体外放射分析技术.ppt

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1、第第六六章章 体外放射分析技术体外放射分析技术In vitro radioassayIn vitro radioassay体外分析发展史YalowYalow BersonBerson 一、定义一、定义以放射性核素或其他非放射性物质以放射性核素或其他非放射性物质标记的配体标记的配体(Ligand)(Ligand)为示踪剂，以为示踪剂，以配体和结合体的结合反应为基础，配体和结合体的结合反应为基础，在试管内进行的微量生物活性物质在试管内进行的微量生物活性物质的检测技术。的检测技术。二、二、分类分类:体外分析技术体外放射分析体外放射分析体外非放射分析体外非放射分析放射性竞争放射性竞争结合分析结合分析放

2、射性非竞放射性非竞争结合分析争结合分析放射免疫分析放射免疫分析放射免疫分析放射免疫分析 (radioimmunoassay,radioimmunoassay,RIA)RIA)RIA)RIA)免疫放射分析免疫放射分析免疫放射分析免疫放射分析(immunoradiometric immunoradiometric assay,assay,IRMA)IRMA)IRMA)IRMA)酶免疫分析酶免疫分析酶免疫分析酶免疫分析(EIA)(EIA)化学发光免疫分析化学发光免疫分析化学发光免疫分析化学发光免疫分析 (CLIA)(CLIA)荧光免疫分析荧光免疫分析荧光免疫分析荧光免疫分析(FIA)(FIA)放射免

3、疫分析放射免疫分析 radioimmunoassay,RIA一、一、RIARIA的基本原理的基本原理（一）竞争抑制结合反应：（一）竞争抑制结合反应：放射免疫分析是在体外条件下，由足放射免疫分析是在体外条件下，由足量的非标记抗原（量的非标记抗原（AgAg）与定量的标记抗原）与定量的标记抗原（*Ag*Ag）对限量的特异性抗体（）对限量的特异性抗体（AbAb）的竞争）的竞争抑制结合反应。抑制结合反应。分析原理分析原理*Ag +AbAg+*Ag-Ab +*AgAg-Ab +Ag条件：1.*Ag与Ag免疫活性相同2.*Ag与Ab恒量3.*Ag与Ag总量大于Ab有效结合位点n nAg*Ag*与与AgAg由

4、由于于免免疫疫化化学学性性质质一一致致，共共同同竞竞争争性性与与AbAb结结合合，当当Ag*Ag*和和AbAb的的量量保保持持恒恒定定，Ag*Ag*与与AgAg之之和和大大于于AbAb时时，则则Ag*-AbAg*-Ab复复合合物物的的形形成成受受AgAg含含量量的的制制约约，二二者者之之间间存存在在竟竟争争抑抑制制的的函函数数关关系系，即即随随着着AgAg浓浓度度的的增增加加，Ag*-AbAg*-Ab复复合合物物就就减减少少，因因为为Ag*Ag*对对AbAb的的结结合合被被AgAg竞竞争争性性抑抑制制。根根据据这这一一函函数数关关系系的的标标准准曲曲线线，可可求求出出被被测测抗抗原原的的含含量

5、量（二）剂量反应曲线（二）剂量反应曲线：标准曲线标准曲线 标记物与被测物之间的函数关系可以用剂标记物与被测物之间的函数关系可以用剂量反应曲线来表示。剂量反应曲线是用一系列量反应曲线来表示。剂量反应曲线是用一系列标准抗原反应而绘制出来的，所以又叫标准曲标准抗原反应而绘制出来的，所以又叫标准曲线。线。标准抗原标准抗原(标准品标准品)是厂家在试剂盒中提供的已知剂量是厂家在试剂盒中提供的已知剂量的非标记抗原。的非标记抗原。标准曲线的绘制方法标准曲线的绘制方法用一系列已知浓度的标准抗原和一定量的标记抗原在用一系列已知浓度的标准抗原和一定量的标记抗原在一定条件下同限量的特异性抗体进行反应；一定条件下同限量

6、的特异性抗体进行反应；在反应达到平衡后，利用适当的分离方法分离在反应达到平衡后，利用适当的分离方法分离B B和和F F；分别测量分别测量B B和和F F的放射性；的放射性；用反应变量（如用反应变量（如B/FB/F）作为纵坐标，反应剂量作为横）作为纵坐标，反应剂量作为横坐标（即一系列标准抗原）作一条曲线，就得到不同坐标（即一系列标准抗原）作一条曲线，就得到不同浓度的标准抗原对反应变量的竞争抑制曲线，这就是浓度的标准抗原对反应变量的竞争抑制曲线，这就是剂量反应曲线。剂量反应曲线。标标 准准 曲曲 线线二、RIA的基本步骤：实验由两部分组成：实验由两部分组成：实验由两部分组成：实验由两部分组成：1.

