐佐使使药药中中的的成成分分可可采用其它指纹图谱方法进行辅助、补充研究。采用其它指纹图谱方法进行辅助、补充研究。3.1.2 研究方法的选择研究方法的选择 主主要要采采用用色色谱谱法法。各各种种色色谱谱法法是是互互补补的的，应应根根据据研研究究对对象象的的实实际际需需要要和和可可能能以以及及按按照照不不同同色色谱谱技技术术的的特特点点和和优优势势而而定定，目目的的是是保保证证方方法法的的重重现现性性和和确确能能反反映映产产品品质量的主要化学成分。质量的主要化学成分。一一个个中中药药制制剂剂指指

42、纹纹图图谱谱应应可可以以同同时时采采用用两两种种或或更更多多种方法进行研究。种方法进行研究。指指纹纹图图谱谱研研究究方方法法应应根根据据研研究究对对象象的的物物理理化化学学性性质质来来选选择择，大大多多数数方方法法可可采采用用HPLC法法。通通常常挥挥发发油油类类采采用用GC。一一些些难难以以检检测测或或采采用用上上述述方方法法得得不不到到较较理理想想的的分分离离效果时，可采用效果时，可采用TLC或或CE。3.1.3 研究内容研究内容 根根据据国国家家药药品品监监督督管管理理局局下下发发的的中中药药注注射射剂剂指指纹纹图图谱谱研研究究的的技技术术要要求求（暂暂行行）的的规规定定，主主要要研研究

43、究内内容容有有原原药药材材、中中间间体体、注注射射剂剂的的指指纹纹图图谱谱，涉涉及及样样品品名名称称、来来源源、制制备备、测测定方法、指纹图谱及技术参数等研究项。定方法、指纹图谱及技术参数等研究项。3.2 原药材、中间体及注射剂样品选择与收集原药材、中间体及注射剂样品选择与收集 中中药药是是天天然然产产物物，中中药药的的活活性性成成分分都都是是次次生生的的代代谢谢产产物物，本本身身有有它它内内在在的的不不稳稳定定性性。我我国国药药材材品品种种多多、产产地地广广、分分散散度度大大，造造成成了了中中药药材材基基源源复复杂杂，形形成成许许多多同同名名异异物物的的品品种种，这这些些品品种种在在传传统统

44、中中医医临临床床中中并并未未加加以以细细分分，其其中中多多数数已已收收入入中中华华人人民民共共和和国国药药典典。对对于于中中国国药药典典收收载载的的品品种种，从从中中医医的的角角度度均均可可入入药药，这这种种多多基基源源药药材材增增加加了了色色谱谱指指纹纹图图谱谱研研究究的的难难度。度。近年由于药材量需求增大，药材资源破坏严重，药材内在质近年由于药材量需求增大，药材资源破坏严重，药材内在质量下降，炮制加工的粗放造成有效成分的流失，人为因素造成量下降，炮制加工的粗放造成有效成分的流失，人为因素造成了药材质量不稳定，不利于色谱指纹图谱的研究与应用。了药材质量不稳定，不利于色谱指纹图谱的研究与应用。

45、我我国国药药材材GAP工工程程已已起起步步，将将有有利利于于中中药药注注射射剂剂及及其其它它制制剂的质量控制。剂的质量控制。已已生生产产的的注注射射剂剂，因因生生产产中中药药材材来来源源基基本本确确定定，在在补补充充其其指指纹图谱时，原药材样品的收集应遵循以下原则：纹图谱时，原药材样品的收集应遵循以下原则：药材尽可能固定产地（如道地药材）、采收期、炮制方法；药材尽可能固定产地（如道地药材）、采收期、炮制方法；对对已已往往生生产产使使用用过过的的药药材材应应结结合合临临床床使使用用情情况况选选择择收收集集样样品品，对对工工艺艺稳稳定定、疗疗效效恒恒定定、临临床床使使用用中中很很少少出出现现异异常

