WS∕T 617-2018 天门冬氨酸氨基转移酶催化活性浓度参考测量程序 (卫生).pdf

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1、中华人民共和国国家卫生健康委员会 发 布 CS 11.020 C 50 WS 中 华 人 民 共 和 国 卫 生 行 业 标 准 WS/T 6172018 天门冬氨酸氨基转移酶催化活性浓度参考测量程序 Reference procedure for the measurement of catalytic activity concentration of aspartate aminotransferase 2018-08-20 发布 2019-03-01 实施 WS/T 6172018 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 缩略语.3 5 测

2、量原理和方法.3 6 测量前试剂准备.4 7 测量前仪器准备.8 8 测量前采样和样品准备.11 9 测量过程.12 10 测量结果处理.15 11 结果报告.18 12 分析可靠性.18 13 质量保证.19 附录 A（资料性附录）试剂详细信息表.21 附录 B（资料性附录）测定酶储存溶液中 LD 催化活性浓度.23 附录 C（资料性附录）测定酶储存溶液中 MD 催化活性浓度.26 附录 D（资料性附录）不同温度下溶液的 pH 值.29 附录 E（资料性附录）AST IFCC 37参考测量程序与 30参考测量程序的比较.31 参考文献.33 WS/T 6172018 II 前 言 本标准按照

3、GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准起草单位：中国医学科学院北京协和医院、南通大学附属医院、北京医院。本标准主要起草人：齐志宏、王惠民、赵芳、邸茜、宋耀虹、马嵘。WS/T 6172018 1 天门冬氨酸氨基转移酶催化活性浓度参考测量程序 1 范围 本标准规定了在临床医学应用中，测量天门冬氨酸氨基转移酶催化活性浓度的参考测量程序。本标准主要适用于参考实验室，作为天门冬氨酸氨基转移酶催化活性浓度测量的溯源，也可作为与酶催化活性浓度检验有关的仪器和试剂生产企业的溯源，可供有关认可监督管理单位及质量管理部门应用。此参考测量程序可用于我国临床常规方法测量结果的溯源。2 规范性引用文件 下列文件

4、对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ISO 15193 体外诊断器具-生物源样本中量的测量-参考测量程序的表述 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 实验室样品 laboratory sample 准备送到实验室或实验室接收的用于测定的原始样品或原始样品的分样品。3.2 分析样品 analytical sample 自实验室样本制备的、可从中取出分析部分的样品。注：在取出分析部分之前，分析样品可经过各种处理。3.3 分析部分 analytical portion 从分析

5、样品中取出的用于实际测量和观察的物质部分。注：如果不需预处理，分析部分直接从原始样品或实验室样品中取出。某些情况下，需将分析部分溶解成分析溶液再上机测定。3.4 WS/T 6172018 2 分析溶液 analytical solution 将分析部分溶解在气体、液体或固体中而制备的溶液，溶解过程中可以有反应发生或无反应发生。3.5 (某一物质系统的)基质 matrix(of a material system)一个物质系统中除被分析物之外的所有成分。3.6 参考测量程序 reference measurement procedure 参考程序 reference procedure 在校准或

6、参考物质定值时，为提供测量结果所采用的测量程序，它用于评价由同类量的其他测量程序获得的被测量的量值的测量正确度。3.7 测量系统的灵敏度 sensitivity of a measuring system 灵敏度 sensitivity 测量系统的示值变化除以相应的被测定值变化所得的商。注1：测量系统的灵敏度可能与被测量的量值有关。注2：所考虑的被测量值的变化必须大于测量系统的分辨力。3.8 分析特异性 analytical specificity 测量程序只测量可测量的量的能力。3.9 分析干扰 analytical interference 由一个影响量引起的系统测量误差，该影响量自身在测

7、量系统中不产生信号，但它会引起示值的增高或降低。3.10 影响量 influence quantity 被测量以外的可影响测量结果的量。3.11 检出限 detection limit；limit of detection WS/T 6172018 3 由给定测量程序获得的测得值，其声称的物质成分不存在的误判概率为，声称物质成分存在的误判概率为。注 1：国际理论和应用化学联合会（IUPAC）推荐和的默认值为 0.05。注 2：有时使用缩写词 LOD。注 3：不要用术语“灵敏度”表示“检出限”。3.12 校准品 calibrator 用于校准的测量标准。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。AST