7、1.1.1.标准曲线：标准曲线：标准曲线：标准曲线：用一系列浓度递增的标准品（用一系列浓度递增的标准品（用一系列浓度递增的标准品（用一系列浓度递增的标准品（o o o oAgAgAgAg），在），在），在），在 严格相同的条件下同严格相同的条件下同严格相同的条件下同严格相同的条件下同*AgAgAgAg竞争与竞争与竞争与竞争与AbAbAbAb结合反应，以结合反应，以结合反应，以结合反应，以o o o oAgAgAgAg的的的的 剂量为横坐标，剂量为横坐标，剂量为横坐标，剂量为横坐标，*Ag.AbAg.AbAg.AbAg.Ab结合率（结合率（结合率（结合率（B%B%B%B%）为纵坐标制得）为纵坐标

8、制得）为纵坐标制得）为纵坐标制得 刻度曲线（刻度曲线（刻度曲线（刻度曲线（Calibration curveCalibration curveCalibration curveCalibration curve）；）；）；）；2.2.2.2.样本测定：样本测定：样本测定：样本测定：同等条件下，待测样本可获得一定的同等条件下，待测样本可获得一定的同等条件下，待测样本可获得一定的同等条件下，待测样本可获得一定的B%B%B%B%，由此可从标准曲线上求得待测物（由此可从标准曲线上求得待测物（由此可从标准曲线上求得待测物（由此可从标准曲线上求得待测物（o o o oAgAgAgAg）的含量。）的含量。）

9、的含量。）的含量。三、质量控制(Quality Control):目的：为了获得准确可靠的测定结果目的：为了获得准确可靠的测定结果目的：为了获得准确可靠的测定结果目的：为了获得准确可靠的测定结果 室间：某一地区室间：某一地区室间：某一地区室间：某一地区/全国性机构就一全国性机构就一全国性机构就一全国性机构就一些分析项目些分析项目些分析项目些分析项目质控质控质控质控 对各实验室所得结果进行统计比较对各实验室所得结果进行统计比较对各实验室所得结果进行统计比较对各实验室所得结果进行统计比较 室内：实验室内部对每次分析结果的质量进室内：实验室内部对每次分析结果的质量进室内：实验室内部对每次分析结果的质

10、量进室内：实验室内部对每次分析结果的质量进 行检查和控制行检查和控制行检查和控制行检查和控制 误差：误差：误差：误差：A.A.A.A.随机误差随机误差随机误差随机误差(Random Error)(Random Error)(Random Error)(Random Error)：放射性测量的统计误差放射性测量的统计误差放射性测量的统计误差放射性测量的统计误差 不可避免，呈高斯分不可避免，呈高斯分不可避免，呈高斯分不可避免，呈高斯分 实验操作的实验误差实验操作的实验误差实验操作的实验误差实验操作的实验误差 布，以精密度布，以精密度布，以精密度布，以精密度评价评价评价评价 试剂配制等试剂配制等试剂

11、配制等试剂配制等 B.B.系统误差系统误差系统误差系统误差(Systematic Error)(Systematic Error)(Systematic Error)(Systematic Error)：通过努力可以通过努力可以通过努力可以通过努力可以 消除消除消除消除 由某一固定因素引起，仪器、试剂、由某一固定因素引起，仪器、试剂、由某一固定因素引起，仪器、试剂、由某一固定因素引起，仪器、试剂、操作操作操作操作程序、试验方法程序、试验方法程序、试验方法程序、试验方法等等等等 主要优点：生物制剂，稳定性受多种因素影响，需有质量控生物制剂，稳定性受多种因素影响，需有质量控生物制剂，稳定性受多种因

12、素影响，需有质量控生物制剂，稳定性受多种因素影响，需有质量控 制措施（制措施（制措施（制措施（Quality Control)Quality Control)Quality Control)Quality Control)灵敏度高：可达灵敏度高：可达灵敏度高：可达灵敏度高：可达10101010-9-9-9-910101010-12-12-12-12 g(mol)g(mol)g(mol)g(mol)特异性强：抗原抗体结合具有很高的特异性特异性强：抗原抗体结合具有很高的特异性特异性强：抗原抗体结合具有很高的特异性特异性强：抗原抗体结合具有很高的特异性 应用范围广：凡能制备相应抗体的生物活性物质，应

