培训讲义-修改后26356.docx

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1、实验一植物核酸提取一、植物叶片总DNA的大量提取【实验原理理】CTAB法法原理CCTABB(heexaddecyyltrrimeethyylammmonniumm brromiide，十十六烷基基三甲基基溴化铵铵)，是是一种阳阳离子去去污剂，具具有从低低离子强强度溶液液中沉淀淀核酸与与酸性多多聚糖的的特性。在在高离子子强度的的溶液中中(00.7mmol/L NNaCll)，CCTABB与蛋白白质和多多聚糖形形成复合合物，只只是不能能沉淀核核酸。通通过有机机溶剂抽抽提，去去除蛋白白、多糖糖、酚类类等杂质质后，加加入乙醇醇沉淀即即可使核核酸分离离出来。Tris-HCll (ppH8.0)提提供一个

2、个缓冲环环境，防防止核酸酸被破坏坏；EDTA螯螯合Mgg2+或MMn2+离子，抑抑制DNNasee活性；NaCl 提供一一个高盐盐环境，使使DNA充分溶溶解在液液相中； CTABB溶解细细胞膜，并并结合核核酸，使使核酸便便于分离离；PVP(聚聚乙烯吡吡咯烷酮酮)是酚酚的络合合物，能能与多酚酚形成一一种不溶溶的络合合物质，有有效去除除多酚，减减少DNNA中酚酚的污染染；同时时它也能能和多糖糖结合，有有效去除除多糖。 【实验目的的】利用CTAAB法从从植物叶叶片组织织中提取取高质量量DNAA。【主要试剂剂】1. CTAB提提取缓冲冲液：11.4MM NaaCl，1000mM Triis ppH 8

3、8.0，2% CTAAB，20mmM EEDTAA，0.55% NNaHSSO3，2% -巯巯基乙醇醇。室温保保存，五五年有效效。2. 氯仿：室温温保存，五五年有效效。3. 无水乙醇：-200保存，五五年有效效。4. 70%乙醇醇溶液：将无水水乙醇和和H2O按77:3混合。室室温保存存，五年年有效。5. TE 缓冲冲液（2250mml）：2.55ml 1 MM Trris-HCll，pHH8.00（100mM）；0.55ml 0.55M EEDTAA，pHH8.00（1mmM）；加H22O至2250mml。室室温保存存，五年年有效。【操作步骤骤】1. 在液氮中将将叶片研研磨粉碎碎，取11-4克

4、克样品于于合适的的离心管管中（初初始样品品为1克，用用13mml管；初始样样品11克，用50mml管）。2. 每1克样品品加入55ml CTAAB提取取缓冲液液和25-50uug RRNasse AA（可选选），颠倒混混匀，660-770水浴孵孵育400-500minn，期间间混匀22-3次次。3. 从水浴中取取出样品品，冷却却至室温温。可选：200-255，30000g离离心3mmin，转转移上清清液到新新管中。4. 每1克样品品加入55ml氯氯仿。颠颠倒混匀匀2-33minn。5. 20-255，103300gg离心88-100minn，转移移上清液液到新管管中。6. 加入等体积积氯仿，重

5、重复步骤骤4和55。可选：步骤骤4和55可重复复多次，直直到获得得澄清的的上清液液。7. 加入等体积积的无水水乙醇，轻轻缓颠倒倒混匀，直直到沉淀淀出现。8. 沉淀DNAA。方法1：钩钩出DNNA。（1） 用接种环钩钩出DNNA（可可选：110000g离心心1miin，富富集DNNA）。（2） 将DNA（可可将多个个样品的的DNAA合并成成一管）加入70%乙醇溶液中。初始样品为1ml，加入装有1-1.5ml 70%乙醇的1.5ml离心管；初始样品1ml，加入装有10-12ml 70%乙醇的50ml离心管。（3） 20-255，1130000rppm（11.5mml管）或或51000g（550ml

6、l管）离离心5-7miin，弃弃上清。可选：用上上述相同同体积的的70%乙醇重重复洗涤涤DNAA沉淀11次。可选：接步步骤（33），以以相同速速度离心心1-22minn，用吸吸头吸尽尽乙醇。方法2：离离心沉淀淀DNAA。（1）200-255，551000g离心心5-77minn，弃上上清。（2）加入入5-66ml（113mll管）或或10-12mml（550mll管）770%乙乙醇溶液液洗涤DDNA沉沉淀，220-225，551000g离心心5-77minn，弃上上清。可选：重复复步骤（22）1次次。可选：接步步骤（22），以以相同速速度离心心1-22minn，用吸吸头吸尽尽乙醇。9. 干燥D

