猪增生性与坏死性肺炎病例中猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒2型和猪流感病毒的检出率.doc

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1、猪增生性与坏死性肺炎病例中猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒2型和猪流感病毒的检出率养猪SWINEPRODUCTION(6)20o6猪增生性与坏死性肺炎病例中猪繁殖与呼吸综合征,猪圆环病毒2型和猪流感病毒的检出率中图分类号:$858.285.3文献标识码:A文章编号:10021957(2006)06002803摘要:本文对60份来自猪增生性与坏死性肺炎(PNP)病例的肺组织进行了回忆性研究.以检测肺组织中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),猪流感病毒(SIV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的感染率.在被诊断PNP病例中有30例来自于19881992年,另30例来自于19972001年.在每组的30

2、例中,有10例来自哺乳仔猪,其它20例那么为保育猪或育肥猪.利用A型流感病毒的单克隆抗体进行免疫组化检测SIV,用原位杂交(ISH)检测PRRSV和PCV2的核酸.在被检的60例中,检出PRRSV55例(92%),PCV225例(42%).SIV仅1例(2%).而在有PNP病灶的病例中.PRRSV单独感染占30例(50%),PRRSV和PCV2混合感染占25例(42%).在哺乳仔猪PNP病例中未检出PCV2,所有的PCV2阳性猪均出现在断奶后猪只中,且常和PRRSV混合感染.在断奶后病例中.PCV2检出率为63%(25/40).本研究结果说明,在PNP病例中SIV很少被检出,且PCV2感染也不

3、是造成PNP病灶的关键,PRRSV常常且主要与PNP有关.被认为是PNP的主要病原.关键词:猪圆环病毒2型;猪繁殖与呼吸综合征;猪增生性与坏死性肺炎;猪流感20世纪80年代后期,在加拿大的魁北克出现了一种不明病原的新型猪肺炎.称之为增生性与坏死性肺炎(PNP).其病变特征为肺不萎陷.呈灰红色,黄褐色或有斑点,病灶质度呈橡皮状.组织学变化是淋巴组织细胞增生性间质性肺炎.肺炎细胞显着增生,有许多坏死细胞的凝集块.在一些病例中还可见到透明膜,肺泡内淋巴浆细胞渗出和细支气管坏死.PNP和猪的一种新病当时称为猪神秘病,现已证实该病为猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)共同出现,后者由PRRSV引起,为RNA病

4、毒,最初从荷兰别离到,归属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属.PNP病变最初认为是由A型猪流感病毒的新毒株H3N2和H1N1引起.随后,在未有SIV的PNP肺中PRRSV不断被别离出来.用这些PRRSV别离株接种实验动物.能引起与自然PNP病例相似的肺脏病变.但较轻微.通过免疫组化对19881993年间的PNP病例研究证实,PRRSV与PNP病变密切相关.而SIV那么不然.感染PRRSV的临床病例,其肺脏病变多样,从较轻微的非特异性,多灶性间质性和增生性肺炎到严重的典型的PNP组织学病变均可见到.PRRSV分离株间的致病性不同已有报道.从而解释了所观察到的该病在严重程度上存在差异的原因.最近.有人认为

5、PNP可能是PRRSV和PCV2共同感染的结果.PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的原发性病原.最近的一项研究说明.在所有检测的PNP中,利用PCR技术都扩增出了PRRSV核酸,而仅有1/3的病例扩增出PCV2核酸.本试验的目的就是从保存的患PNP猪肺组织中,检测PRRSV,PCV2和SIV的感染率.1材料与方法1.1病例的选择在本项研究中共选择60个PNP病例.根据肺特异性病变,动物的年龄,采集病料的年份以及各项检测所需要肺组织的量,确保选够各组织样品,而且挑选了各个阶段一定数量的猪.其中19881992年间诊断的30例.19972001年间诊断的30例.每组30个病例中.有10

6、例来自于哺乳仔猪,而其它20例来自于保育猪或育肥猪.对每份福尔马林固定,石蜡包埋的肺组织,至少制备4份5m厚的切片.一片进行组织化学检测,一片进行PRRSV原位杂交.一片进行PCV2原位杂交,最后一片用于SIV的免疫组化.1.2组织病理学所选病例都重新进行了组织学检查,以证明有无支气管/细支气管坏死.原位杂交:用来自PRRSVLHVA一933毒株的1段245bpPCR产物作ISH来检测PRRSV核酸.从PCV2LHVA-V53毒株的开放阅读框(ORr2)进行PCR扩增出1段263bpDNA片段来检测PCV2核酸.为了用作探针和制备商品化试剂盒,对PCR产物进行纯化,以地高辛标记的dUTP通过随