8、：天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate Aminotransferase）GUM：测量不确定度表达指南（Guide to the expression of Uncertainty in Measurement）IFCC：国际临床化学与检验医学联合会（International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine）LD：乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase)MD：苹果酸脱氢酶(Malate Dehydrogenase）NAD：氧化型-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(-Nicotinamide-Adenin

9、e-Dinucleotide,oxidized form）NADH：还原型-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(-Nicotinamide-Adenine-Dinucleotide,reduced form）P-5-P：5-磷酸吡哆醛（Pyridoxal-5-Phosphoric acid）QUAM：化学测量中不确定度的评定(Quantifying Uncertainty In Analytical Measurement)SOP：标准操作程序(Standard Operation Procedure)5 测量原理和方法 本参考测量程序采用偶联反应，反应式如下：L-天门冬氨酸+-酮戊二酸AST草酰乙酸+L-

10、谷氨酸 草酰乙酸+NADH+H+MDL-苹果酸+NAD+在339 nm下，监测NADH的氧化速率，吸光度的下降速率与AST催化活性浓度呈正比。WS/T 6172018 4 6 测量前试剂准备 6.1 试剂列表 将所用试剂按表1列出。表1 试剂列表 分类 系统名称 通用名称,缩略语 试剂 三羟甲基氨基甲烷 Tris L-天门冬氨酸 无-酮戊二酸，二钠盐，二水合物 无-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原型，二钠盐 还原辅酶 I,NADH 乳酸脱氢酶 LD 苹果酸脱氢酶 MD 叠氮钠 无 盐酸 无 氢氧化钠 无 氯化钠 无 牛血清白蛋白，Fraction V 无 5-磷酸吡哆醛，一水合物 P-5-P 丙酮酸

11、一钠盐 无 草酰乙酸 无 溶剂 质量与双蒸水类似的高纯度水（电导率2 Scm-1，pH 67，硅酸盐0.1 mgL-1）无 参考物质 JCTLM和/或国家批准的参考物质 无 质控物质 常规系统校准品 无 指示剂 无 无 6.2 试剂原料信息 按表2填写试剂原料详细信息。表 2 试剂原料详细信息 试剂系统名 _ 通用名_ 信息指标 内容 CAS，CARN注册号 生产厂家 货号/批号 分子式 相对分子质量 纯度 特定合格要求（如有）WS/T 6172018 5 危险度 贮存要求 失效期 AST测定所用每个试剂原料详细信息见附录A。宜使用最高纯度的试剂。试剂的质量应由供应商提供分析证明。如果怀疑某一

12、种化学物质中含有影响AST催化活性的不纯物，应进行进一步的检测，例如，比较不同厂家和不同批号的产品。建议使用在对比试验中已经鉴定或认可的试剂。以下三种试剂需要注意安全：盐酸、氢氧化钠和叠氮钠对人体有伤害作用，操作人员应经过专门培训，严格遵守操作规程，根据需要可以佩戴自吸过滤式防毒面具（全面罩）或头罩型电动送风过滤式防尘呼吸器，戴化学安全防护眼镜，穿橡胶耐酸碱材料制成的防护服以及戴橡胶耐酸碱手套等，做好安全防护工作。6.3 试剂溶液配制 6.3.1 一般要求 制备溶液时各成分给出的质量是指100含量。如果化学物质的含量低于100例如y(%)，则应用因子：Fcontent100y，计算出与给出质量

13、相当的某化学物质的质量。溶液的制备应使用质量与双蒸水类似的高纯度水（电导率2 Scm-1，pH 67，硅酸盐0.1 mgL-1)。每次称重的扩展不确定度（k2）(包括物质纯度的不确定度)（正态分布），应1.5。6.3.2 溶液 1 称量1.17 g Tris、4.02 g天门冬氨酸（游离酸）、0.052 g叠氮钠，将上述物质按以下步骤处理：溶在约 80 mL 水中；加 4.2 mL4.4 mL 5.00 molL-1的氢氧化钠溶液；搅拌直到试剂完全溶解；混合液的pH值应比pH靶值低（约0.3 pH0.9 pH）；在 37用 2 molL-1氢氧化钠溶液调节 pH 到 7.65；转移至 100