7、NAA。真空空干燥10mmin，空空气干燥燥1hh（300minn左右），DDNA过过度干燥燥会导致致难以溶溶解。10. 每1ml样样品加入入1000-2550ull TEE缓冲液液溶解DDNA。也可适当增加TE缓冲液用量，或将DNA溶液置于70孵育1-4h，促进DNA溶解。相同样品可合并。可4过夜溶解。11. DNA溶解解完全后后，将溶溶液转入入1.55ml离离心管。测测定DNNA浓度度后，根根据需要要，将DDNA溶溶液分装装（每管管分装11个酶切切体系所所需DNNA量，110ugg/管），保存于4、-20或-80冰箱。DNA样品应有唯一性编号，并与原始样品相对应。12. 跑0.8%琼脂糖糖

8、凝胶电电泳检测测DNAA质量和和浓度，ND1000分光光度计测量DNA浓度。OD2300/ODD2600 00.4 0.5说明明有盐残残留OD2600/ODD2800 =11.71.99说明纯纯度很好好OD2600/ODD2800 2.00说明有有有RNNA污染染【注意事项项】1. 研磨前，研研钵、离离心管、药药勺等物物品均需需用液氮氮预冷彻彻底，研研磨过程程应保证证样品不不融化，研研磨应足足够细。2. 提取过程中中，应采采用颠倒倒混匀方方式，而而不能涡涡旋混匀匀，所有有过程保保证离心心管盖盖盖好，防防止液体体漏出。3. CTAB缓缓冲液裂裂解温度度一般为为65，孵育育结束后后，应彻彻底冷却却

9、至室温温，该步步骤可持持续1-2h。4. 加入氯仿后后，应彻彻底混匀匀2-33minn。5. 钩出DNAA时，动动作要轻轻缓，洗洗涤后要要除尽乙乙醇。6. TE缓冲液液适用于于基因组组DNAA、质粒粒DNAA长期保保存，dddH22O适用用于短期期保存。DDNA溶溶解后，轻轻缓晃动动离心管管，若溶溶液中有有气泡，表表明DNNA浓度度过高，需需再加入入适量TTE缓冲冲液。7. 测定DNAA溶液浓浓度前，应应用吸头头混匀溶溶液。8. ND10000分光光光度计计测量DDNA浓浓度，重重复两次次。若样样品DNNA浓度度为2-1000ng/ul，两两次重复复差值2nng/uul；若若样品DDNA浓浓度

10、1100nng/uul，两两次重复复差值2%。【参考电泳泳图片】完整度好时时电泳带带型：单单一无拖尾，点点样孔无无残留杂杂质如下下图：提取效果不不好如下下图：RNA残留蛋白残留拖尾降解二、植物叶叶片总RRNA的的大量提提取【实验原理理】植物细胞内内的RNNA主要要是 rrRNAA（占880885）、ttRNAA及小分分子RNNA（占占1015）和 mRNNA（占占155）。rrRNAA含量最最丰富，由由25SS、188S和55S几类类组成。mmRNAA种类繁繁多，分分子量从从数百至至数千碱碱基不等等，但绝绝大多数数mRNNA在33端都都有一个个pollyA尾尾巴，因因此，可可根据此此特性用用寡

11、聚脱脱氧胸苷苷(Olligoo-dT)层析柱柱从总RRNA中中将 mmRNAA分离出出来。一一般情况况下，提提取的总总RNAA也可用用于Noorthhernn bllot试试验。已已有多种种较为成成熟的分分离总RRNA的的方法，常常用的有有3种。（11）苯酚酚法：用用SDSS变性蛋蛋白并抑抑制RNNasee活性，经经多次酚酚/氯仿仿抽提除除去蛋白白、多糖糖、色素素等后，用用NaAAC和乙乙醇沉淀淀RNAA；（22）盐酸酸胍法：用异硫硫氰酸胍胍或盐酸酸胍和-巯基基乙醇变变性蛋白白，并抑抑制RNNasee的活性性，经酚酚氯仿抽抽提后再再沉淀；（3）氯氯化锂沉沉淀法：因为锂锂在在一一定pHH下能使使

12、RNAA相对特特异地沉沉淀，但但容易使使小分子子RNAA损失，而而且残留留的锂离离子对mmRNAA有抑制制作用。采采用Trrizool 试试剂盒提提取总RRNA，其其原理是是依据盐盐酸胍法法。Trrizool法适适用于动动物、植植物和微微生物组组织，样样品量从从几十毫毫克至几几克。用用Triizoll 法提提取的总总RNAA绝无蛋蛋白和DDNA 污染。RRNA可可直接用用于Noorthhernn分析，PPolyy（A）分分离，体体外翻译译，RNNasee封阻分分析和分分子克隆隆等。异硫氢酸胍胍：有效效地RNNAsee抑制剂剂。既可可破坏细细胞结构构使核酸酸从核蛋蛋白中解解离，又又对RNNA酶有