7、机引导法对其进行标记.ISH操作方法简言之是将组织切片在65cC加热20min,脱蜡,重新水化,浸于0.2mol/LHCI中20min.洗后,用蛋白酶K(25g/mL)37cC作用15min.再洗,在2006第6期乔宏兴译.猪增生性与坏死性肺炎病例中PRRS,PCV2和SI病毒的检出率29杂交液(50%甲酰胺,2柠檬酸钠,1xDenhardts液.1mmol/LEDTA和100g/mL变性的鲱鱼精子DNA)和变性的标记探针溶液中进行杂交.标记的PCV2探针1:30稀释,42水浴过夜.经过严格冲洗,利用1:400稀释的碱性磷酸酶抗地高辛抗体液在37进行PCV2探针的检测,2h后,在氮蓝四唑盐和5

8、一溴一4一氯一3一吲哚甘油磷酸盐中孵育并用苏木精复染.利用商品试剂盒对PRRSV进行地高辛标记的探针检测和信号放大.该试剂盒可用于放大信号,允许使用1:100稀释的探针.试验研究的器官组织,即来自于非感染和感染PRRSV和PCV2的猪,分别作为阴性和阳性对照.l_3免疫组化运用针对A型流感病毒的核酸蛋白单抗和亲和素一生物素复合法对SIV进行免疫过氧化物酶测定.简而言之,将肺组织切片经脱蜡,水化,在37磷酸盐缓冲液(PBS)中用0.05%蛋白酶消化l5min.随后,在3%过氧化物中用内源过氧化物酶阻断5min,洗后,用5%健康马血清封闭30min.然后用PBS1:l000稀释的鼠抗A型流感病毒单

9、克隆抗体作为一抗参加肺切片中,4水浴孵育16h.经2次冲洗,载玻片用1:200稀释的生物素化马抗鼠抗体作用30min.载玻片用PBS冲洗2次,用过氧化物酶结合的抗生物素蛋白作用30min,再用PBS洗2次,用3一氨基一9一乙基咔唑孵育25min,载玻片用Mayers苏木精复染.对照包括已经过检测的1个SIV阴性猪和2个SIV阳性猪的肺脏.2结果被研究的猪包括321日龄的哺乳仔猪和6l4周龄的保育猪和育肥猪.从组织学上看,严重的PNP主要有以下两点:1)在肺泡腔和肺泡管中有大量含嗜酸性及颗粒碎片的坏死细胞凝结块出现;2)病变明显的PNP伴有不同程度的淋巴组织细胞间质性炎症.在本研究的病例中.支气

10、管和细支气管上皮有严重损伤的占10%(6/60).且均为保育猪和育肥猪.在研究的病例中.检出PRRSV55例(92%).PCV225例(42%).SIV仅1例(2%).仅感染PRRSV的占30例(50%).而PRRSV和PCV2混合感染的占25例(42%).详见表1.根据所研究病例的年份,猪的年龄在有PNP的猪肺中PRRSV和PCV2检出率见表2.数据说明.有PNP的哺乳仔猪未检出PCV2.所有的PCV2阳性猪均为断奶猪,并且总是和PRRSV混合感染.在断奶猪组中,PCV2检出率为63%(25/40).在病毒检出率方面,选择的2个时间段的研究结果相似表160例有PNP病变患猪肺中各种病毒的检出

11、率表2根据研究对象的年份和年龄组.6O例PNP猪肺中PRRSV和PCV2检出率%通过ISH证明含PRRSV的肺脏中,在肺泡间隔和肺泡腔中可观察到巨噬细胞的细胞浆中有标记物,同时,在肺泡内的碎片中偶尔也可看到.在肺组织中PRRSV阳性细胞大多呈灶性或多灶性分布在每个病例中,标记细胞的数量变化较大,且在同一病例中肺的不同区域也有变化.但其阳性细胞数一般是从少量到中等量.利用ISH检测有PCV2的肺脏中,标记细胞变化从轻到重不等.PCV2核酸最常见于肺泡间隔碎片中和巨噬细胞(主要是细胞浆)以及肺泡间隔和支气管/细支气管壁的单核细胞中,偶尔也见于血液单核细胞,即从组织学上观察到的6个细支气管坏死病例中

12、,5个为PCV2阳性(另外1个是SIV阳性).在肺脏中.PCV2阳性细胞一般比PRRSV阳性细胞分布更广泛.而且,在2种病毒均有感染的肺脏中,PRRSV阳性细胞和PCV2阳性细胞分布也不相同.3讨论自几年前首次发现猪PNP以来.导致该病发生如此严重肺炎的因素目前还未完全清楚.在本研究中.利用ISH检测.PRRSV是PNP病猪肺中最常见的病毒,检出率为92%.其它研究利用不同的检测技术如免疫组化,PCR或病毒别离也证明PRRSV和PNP密切相关.而SIV在60例中仅检测到1例.说明SIV与PNP不相关.这与先前的研究结果相一致.在本项研究中.用ISH方法检测PCV2.检出率为42%.这一检测结果