14、mL 容量瓶中；将容量瓶和水平衡至 20；加水（20）至容量瓶的刻度线。最终配制的溶液中 Tris 浓度为 96.92 mmolL-1，天门冬氨酸浓度为 302.4 mmolL-1，叠氮钠浓度为 8.00 mmolL-1。该溶液 28稳定性为 3 个月。注:加水之后天门冬氨酸不溶解,必须先加氢氧化钠溶液,以5 molL-1代替2 molL-1氢氧化钠溶液可减少所需用量,精确调整pH值时需用2 molL-1氢氧化钠溶液。6.3.3 溶液 2 WS/T 6172018 6 称量1.17 g Tris、0.052 g叠氮钠，将上述物质按以下步骤处理：将上述 2 种试剂溶在约 80 mL 水中；在 3

15、7用 1 molL-1盐酸调 pH 值到 7.65；转移至 100 mL 容量瓶；将容量瓶和水平衡至 20；加水（20）至容量瓶刻度线。最终配制的溶液中 Tris 浓度为 96.92 mmolL-1，叠氮钠浓度为 8.00 mmolL-1。该溶液在 28稳定性为 3 个月。6.3.4 溶液 3 称量16.7 mg P-5-P一水化合物，按以下步骤处理：将 16.7 mg P-5-P 一水化合物用 6mL 溶液 2 溶解；转移至 10 mL 容量瓶；容量瓶和溶液 2 平衡至 20；加溶液 2（20）到容量瓶刻度线；避光保存（如棕色瓶）。最终配制的溶液中 P-5-P 浓度为 6.30 mmolL-

16、1。此溶液在 28稳定性为 1 周。6.3.5 溶液 4 称量16.1 mg NADH二钠盐，按以下步骤处理：溶于 2.00 mL 溶液 2 中；避光保存（如棕色瓶）。最终配制的溶液中NADH浓度为11.34 mmolL-1。此溶液在28稳定性为1周。6.3.6 酶试剂的稀释液 称量1.20 g牛血清白蛋白、0.90 g氯化钠，将上述物质按以下步骤处理：将上述 2 种试剂溶于约 80 mL 水中；转移至 100 mL 容量瓶；将容量瓶和水平衡至 20；加水（20）至容量瓶刻度线。最终配制的溶液中氯化钠浓度为154 mmolL-1。此溶液在28稳定性至少1个月。WS/T 6172018 7 6.

17、3.7 溶液 5 按以下步骤配制：用6.3.6中的酶试剂稀释液稀释LD储存液,使LD催化活性浓度在37时为3.78 mkatL-1（226.8 kUL-1）。按式(1)计算稀释LD储存液所需酶试剂稀释液体积。V diluent=V LDSTOCK(LDSTOCK-226.8)/226.8(1)式中：Vdiluent稀释LD储存液所需酶试剂稀释液体积，单位为毫升(mL)；VLDSTOCKLD储存液体积，单位为毫升(mL)；LDSTOCKLD储存液中LD催化活性浓度,单位为毫凯塔尔每升(mkatL-1)或千单位每升(kUL-1)。示例1：见附录B。用6.3.6中的酶试剂稀释液稀释MD储存液，使MD

18、催化浓度在37时为2.52 mkat L-1(151.2 kU L-1)。按式(2)计算稀释MD储存液所需酶试剂稀释液体积。Vdiluent=VMDSTOCK(MDSTOCK-151.2)/151.2(2)式中：Vdiluent 稀释MD储存液所需酶试剂稀释液体积，单位为毫升(mL)；VMDSTOCK MD储存液体积，单位为毫升(mL)；MDSTOCK MD储存液中MD催化活性浓度,单位为毫凯塔尔每升(mkatL-1)或千单位每升(kUL-1)。示例2：见附录C。将两种稀释后的酶溶液等体积混合可得溶液5。最终配制的溶液中LD催化活性浓度在37时为1.89 mkatL-1(113.4 kUL-1