13、有强烈的的变性作作用。-巯基乙乙醇是抗抗氧化剂剂，有效效地防止止酚氧化化成醌，避避免褐变变，使酚酚容易去去除；NaAc，NNa+中和DDNA分分子上的的负电荷荷，减少少RNAA分子之之间的同同性电荷荷相斥力力，而易易于聚集集沉淀。酸酚使蛋白白质变性性，同时时抑制了了DNaase的的降解作作用。用用苯酚处处理匀浆浆液时,由于蛋蛋白与核核酸联结结键已断断,蛋白白分子表表面又含含有很多多极性基基团与苯苯酚相似似相溶。蛋蛋白分子子溶于酚酚相，而而核酸溶溶于水相相。使用酚的优优点：11.有效效变性蛋蛋白质；2抑制制了DNNasee的降解解作用。缺缺点：11.能溶溶解100-155%的水水，从而而溶解一一

14、部分ppolyy(A)RNAA。2.不能完完全抑制制RNaase的的活性。氯仿：克服服酚的缺缺点；加加速有机机相与液液相分层层。最后后用氯仿仿抽提：去除核核酸溶液液中的迹迹量酚（酚酚易溶于于氯仿中中）。【实验目的的】从植物叶片片组织中中提取高高质量RRNA。【主要试剂剂】1、4M GT溶溶液：4M GTT异硫氢氢酸胍（GGuannidiine thiiocyyanaate），25m MM 柠柠檬酸钠钠（Soodiuum ccitrratee），0.5%(w/vv) 十二二烷基肌肌氨酸钠钠(Saarcoosyll)，高压灭菌之之后，加加入巯基基乙醇到到0.11M（体体积比大大约为：1.00%）2

15、、2M NaAAC（pph值44.9-5.22）3、3M NaAAC4、4M LiCCL5、DEPPC HH2Ov/v 0.11%DEEPC处处理的dddH22O（377处理理12hh以上，处处理过程程要不断断搅拌，高高温高压压灭菌去去除残留留） 或TEE。【操作步骤骤】1. 植物组织11g，液液氮研磨磨；2. 倒入50mml离心心管中（管管中事先先放3mml的4M GT，冰冰浴），震震荡混匀匀；3. 加入0.33ml 2M 的的NaAAC，震震荡混匀匀；4. 加入3mll酸酚（水水饱和酚酚抗氧氧化剂00.1%(w/v)-羟基基喹啉-Hyydrooxyqquinnoliine），震震荡混匀匀；

16、5. 加入1mll氯仿，震震荡混匀匀，60000rrpm，113miin，取取上清；6. 加入2倍体体积的乙乙醇，-20度度过夜（几几小时也也可以，产产量可能能会低）；60000rppm，离离心100minn，弃上上清，留留沉淀；7. 加入1mll 4MM的LiiCL（放放1.55ml离离心管中中）；1130000rppm，110-115miin，留留沉淀；8. 加入0.44mlDDEPCC处理的的水，溶溶解；9. 加入1/22体积的的酸酚和和1/22的氯仿仿，震荡荡混匀；10. 130000rpmm，离心心5miin，取取上清液液；11. 加入1倍体体积的氯氯仿；1130000rppm，离离

17、心5mmin，取取上清液液；12. 加入0.11倍体积积的3MM NaaAC和和2倍体体积乙醇醇；震荡荡混匀，-20度度过夜；13. 130000rpmm，离心心5miin，留留沉淀；14. 沉淀RNAA晾干，DDEPCC水或TTE溶解解（400600ul）。注：RNAA溶解时时不要晾晾太干，会会导致难难以溶解解。【RNA甲甲醛电泳泳】1、试剂配配制5X甲醛凝凝胶电泳泳缓冲液液：0.1mool/LL MOOPS （pHH7.0）40mmool/LL 乙酸酸钠5mmoll/L EDTTA （ppH88.0）注：将200.6ggMOPPS溶于于8000ml经经用DEEPC处处理的550mmmol/