13、用范围广：凡能制备相应抗体的生物活性物质，应用范围广：凡能制备相应抗体的生物活性物质，应用范围广：凡能制备相应抗体的生物活性物质，只要含量不低于只要含量不低于只要含量不低于只要含量不低于RIARIARIARIA探测极限，都可建立探测极限，都可建立探测极限，都可建立探测极限，都可建立 操作简便：所需试剂少，测量及数据处理易于实操作简便：所需试剂少，测量及数据处理易于实操作简便：所需试剂少，测量及数据处理易于实操作简便：所需试剂少，测量及数据处理易于实 现自动化现自动化现自动化现自动化主要缺点：主要缺点：主要缺点：主要缺点：灵敏度很难超过灵敏度很难超过灵敏度很难超过灵敏度很难超过10101010-

14、15-15-15-15g g g g水平水平水平水平非竞争性放射免疫分析(免疫放射分析 IRMA)一一一一.基本原理：基本原理：基本原理：基本原理：放射核素标记在抗体上，与待测抗原结合后，用一放射核素标记在抗体上，与待测抗原结合后，用一放射核素标记在抗体上，与待测抗原结合后，用一放射核素标记在抗体上，与待测抗原结合后，用一定手段将多余抗体除去，测定复合物的放射性，其定手段将多余抗体除去，测定复合物的放射性，其定手段将多余抗体除去，测定复合物的放射性，其定手段将多余抗体除去，测定复合物的放射性，其活度与待测抗原呈正相关活度与待测抗原呈正相关活度与待测抗原呈正相关活度与待测抗原呈正相关 Ag +A

15、g +*Ab Ag.Ab Ag.*Ab +Ab +*AbAb (过量）过量）过量）过量）(B)(F)(B)(F)(B)(F)(B)(F)IRMAIRMA与与RIARIA的主要区别：的主要区别：RIA IRMARIA IRMA 1.1.竞争性结合分析竞争性结合分析竞争性结合分析竞争性结合分析 非竞争性结合分析非竞争性结合分析非竞争性结合分析非竞争性结合分析2.2.三种主要反应试剂三种主要反应试剂三种主要反应试剂三种主要反应试剂 两种主要反应试剂两种主要反应试剂两种主要反应试剂两种主要反应试剂3.3.标记抗原标记抗原标记抗原标记抗原 标记抗体标记抗体标记抗体标记抗体4.4.复合物放射活度与复合物放

16、射活度与复合物放射活度与复合物放射活度与 复合物放射活度与复合物放射活度与复合物放射活度与复合物放射活度与 待测抗原呈负相关待测抗原呈负相关待测抗原呈负相关待测抗原呈负相关 待测抗原呈正相关待测抗原呈正相关待测抗原呈正相关待测抗原呈正相关 5.5.NSBNSB主要影响高剂主要影响高剂主要影响高剂主要影响高剂 NSBNSB主要影响低剂主要影响低剂主要影响低剂主要影响低剂 量反应量反应量反应量反应 量反应量反应量反应量反应IRMA主要优点：温育时间短：温育时间短：温育时间短：温育时间短：37 37 37 37温育温育温育温育2 2 2 23 3 3 3小时即可小时即可小时即可小时即可灵敏度高：灵敏

17、度高：灵敏度高：灵敏度高：是是是是RIARIARIARIA的的的的10 10 10 10 100 100 100 100倍倍倍倍 测量范围宽：标准曲线工作范围宽测量范围宽：标准曲线工作范围宽测量范围宽：标准曲线工作范围宽测量范围宽：标准曲线工作范围宽,RIA,RIA,RIA,RIA 为为为为2 2 2 2个个个个 数量级，数量级，数量级，数量级，IRMAIRMAIRMAIRMA可达可达可达可达3 3 3 3个数量级个数量级个数量级个数量级特异性强：特异性强：特异性强：特异性强：应用针对某一抗原决定簇的单抗应用针对某一抗原决定簇的单抗应用针对某一抗原决定簇的单抗应用针对某一抗原决定簇的单抗,不不

18、不不 易发生交叉反应易发生交叉反应易发生交叉反应易发生交叉反应IRMAIRMAIRMAIRMA主要缺点：主要缺点：主要缺点：主要缺点：需要二种需要二种需要二种需要二种McAbMcAbMcAbMcAb 抗体用量大抗体用量大抗体用量大抗体用量大非放射标记的免疫分析法 化学发光分析 时间分辨荧光分析 酶免疫分析电化学发光（电化学发光（ECLECL）：）：ECLECL是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫之是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫之后的新一代标记免疫测定技术后的新一代标记免疫测定技术 ECLECL是一种在电极表面由电化学引发的化学反应，实际上是一种在电极表面由电化学引发的化学