19、)、MD催化活性浓度在37时为1.26 mkatL-1 (75.6 kUL-1)。该溶液28稳定性为2 d。6.3.8 反应溶液 分别移取10.000 mL溶液1、0.200 mL溶液3、0.200 mL溶液4、0.100 mL溶液5，将上述溶液充分混匀，避光保存。此溶液在28稳定性为1 d。6.3.9 起始试剂溶液 称量0.326 g-酮戊二酸二钠二水化合物，按以下步骤处理：溶于约 6 mL 水中；转移至 10 mL 容量瓶；将容量瓶和水平衡至 20；WS/T 6172018 8 加水（20）至刻度线。最终配制的溶液中-酮戊二酸二钠浓度为 144.0 mmolL-1。此溶液在 28稳定性为

20、1 周。6.4 温度对缓冲溶液 pH 的影响 当温度偏离 37oC 时，调节 pH 值的方法：将温度计与 pH 电极同时浸入混合液中。然后将溶液边搅拌边滴定至表中列举在当前测定温度下的 pH 值。在校准、控制和调节 pH 的过程中，搅拌速度要一致。pH 电极必须位于被搅拌溶液的中心。配制溶液 1、溶液 2 时，需根据不同温度调整 pH 值，分别按照附录 D 中 D.1 和 D.2 调节溶液 pH 值。为此，接近靶值时应重新控制温度，同样的方法也适用于 pH 计的温度补偿调节。7 测量前仪器准备 7.1 仪器列表 实验室应在表3登记主要测量仪器(分光光度计)和主要辅助仪器(点式温度计、天平、pH

21、计、恒温水浴箱、稀释配液仪、移液器等)。表 3 测量仪器和辅助仪器列表 仪器名称 生产厂家 型号 分光光度计 点式温度计 天平 pH计 恒温水浴箱 稀释配液仪 移液器 7.2 仪器性能要求 分光光度计及辅助仪器主要性能的要求,见表4。表 4 分光光度计及辅助仪器主要性能的要求 仪器名称 性能指标 IFCC参考程序要求 分光光度计、配件 波长准确度/nm 3391(k=2）带宽/nm 2 光径/mm 10.000.01(k=2）pH计 pH值 7.650.05(k=2）点式温度计 温度/37.00.1(k=2）7.3 分光光度计准备 测量工作前，按已制定的SOP文件对分光光度计进行检查，填入表5

22、。WS/T 6172018 9 表 5 分光光度计准备 准备事项 具体内容 开机前检查 电源 接地 电脑 打印机 是否24小时开机 温度 湿度 机身清洁 比色仓清洁 比色窗清洁 组合 恒温装置：与分光光度计连接完整 提前开机 测温装置：电量 测温探头勿挤压、碰撞坚硬物体 搅拌装置：清洁 转速 比色杯：完整 清洁度 开机注意事项 光源灯：提前预热 比色杯：光径 比色杯间匹配 仪器性能检查 核实是否在国家计量机构检定合格效期内 每日开机性能检查：波长正确度 波长重复性 基线平直度扫描 带宽测试 噪音测试 大型实验前性能检查：氧化钬玻璃检查波长准确度 国家标准溶液检查吸光度准确度 预防性维护 分光光

23、度计：无明显振动 及时待机 无线电干扰 UPS 辅助仪器：更换进、出水管 定期清洁 使用后清洁点温计探头、搅拌装置 各实验室可根据具体情况制定本实验室分光光度计准备流程图。7.4 点式温度计准备 测量工作前，按已制定的SOP文件对点式温度计进行检查，填入表6。表 6 点式温度计准备 准备事项 具体内容 开机前检查 电源 机身清洁 点式温度计温度探头是否正常 组合 主机与点式温度计温度探头连接完整 开机注意事项 电量：查看剩余电量 校准提示：查看校准有效期是否到期 仪器性能检查 核实是否在国家计量机构检定合格效期内 大型实验前性能检查：用计量合格的标准温度计检查温度的准确性 预防性维护 主机：机

24、身清洁 温度探头：使用后及时清洁 保证直形、不弯曲 各实验室可根据具体情况制定本实验室点式温度计准备流程图。7.5 恒温水浴箱准备 测量工作前，按已制定的SOP文件对恒温水浴箱进行检查，填入表7。WS/T 6172018 10 表 7 恒温水浴箱的准备 准备事项 具体内容 开机前检查 电源 温度 湿度 机身清洁 组合 与分光光度计连接 开机注意事项 水量 进口水管 出口水管 仪器性能检查 温度校正 温度稳定性 预防性维护 清洗滤网 水箱内部消毒 各实验室可根据具体情况制定本实验室恒温水浴箱准备流程图。7.6 稀释配液仪准备（实验室若有）测量工作前，按已制定的SOP文件对稀释配液仪进行检查，填入