18、L乙酸酸钠溶液液（用DDEPCC处理）用用氢氧化化钠将溶溶液的pph值调调至7.0，加加入100ml经经用DEEPC处处理的00.5mmmoll/LEEDTAA（pHH8.0）再再加经用用DEPPC处理理的水至至溶液总总体积为为1L。高高压灭菌菌，室温温保存于于棕色瓶瓶子中（光光照或高高压灭菌菌后溶液液逐渐变变黄，淡淡黄色的的缓冲液液可正常常使用，而而深黄色色缓冲液液则不然然）。甲醛凝胶加加样缓冲冲液：50%甘油油1mmoll/L EDTTA（ppH88.0）0.25%溴酚蓝蓝0.25%二甲苯苯青FFF2、电泳方方法注： 所有有用于配配制与RRNA接接触的溶溶液的水水需预先先经DEEPC处处理

19、。凝胶制备RRNA甲甲醛变性性凝胶浓浓度通常常为11.55%。现现配制11.2%凝胶228mll：（1）称取取0.221g 琼脂糖糖，177.5mml DDEPCC水，微微波炉熔熔化；（2）冷却却至500600，加入入37%甲醛55.0mml，55X甲醛醛电泳缓缓冲液55.5mml，EEB 22ul（用用于转膜膜可以不不加），混混匀；（3） 倒胶，室温温放置330miin以上上，使胶胶彻底凝凝固；（4）RNNA变性性体系RNA 4.55ul5X 甲醛醛凝胶电电泳缓冲冲液 2.00ul甲醛 3.5ull甲酰胺 10.0ull混匀，65515分分钟，迅迅速冰浴浴5分钟钟，稍离离心。加加入甲醛醛凝胶

20、加加样缓冲冲液2uul。（5）电泳泳过程A. 先将将凝胶放放入1XX 甲醛醛凝胶电电泳液中中1000V预电电泳530分分钟；B. 点样样，1000V电电泳455600分钟；C. 照相相。D.纯度（OOD2660/OOD2880）：紫外分分光光度度计进行行测量（选选择正确确的稀释释倍数，确确保ODD2600 值在在0.111.0之间间，通常常离心柱柱法稀释释10倍倍左右； 溶液液裂解法法稀释440550倍）OD2600/ODD2800 1.992.1说明明有部分分降解；浓度：用NND10000分分光光度度计测量量，重复复两次。【注意事项项】1. 所有药品都都应用DDEPCC水来配配制。所所需要的

21、的离心管管、枪头头等都需需要用11%的DDEPCC水处理理过夜，然然后高压压灭菌。2. 做试验的非非塑料器器皿用具具需要1160-1800烘干44-8小小时。3. 做试验的桌桌面要用用1N/L的HHCl擦擦拭，后后再用770%乙乙醇擦拭拭晾干。4. 提取过程尽尽量带手手套和口口罩。5. DEPC水水的配置置：须在在通风厨厨里带手手套操作作。【参考电泳泳图片】Markeer（天天根 MMarkker IIII）：2200，5000，8000，112000，20000，330000，45500，红色箭头是28s片段，白色箭头是18s片段。如果提取的的RNAA完整度度好，28SS亮度应应该是118S

22、的的两倍以以上，这这两条带带清晰，带带的边缘缘可见。实验二细菌菌实验一、大肠杆杆菌细胞胞的活化化【实验步骤骤】1. 配制LB培培养基（液液体和固固体）高高温灭菌菌（1220灭菌220miin）。配配制实验验中所使使用的各各种抗生生素（00.222um抽抽滤灭菌菌），将将玻璃培培养皿或或可灭菌菌的塑料料培养皿皿高温灭灭菌（同同上）。2. 倒LB培养养基平板板。将所所用物品品放入超超净台中中超净工工作台灭灭菌（打打开紫外外灯，照照射155 miin，完完毕后打打开风机机吹5mmin）。融化已灭好菌的LB固体培养基，室温凉至5060，根据质粒及菌种的特性加入相应的抗生素（如：Amp、Kan、Spe、

23、Rif等），摇匀。倒入玻璃或可高温灭菌的塑料平板中。温度与速度都很重要，因为高温使抗生素失效，且培养基中琼脂含量较高，易凝固而无法使抗生素混匀，且不易全部倒出。3. 划线。使用用接种环环（或枪枪头）在在冻存管管中粘取取菌液，左左手将倒倒好的LLB平板板在酒精精灯火焰焰旁打开开，接种种环（或或枪头）在在平板表表面至少少作三次次“之”字字形划线线。每次次划线后后要烧接接种环（或或更换枪枪头），再再从上一一次划痕痕的尾部部拉出后后划下一一区。4. 将画好线的的平板于于37恒温培培养箱中中，倒置置培养过过夜（112hrr以上）。【主要试剂剂】1、LB（2250mmL）液体培养基基：固体培养养基（添添加