13、与最近报道的PNP病例的检测结果和632例不分肺炎类型的猪呼吸疾病综合征PCV2的检出率相近.在我们的研究中.PCV2仅在患有PNP的断奶猪中被检测到.而哺乳仔猪中未检测到,这与猪初生后几周才自然感染本病毒的说法养猪SWINEPRODUCTION(6)2005年江西省猪病诊断情况总结及分析刘文峰,邓舜洲,李裕,戴益民,陈松昌27王建敏,万文忠z(1.江西农业大学动物科学技术学院,江西南昌330045;2.江西南昌金牧动物保健效劳,江西南昌330013)中图分类号:$858.28文献标识码:A文章编号:10021957(2006)060030032005年.南昌金牧动物保健效劳兽医诊断实验室对江

14、西省30多个市县送检的653例病料及3894份血清进行检测.还深入局部猪场进行流行病学跟踪调查,及时调整措施,根据诊断结果,并按照我们提出的疾病防治措施.大局部猪场均取得良好的效果.2005年的检测结果说明.一些困扰猪场的老病仍然存在.个别疾病危害较大.同时近年来在江西省出现的免疫抑制性疾病的危害进一步加大.新生仔猪成活率低,断奶仔猪呼吸道疾病,仔猪严重拉稀,母猪的繁殖障碍性疾病仍是危害规模化猪场最突出的问题.现将检测情况报告如下,以供业界参考.收稿日期:2006一ll一1O作者简介:刘文峰(1982一),男,江西永丰人,在读硕士研究生,研究方向为动物传染病学,通讯作者:邓舜洲(1968一),

15、男,江西崇义人,博士,副教授,主要从事动物传染病学研究,1抗体水平检测情况针对不同的检测目的,对送检的血清样品,采用酶联免疫吸附试验(ELISA),间接血凝试验(IHA),乳胶凝集试验(LAT)等多种方法进行了抗体效价检测,具体情况见表l.表12005年江西省主要疾病抗体水平检测情况注:乙型脑炎,细小病毒病,衣原体病检测的都是种猪;衣原体病抗体合格数为阳性数,合格率为阳性率.从表l可以看出.尽管大多数猪场注射了疫苗,但几种常见疾病的疫苗免疫合格率均不高,同一个猪场的不同猪只的抗体水平离散度较大.分析其原因可能有以下几点:(1)仍然有局部猪场,尤其是规模较小的猪场.对常见疾病的危害认识不够,不注

16、射相一致.在断奶猪PNP中,PCV2经常与PRRSV混合感染,其检出率为62.5%.德国研究者最近报道,在猪PNP中两者混合感染率为85.4%.不过,他们未提及所研究动物的年龄.在断奶猪PNP病例中PCV2的高检出率反映出作为一种独立的疾病,育肥猪PCV2的感染率非常高.在本项研究中.一些被检肺脏中PCV2核酸含量如此高.以致于很难相信该病毒对肺器官的影响,即在导致这种肺炎发生中的作用.在一些病例中所发现的支气管和细支气管的损伤似乎与支气管/细支气管上皮细胞中PCV2核酸的存在有关.最近研究说明,PRRSV和PCV2混合感染引起的肺炎比其中任一种病毒单独感染引起的肺炎都严重.本研究的数据说明.

17、虽然PCV2感染具有加重这种肺炎的潜在可能,但不是根本原因,因为在所有新生仔猪和大约1/3断奶猪的PNP病例中,PCV2呈阴性.本研究结果与其它几个实验室的研究结果及流行病学数据都证明PRRSV是PNP的主要病原.但是.引起这种严重肺炎反响的各种因素仍需进一步研究.已有报道证明,PRRSV别离株的致病性具有显着差异.有些有时可造成80%的肺脏出现严重病变.感染剂量,宿主的敏感性及环境等无疑也是影响肺炎严重程度的因子.在本研究中,从组织学上所观察到的肺炎程度远远超出了利用PCR所能检测到PRRSV的程度.同样,PRRSV感染实验动物后.在肺中病毒分布呈局灶性.而在典型的PRRSV感染造成的间质性

18、肺炎的大局部区域中却常常检测不到病毒.这项发现说明,肺炎并不是全由PRRSV的直接致细胞病变作用所引起.而且炎性反应与PRRSV损伤或感染巨噬细胞中的酶和细胞因子的持续释放有关.但这些机制仍需进一步的证实.本研究工作证实.PCV2的混合感染不是PNP的决定性因素.而PRRSV与PNP密切相关.应当被认为是PNP的主要病原.(原文:DetectionRateofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus,PorcineCircovirusType2,andSwineInfluenzaVirusinPorcineProlifer-ativeandNecrotizingPneumonia.DroletR,LarochelleR,MorinM,eta1.VetPathol,2003,40:143-148.乔宏兴译.王川庆校)