25、表8。表 8 稀释配液仪的准备 准备事项 具体内容 开机前检查 电源 温度 湿度 机身清洁 开机注意事项 注射器 移液口 管路冲洗 仪器性能检查 加样量正确度 加样量精密度 预防性维护 定期更换注射器 定期更换移液管 各实验室可根据具体情况制定本实验室稀释配液仪准备流程图。7.7 移液器准备 测量工作前，按已制定的SOP文件对移液器进行检查，填入表9。表 9 移液器的准备 准备事项 具体内容 应用前检查 温度 湿度 机身清洁 机械移动 仪器性能检查 加样量正确度 加样量精密度 预防性维护 定期进行保养 定期校准 各实验室可根据具体情况制定本实验室移液器准备流程图。7.8 天平准备 测量工作前，

26、按已制定的SOP文件对天平进行检查，填入表10。表 10 天平准备 准备事项 具体内容 开机前检查 电源 打印机 水平珠位置 开机自检 电量 零位显示 校准 核实是否在国家计量机构检定合格效期内 WS/T 6172018 11 大型实验前:标准砝码校准 每次应用前：仪器自带校准 开机注意事项 使用前清洁天平 电源 各实验室可根据具体情况制定本实验室天平准备流程图。7.9 pH 计准备 测量工作前，按已制定的SOP文件对pH计进行检查，填入表11。表 11 pH 计准备 准备事项 具体内容 开机前检查 电源 接地 电脑 打印机 温度 湿度 机身清洁 组合 温度探头：与pH计连接完整 电极：与pH

27、计连接完整 内液的量 外液的量 磁力搅拌器：电源 接地 转速 磁力搅拌子：完整 清洁度 磁力 pH标准溶液：剩余量 有效期 仪器性能保证 每次应用前性能保证：更换电极内液和电极外液进行电极激活；采用pH标准溶液进行校准 预防性维护 应用前：更换电极内液和电极外液：电极激活 应用后：更换电极内液和电极外液：电极保养 清洁温度探头、电极 各实验室可根据具体情况制定本实验室pH计准备流程图。8 测量前采样和样品准备 8.1 样品接受信息 宜以表格形式记录样品接收的详细信息，见表12。对不符合样品接收要求的样品应及时与委托方联系。表 12 AST 样品接收要求 要求指标 内容 可接受样品种类 血清 血

28、浆 其他 可接受样品类型 冻干粉 液体 冰冻 其他 基质类型说明 人血清 牛血清 水 其他 样品最低数量 支 每支样品最低体积 每支 mL 允许添加物 运输条件 干冰 常温 冰袋 其他 贮存条件 常温 4-20-70 其他 稳定性 WS/T 6172018 12 危险性 注意事项 8.2 分析样品的类型 AST参考测量程序测量的样品主要有：参考物质(RM)；质控物质；室间比对样品；检测实验室送检样品；其他标本。8.3 分析样品的顺序 分析样品按下列顺序排列：参考物质（RM）；质控物质；空白分析样品，如：生理盐水；被分析的“未知”物质。上述分析样品重复测量可减小测量结果不确定度。从一个分析样品到

29、下一个分析样品的携带污染应小于 0.5%。8.4 分析样品的处理过程 分析样品的处理过程应包括以下内容：AST参考程序测量的分析样品多为冻干粉或深低温的冰冻样品，测量前需处理为均匀的液体状态，分析部分应取自该液体分析样品进行测量。对每一类型实验室样品应制定详尽的样品处理SOP文件，并有记录证实操作达到预期要求。实验室样品若为冻干粉或干粉，应使用质量与双蒸水类似的高纯度水（电导率2 Scm-1，pH 67，硅酸盐0.1 mgL-1）溶解；若为冷冻液体如冰冻血清等，应按SOP文件在严格控制的条件下融解。应有处理参考物质的SOP和记录。测量过的样品有贮存待复查、销毁的文件和记录。9 测量过程 9.1