24、琼脂脂）NaCl2.55gNaCCl2.55g胰蛋白胨2.55g胰蛋白白胨2.55g酵母提取物物1.225g酵母提提取物11.255g琼脂4.00g120灭灭菌200minn。2、 Amp500（500mg/ml）称取5g氨氨苄青霉霉素，溶溶于1000mll水中。00.222um抽抽滤灭菌菌，分装于于离心管管中，-20保存。3、 Kan500（500mg/ml）称取5g卡卡纳霉素素，溶于于1000ml水水中。00.222um抽抽滤灭菌菌，分装于于离心管管中，-20保存。4、 Rif500（500mg/ml）称取5g利利福平，溶溶于1000mll水中。00.222um抽抽滤灭菌菌，分装于于离心管

25、管中，-20保存。5、 Spe500（500mg/ml）称取5g壮壮观霉素素，溶于于1000ml水水中。00.222um抽抽滤灭菌菌，分装于于离心管管中，-20保存。二、大肠杆杆菌感受受态细胞胞的制备备【实验步骤骤】1. 挑取一个单单菌落接接种于55mL LB液液体培养养基中，37/200rpm 培养过夜。2. 取500uul过夜夜培养的的菌液加加入500mlLLB培养养基（按按照1:1000的比例例），337/2000rpmm培养33-4hhr,经经分光光光度计测测量，OOD值在在0.330.4之间间。3. 将菌液倒入入50mmL离心心管中，冰冰浴100minn（同时时冰浴CCaCll2溶液

26、）。4. 4，40000rrpm离离心100minn，回收收细胞，弃弃上清（倒倒去液体体）。将将离心管管倒置于于滤纸上上1miin。每每管用冰冰冷的00.1MM CaaCl22 溶液液10mmL悬浮浮沉淀，冰冰浴300minn。5. 4，40000rrpm 离心110miin，回回收细胞胞，弃上上清。用用冰冷的的0.11M CCaCll2（含甘甘油）溶溶液1mmL悬浮浮细胞。分分装细胞胞，每1100L一份份倒入11.5mmL离心心管中，此细胞即为感受态细胞，可直接转化或-70保存。【主要试剂剂】1、0.11M CCaCll2称取1.22g CCaCll2溶解于于80mml蒸馏馏水中，加加蒸馏水

27、水定容至至1000ml，高高温灭菌菌。2、0.11M CCaCll2（含甘甘油）称取1.22g CCaCll2溶解于于80mml蒸馏馏水中，再再添加115mll甘油，最最后加蒸蒸馏水定定容至1100mml，高高温灭菌菌。三、质粒DDNA转转化大肠肠杆菌【实验步骤骤】1. 从-70冰箱中中取出一一管感受受态细胞胞，加入入1220ull质粒（或或连接产产物），冰冰浴300minn。质粒粒一般11ul足足以，连连接产物物为510uul，最最都不要要超过220ull否则反反而影响响转化效效果。2. 42热击击90ss（注：应在冰冰浴时先先打开水水浴锅，使使温度升升到422）。立即即将离心心管转移移至冰

28、浴浴2miin，该该过程尽尽量不要要摇动离离心管。3. 加500L LLB液体体培养基基，377，1180rrpm 培养660miin。4. 根据质粒抗抗性情况况，吸取取502000ul菌菌液涂布布于添加加了对应应抗生素素的平板板上。如如果浓度度不是很很高时，可可以先440000rpmm离心收收集菌体体再涂到到平板上上。（注注：涂菌菌器沾酒酒精反复复烧三次次，以消消毒灭菌菌）5. 37倒置置过夜。四、菌落PPCR检检测【实验步骤骤】1. 按如下表所所示向离离心管中中添加药药品：25uL的的反应体体系2x PCCR mmix12.5ull上游引物1ull下游引物1ullddH2OO10.5ull

29、10x bbufffer2.55uLdNTP2uLL上游引物11ul下游引物11ulTagE00.255 uLLddH2OO19.75uul2. 挑取半个单单菌落，加加入到25uuL的反反应体系系中，做做PCRR检测，并并做标记记。3. 反应条件设设置为：94预变性性10mmin，94变性60s，55退火30s，74延伸2min，共30循环，最后72延伸10min。4. 扩增产物于于含荧光光染料的的1%琼脂脂糖凝胶胶电泳。五、电泳【实验步骤骤】1. 配制TBEE电泳缓缓冲液00.5xx TBBE（110x TBEE 缓冲冲液 550mLL 加水水至1LL）；2. 称取0.22g琼脂脂糖于220