19、反应，实际上包括了电、化学发光两个过程，故是化学发光的一种发展，包括了电、化学发光两个过程，故是化学发光的一种发展，电化学反应在电极表面周而复始的进行，光信号明显增强，电化学反应在电极表面周而复始的进行，光信号明显增强，因而因而ECLECL与与CLCL的差异在于：的差异在于：ECLECL是电启动发光反应，是电启动发光反应，是电启动发光反应，是电启动发光反应，CLCL是通过化合物简单的混合启是通过化合物简单的混合启是通过化合物简单的混合启是通过化合物简单的混合启动的发光反应。动的发光反应。动的发光反应。动的发光反应。ECL ECL反应更易精确控制，更具灵活性。反应更易精确控制，更具灵活性。反应更

20、易精确控制，更具灵活性。反应更易精确控制，更具灵活性。ECL反应原理：反应原理：化学发光反应导致光的发射是来自钌（化学发光反应导致光的发射是来自钌（Ru）化合物的电的）化合物的电的激发，而不是化学的激发。激发，而不是化学的激发。二二.时间分辨荧光免疫时间分辨荧光免疫（time-resolved fluorescence immunossaytime-resolved fluorescence immunossay TRFIA TRFIA）稀土族中的镧系元素（稀土族中的镧系元素（EuEu、TbTb、SmSm、DyDy等）以离子价态时，等）以离子价态时，受到紫外光或激光等激发后，会以荧光的形式发射

21、光谱，其受到紫外光或激光等激发后，会以荧光的形式发射光谱，其激发光光谱的波长和发射荧光的强度因离子不同而有差异，激发光光谱的波长和发射荧光的强度因离子不同而有差异，而且具有相当长的衰减时间，这样就为时间分辨荧光而且具有相当长的衰减时间，这样就为时间分辨荧光(TRF)(TRF)所发射的信号采集和多标记的应用提供了条件。所发射的信号采集和多标记的应用提供了条件。TRFIATRFIA是一种以镧系元素是一种以镧系元素螯合物标记抗体或抗原，螯合物标记抗体或抗原，利用时间分辨荧光光度利用时间分辨荧光光度计测量法排除检品中非计测量法排除检品中非特异性荧光干扰的测量特异性荧光干扰的测量技术。技术。铕：铕：（E

22、ueuropium）铽铽：（Tbterbium）钐钐：（Smsamarium）镝：镝：（Dydysprosium）原理：原理：TRFIATRFIA的标记物由镧系元素的标记物由镧系元素螯合物螯合物与与AbAb或或AgAg组成。待测物组成。待测物通过免疫反应形成的复合物上，标有镧系元素（通过免疫反应形成的复合物上，标有镧系元素（Eu Eu3+3+），经紫），经紫外线激发后会发出荧光。但连接在复合物上的外线激发后会发出荧光。但连接在复合物上的EuEu发射的荧光很发射的荧光很弱，需要将其游离出来再形成一个能发射强荧光的络合物。因弱，需要将其游离出来再形成一个能发射强荧光的络合物。因此在免疫反应结束后，

23、需向体系中加入一种此在免疫反应结束后，需向体系中加入一种“荧光荧光增强剂增强剂”，大大增加信号，所以该技术有时也称为解离增强镧系荧光免疫大大增加信号，所以该技术有时也称为解离增强镧系荧光免疫分析（分析（DELFIADELFIA）。）。所谓时间分辨是指所谓时间分辨是指EuEu3+3+受激活后产生寿命较长的荧光，而受激活后产生寿命较长的荧光，而一般干扰荧光寿命较短，固可用仪器把测量时间定在每次激发一般干扰荧光寿命较短，固可用仪器把测量时间定在每次激发后的数百后的数百 s s之后才开始，干扰荧光已衰减到很低水平，所取荧之后才开始，干扰荧光已衰减到很低水平，所取荧光信号是荧光衰减过程的中间一段。光信号是荧光衰减过程的中间一段。螯合剂：螯合剂：异硫氰酸苯基异硫氰酸苯基-EDTA-EDTA（ICB-EDTAICB-EDTA）、对异硫氰酸苯）、对异硫氰酸苯 基基-二乙基三氨基四乙酸（二乙基三氨基四乙酸（p-ICB-DTTAp-ICB-DTTA）增强剂：增强剂：-萘酰三氟丙酮（萘酰三氟丙酮（-NTA-NTA）几种免疫法检测血清中甲状腺素的精度：几种免疫法检测血清中甲状腺素的精度：