46、常医医疗疗事事故故的的药药材批次应重点选择；材批次应重点选择；另另外外还还应应收收集集不不同同产产地地、不不同同采采收收期期的的药药材材，这这些些药药材材虽虽然然含含量量高高低低不不同同，组组成成比比例例各各异异，但但当当正正常常使使用用的的药药材材一一旦旦出出现现偏偏差差时时，可可通通过过这这些些批批次次的的药药材材实实行行合合理理“勾勾兑兑”。通通过过对对指指纹纹图图谱谱的的研究，可以对研究，可以对“勾兑勾兑”过程进行指导。过程进行指导。中中间间体体、注注射射剂剂因因其其生生产产工工艺艺已已经经恒恒定定，样样品品的的收收集集原原则则也也应应重重点点选选择择工工艺艺稳稳定定、疗疗效效恒恒定定

47、、临临床床使使用用中中很很少少出出现现医医疗疗事事故故的批次。的批次。根根据据中中药药注注射射剂剂指指纹纹图图谱谱研研究究的的技技术术要要求求（暂暂行行）之之规规定定，原原药药材材、中中间间体体及及注注射射剂剂样样品品至至少少应应收收集集10批批次次。不不可可以以同同一批次的样品分散成数个批次，充当样品。一批次的样品分散成数个批次，充当样品。33 原药材、中间体及注射剂的预处理原药材、中间体及注射剂的预处理 在在指指纹纹图图谱谱研研究究过过程程中中，供供试试品品（原原药药材材、中中间间体体及及注注射射剂剂）溶溶液液的的制制备过程不是关键性的技术问题，但操作烦琐。备过程不是关键性的技术问题，但操

48、作烦琐。原原药药材材的的供供试试品品制制备备最最为为复复杂杂。原原药药材材所所含含的的多多种种组组分分混混杂杂在在一一起起，样样品品制制备备时时，应应根根据据所所含含成成分分和和物物理理化化学学性性质质，通通过过萃萃取取、沉沉淀淀、吸吸附附或或通通过过化学反应，分离富集样品。化学反应，分离富集样品。如如：黄黄芪芪药药材材中中的的黄黄酮酮类类成成分分通通过过碱碱水水萃萃取取，皂皂苷苷类类成成分分通通过过大大孔孔树树脂脂吸附；苦参中的总生物碱通过阳离子树脂吸附与解吸附。吸附；苦参中的总生物碱通过阳离子树脂吸附与解吸附。中中间间体体是是原原药药材材经经过过了了多多步步处处理理而而得得，已已经经滤滤过

49、过了了大大部部分分成成分分，只只保保留留一一小小 部部分分有有效效组组分分，样样品品制制备备时时，可可针针对对有有效效成成分分处处理理，并并参参照照原原药药材材的的制制备备方方法。法。样样品品富富集集后后，尚尚需需过过氧氧化化铝铝预预柱柱、C18预预柱柱、硅硅胶胶预预柱柱、聚聚酰酰胺胺预预柱柱等等，以除去色素等杂质，避免干扰或对色谱柱的损耗。以除去色素等杂质，避免干扰或对色谱柱的损耗。注注射射液液中中除除少少数数品品种种添添加加助助溶溶剂剂外外，所所含含化化学学成成分分均均具具有有较较好好的的水水溶溶解解性性能能，面面且且研研究究生生产产工工艺艺时时考考虑虑到到色色素素、生生物物大大分分子子等

50、等因因素素，生生产产过过程程中中已已通过微孔滤膜、脱色等操作，因此，样品无需特殊处理，可直接分析检测。通过微孔滤膜、脱色等操作，因此，样品无需特殊处理，可直接分析检测。3.4 色谱条件选择色谱条件选择 指纹图谱的色谱条件是研究检测方法过程中最重要、关键性的内容。指纹图谱的色谱条件是研究检测方法过程中最重要、关键性的内容。我们以我们以HPLC法为例，阐述各影响因素及解决途径。法为例，阐述各影响因素及解决途径。3.4.1 流动相流动相 可可用用作作流流动动相相的的溶溶剂剂有有：乙乙腈腈、甲甲醇醇、乙乙醇醇、四四氢氢呋呋喃喃、氯氯仿仿、二二氯氯甲甲烷烷、正正已已烷烷等等。反反相相高高效效液液相相，以