30、mLL 0.5x TBEE中，加加热混匀匀，配成成1%琼琼脂糖凝凝胶；3. 粘胶带，插插梳子；4. 凝胶冷却至至60，加0.2uLL荧光染染料，摇摇匀后倒倒入电泳泳槽。220分钟钟左右可可凝固。双手均衡衡用力取取下梳子子，动作作要慢；5. 将0.5xx TBBE 倒倒入电泳泳槽中，约约超过胶面1cmm（开始可略少，以以便于点点样）；6. 取一块封口口膜，将将溴酚蓝蓝点于其其上，取取5uLL待点样品品同溴酚酚蓝混匀匀。7. 逐个点样，两两边分别别点Maarkeer。8. 连接电源。正正极（+）接远远离点样样孔一端端，负极极（-）接接近点样孔孔一端；9. 待溴酚蓝跑跑至凝胶胶2/33处，关闭闭电源

31、，紫紫外观察察，照相保保存。【主要试剂剂】110xxTBEE 电泳泳缓冲液液0.455moll/L Triis碱，0.445mool/LL 硼酸酸，20mmL 00.5mmol/L EEDTAA（PHH8.00），加水定定容至1100mmL 26x上上样缓冲冲液0.255%溴酚酚蓝，0.225%二二甲苯青青FF，15%聚蔗糖糖水溶液液，室温温保存。六、质粒DDNA提提取（碱碱裂解法法小量）【实验步骤骤】1. 挑取一个含含重组质质粒的单单菌落接接种于55mL 含对应应抗生素素的LBB液体培培养基的的大试管管中，337，1180rrpm震震荡培养养过夜。也可将菌种按照1:100的比例进行接种。2.

32、 将14mmL菌液液移入离离心管中中，40000rrpm离离心2mmin。吸吸去培养养液，使使细胞沉沉淀尽可可能干燥燥。（离离心2次次，弃上上清，倒倒置于滤滤纸上）3. 将细胞沉淀淀悬浮于于1000L溶溶液I（冰冰预冷）中中，充分分混匀，室室温放置置10mmin。（上下颠倒混匀，可稍用力轻弹，此时配溶液II，并冰浴溶液III）4. 加200L溶液液II（新新鲜配制制），盖盖紧管口口，混匀匀内容物物，冰上上放置至至澄清，该该过程不不能超过过5miin。（溶溶液III需要新新鲜配制制，两种种溶液使使用前预预混。该该过程动动作务必必轻柔。）5. 加入1500L冰冰冷的溶溶液IIII，盖盖紧管口口，此

33、时时出现白白色絮状状，颠倒倒数次使使混匀，冰冰上放置置3miin55minn。6. 4/1220000rpmm 离心心5miin，取取上清移移至另一一离心管管中。7. 向上清中加加入等体体积酚/氯仿/异戊醇醇（255：244：1），颠颠倒混匀匀，4/1220000rpmm 离心心5miin，吸吸取上清清移至另另一离心心管中。8. 向上清中加加入2倍倍体积无无水乙醇醇和1/10体体积的33M NNaAcc（pHH 5.2），混混匀后，冰冰浴100分钟，4/12000rpm 离心5min，弃上清，倒置离心管于滤纸上。（上清和乙醇总体积的1/10为NaAc体积）9. 用1mL 70%乙醇洗洗涤质粒粒

34、沉淀（在在沉淀的的另一侧侧加乙醇醇，不要要将沉淀淀冲起来来），振振荡并离离心，倒倒去上清清液。10. 待酒精挥发发干净后后，加220LL TEE缓冲液液，其中中含有220gg/mLL的胰RRNA酶酶，放在在37水浴中中保温11h，使使DNAA完全溶溶解，-20保存。【主要试剂剂】1. 11M TTrissCll缓冲液液（1LL）pHH 8.0称取1211.1gg Trris溶溶于8000mLL水中，搅搅拌条件件下加入入浓盐酸酸（pHH 7.4约使使用浓HHCl 70mmL；ppH 77.6约约使用660mLL，pHH 8.0约使使用422mL），溶液冷却至室温，用盐酸准确调pH值至8.0，加入

35、重蒸水至总体积1L，分装，高压灭菌。TrisCl溶液的pH值随温度变化而变化，温度每升高1，pH值约降低0.03单位，配置及使用时需注意。2. 00.5MM EDDTA缓缓冲液（1L）pH 8.0称取EDTTA-NNa22HH2O 1186.1g，加加入8000mLL重蒸水水，磁力力搅拌器器搅拌，加加入NaaOH调调至pHH 8.0，用用重蒸水水定容至至1L。（注：只有在pH值接近8.0时，EDTA- Na22H2O才能完全溶解。调pH值时可以用固体NaOH，大约使用20g左右，也可以用10mol/L的NaOH溶液，大约使用70mL，待EDTA- Na22H2O完全溶解后再用稀NaOH准确调至

36、8.0。）3. II号液（1100mmL）葡萄糖0.98gg 、22.5mmL 11M TTrissCll、2mmL 00.5MM EDDTA 2.00，加dddH22O定容容至1000mLL。4. III号液液（不灭灭菌）0.4M NaOOH（1100mmL）和和2%SSDS等等体积混混合，新新鲜配制制。A、0.44M NNaOHH（1000mLL）：称称取1.6g NaOOH，ddH2O定容容至1000mLL。B、2%SSDS（550mLL）：称称取2gg SDDS，ddH2O定容容至1000mLL。5. IIII号号液（1100mmL，ppH 44.8）先配1000mL KAcc（499

37、.077g KKAc定定容至1100mmL）取取60mmL，冰冰乙酸111.55mL（ppH 44.8），用用dH22O定容容至1000mLL。6. 110mgg/mLL 溶菌菌酶0.01gg溶菌酶酶 + 1mLL无菌水水 + 10L 11M TTrissCll7. TTE（1100mmL）1M TrrisCl 1mLL + 0.55M EEDTAA 0.2mLL，加dHH2O定容容至1000mLL。8. 33M NNaAcc（1000mLL）pHH 5.2或ppH 77.0称取40.8g NaAAc33H2O溶于于80mmL ddH2O中，用用稀乙酸酸调pHH至5.2（77.0），定定容10

38、00mll，高压压灭菌。9. 110mgg/mLL 溶菌菌酶0.01gg溶菌酶酶 + 1mLL无菌水水 + 10L TTrissCll10. 胰RNNA酶（220gg/mLL）2L胰RRNA酶酶原液 + 11mL TE，分分装七、 质粒粒的酶切切鉴定【实验步骤骤】1. 按如下表所所示向离离心管中中添加药药品：10uL的的反应体体系20uL的的反应体体系10x bbufffer1uLL限制性内切切酶0.55uLDNA00.5uuLddH2OO8ull10x bbufffer2uLL限制性内切切酶1uLLDNA11uLddH2OO16uul2. 37（或或其他酶酶的最适适温度）孵孵育1-4小时时。

39、3. 电泳检测酶酶切结果果。实验三 植物物组织培培养相关关操作【相关名词词】1、外植体体：在组组织培养养中培养养对象的的起始材材料。2、培养基基：在组组织培养养中用于于给植物物提供营营养、固固定植株株的材料料和试剂剂。3、无菌操操作：在在整个操操作的进进行过程程中，材材料所处处的环境境、所使使用的试试剂、器器皿、器器具都是是无菌的的，这样样的操作作过程称称为无菌菌操作。4、接种：把培养养材料放放到培养养基中或或插到培养养基上的的操作。5、继代培培养：把把培养材材料接种种到新的的培养基基上继续续培养。6、表面消消毒：用用消毒液液把植物物材料表表面的微微生物杀杀死，防防止组织织培养中中污染的的过程

40、。【植物材料料】1、 紫花苜蓿无无菌苗。2、 烟草无菌苗苗。3、 温室栽培的的紫薯。【仪器、器器具、器器皿及其其他】1、 仪器：电子子秤、ppH计、磁磁力搅拌拌器（带带搅拌子子）、高高压蒸汽汽灭菌锅锅、干热热灭菌器器、超净净工作台台。2、 器具：移液液器（吸吸头）、镊镊子、手手术剪、手手术刀（刀刀柄、刀刀片）。3、 器皿：量筒筒、塑料料培养皿皿、塑料料培养瓶瓶、三角角烧瓶、玻玻璃培养养皿、称称量皿。4、 其他：封口口膜、酒酒精棉、滤滤纸等。【试剂配制制】1、 培养基MSO培养养基：称取4.774g MS培培养基粉粉末和30gg 蔗糖糖，加入装装有9000mll 蒸馏馏水的11L三角角烧瓶中中，

41、加入入搅拌子子，在磁磁力搅拌拌器上搅搅拌。待待其溶解解后，定定容到11L，并并用1NN NaaOH和和1N HCll将pHH值调到到5.88。调好好pH值值后，加加入8gg 琼脂脂粉，用用封口膜膜封号瓶瓶口，等等待灭菌菌。MB培养基基：称取4.774g MS培培养基粉粉末和30gg 蔗糖糖，加入装装有9000mll 蒸馏馏水的11L三角角烧瓶中中，加入入搅拌子子，在磁磁力搅拌拌器上搅搅拌。待待其溶解解后，加加入1mml BB5有机机母液、NNAA、66-BAA并定容容到1LL，并用用1N NaOOH和11N HHCl将将pH值值调到55.8。调调好pHH值后，加加入8gg 琼脂脂粉，用用封口膜

42、膜封号瓶瓶口，等等待灭菌菌。2、 消毒液70%酒精精：用量筒量取取7000ml 95%医用酒酒精，加加入2000mll 蒸馏馏水，混混合均匀匀即成。0.1% HgCCl2：称取1g HgCCl2，在三三角烧瓶瓶内溶于于1L 蒸蒸馏水中中，用封封口膜封封号瓶口口，等待待灭菌。无菌水：装1L蒸馏馏水于三三角烧瓶瓶中，用用封口膜膜封号瓶瓶口，等等待灭菌菌。【操作步骤骤】（一） 培养基准备备1、 培养基灭菌菌 把高压蒸汽汽灭菌锅锅电源接接通，确确认锅内内的水处处于高水水位；把把培养基基以及所所有需要要灭菌的的试剂放放入锅内内，盖上上锅盖，设设定灭菌菌时间（220miin）、温温度（1121），打打开气

43、阀阀，开始始灭菌。待待锅内温温度升到到1022以上，将将气阀关关闭，继继续灭菌菌。灭菌菌时间到到后，小小心打开开气阀，缓缓慢放气气。待锅锅内热气气排尽后后，打开开锅盖，把把物品移移到超净净工作台台中。2、 超净工作台台消毒把超净工作作台内的的干热灭灭菌器电电源打开开（如果果不用，则则不用打打开），把把培养瓶瓶/皿（或或培养基基）放入入超净台台内，打打开超净净台紫外外灯，消消毒200300minn。之后后关掉紫紫外灯，打打开风机机和照明明灯备用用。注意：以下下的操作作（除紫紫薯藤条条的冲洗洗外）均均为无菌菌操作，在在超净工工作台内内操作前前，应先先用酒精精棉把手手擦净，进进行表面面消毒后后方可进

44、进行。3、 培养基分装装待培养基冷冷却到550660左右，把把培养基基均匀地地分装到到培养瓶瓶或者培培养皿中中，并在在瓶、皿皿上做好好标记。每每升培养养基可以以倒200瓶/皿皿。（二） 紫花苜蓿的的继代培培养把干热灭菌菌器中的的手术剪剪和镊子子取出，晾晾凉备用用；用少少量无菌菌水玻璃璃培养皿皿的滤纸纸湿润备备用。把把装有紫紫花苜蓿蓿无菌苗苗的培养养瓶的外外部用酒酒精棉擦擦净，打打开盖子子，用剪剪刀把紫紫花苜蓿蓿齐根部部剪断，用用镊子取取出，放放到润湿湿的滤纸纸上。用用剪刀剪剪去叶子子，并把把去掉叶叶子后的的茎剪成成段，每每段留一一个腋芽芽；用镊镊子把茎茎段接到到塑料培培养瓶内内的MSSO培养养

45、基上（生生理下端端插入培培养基内内），盖盖上瓶盖盖。每瓶瓶接种446段段。新接接种的瓶瓶子做好好标记，放放到光照照培养室室中培养养。（三） 烟草叶片的的再生诱诱导把干热灭菌菌器中的的手术剪剪、镊子子和手术术刀取出出，晾凉凉备用；用少量量无菌水水玻璃培培养皿的的滤纸湿湿润备用用。把装装有烟草草无菌苗苗的培养养瓶的外外部用酒酒精棉擦擦净，打打开盖子子，选长长势好、比比较嫩的的叶片用用剪刀从从叶柄剪剪下，用用镊子取取出背面面朝上放放在润湿湿的滤纸纸上。用用镊子固固定住叶叶片，用用手术刀刀小心把把主叶脉脉去除。去去除主叶叶脉的叶叶片，用用手术刀刀切成33mm3mmm的小片片，背面面朝下，放放在培养养皿内的的MB培培养基上上，用封封口膜封封住培养养皿，做做好标记记。放到到光照培培养室中中培养。（四） 紫薯藤条的的表面消消毒和接接种、培培养把干热灭菌菌器中的的手术剪剪和镊子子取出，晾晾凉备用用；用少少量无菌菌水玻璃璃培养皿皿的滤纸纸湿润备备用。1. 紫薯藤条的的表面消消毒：将将温室中中剪下的的紫薯藤藤条用自自来水洗洗净，并并用吸水水纸吸干干（超净净工作台台外操作作）。洗洗净的紫