30、 测量条件 AST 催化活性浓度测量条件见表 13。WS/T 6172018 13 表 13 AST 催化活性浓度测量条件 参数 指标 温度 37.00.1a 波长 339 nm1 nma 带宽 2 nm 光径 10.00 mm0.01 mma 孵育时间 300 s 延迟时间 90 s 测定时间 180 s 读数（测量点）6 a扩展不确定度（k=2）。9.2 测量步骤 9.2.1 监测比色杯内温度，达到要求时开始准备试剂和分析溶液。9.2.2 将实验所需的反应溶液进行脱气处理。可采用的脱气的方法是：采用温度为35的真空炉或将溶液加热至35，在真空干燥器中储存1h,同时进行磁力搅拌。如果脱气溶液

31、当天不能用完，下次使用前应再次脱气。9.2.3 将一份适当体积（约 0.400 mL）起始试剂溶液在 37下平衡，剩余的起始试剂应保存在 28。9.2.4 将 6.3 中所列试剂体积按表 14 的顺序加入到反应杯中。表 14 总体转换率测量的分析系统（AST 催化反应速率和空白率）体积 测量步骤 反应液 2.000 mL 反应液 平衡至 37 分析样品 0.200 mL 样品 与反应液充分混合并孵育 300 s。在孵育结束时，反应杯中的溶液温度应达到 37 起始试剂 0.200 mL 起始试剂溶液 与反应杯中溶液充分混合，等候 90 s，监测另外 180 s 的时间和吸光度 注：此动态光度测量

32、的扩展（k=2）合成不确定度（正态分布）不应超过 1%（此不确定度不包括波长调整的不确定度）。样本体积分数的扩展（k=2）合成不确定度（正态分布）应1%。9.2.5详细的测量流程见图1 监测比色杯内温度 达37 准备试剂和分析溶液 WS/T 6172018 14 孵育反应液试剂 达37 在比色杯内加入2.000 mL反应液 37 加入分析样品0.200 mL，充分混匀 孵育300 s 37 加入启动试剂0.200 mL，充分混匀，等待90 s 监测吸光度 180 s 记录吸光度值 处理数据 清洁比色杯 图1 AST参考程序测量流程图 9.3 最终完全反应混和物的浓度 AST 催化活性浓度测定最

33、终完全反应混合物的浓度见表 15。表 15 AST 催化活性浓度测定最终完全反应混合物的浓度 参数 指标 三羟甲基氨基甲烷（Tris）80 mmolL-1 pH（37）7.650.05a L-天门冬氨酸 240 mmolL-1 NADH 0.18 mmolL-1 P-5-P 0.1 mmolL-1 MD（37）10 katL-1(600 UL-1)LD（37）15 katL-1(900 UL-1)-酮戊二酸 12 mmolL-1 样本体积比分 0.0833（1:12）a 扩展不确定度（k=2）。9.4 试剂空白率测量 为了测量试剂空白率，用9 gL-1(154 mmolL-1)NaCl溶液代替

34、分析样品，测量方法同9.2。注1：试剂空白的反应呈非线性动力学，试剂空白吸光度的绝对变化值如大于0.002 min-1，相关试剂应丢弃。注2：由于动力学的非线性，试剂空白重复性较差。建议重复测量3次，采用3次测量的平均值参与计算。WS/T 6172018 15 9.5 分析样品空白率测量 采用9 gL-1（154 mmolL-1）氯化钠溶液代替起始试剂溶液测量分析样品空白率。按上述步骤进行操作。注：分析样品空白率可被测量和记录，但在计算质控血清和校准品中 AST 催化活性时不考虑。一旦分析样品空白率超过AST 总催化活性的 1%，则警告有关物质不适宜作校准用。10 测量结果处理 10.1 测量

35、结果计算 通过回归分析（最小二乘法）计算吸光度随时间改变的变化率。减去试剂空白率后，即校正后的分析样品吸光度变化率。按式（3）计算 AST 催化活性浓度：bASTF(A/t)AST(3)式中：bAST AST的催化活性浓度,单位为微凯塔尔每升（katL-1）或单位每升（UL-1）；F 系数，等于 1905在 339nm 波长测量时，339（NADH）=630 mol-1,为 IFCC 与 IRMM 推荐；(A/t)AST 经过试剂空白率校正后的分析样品吸光度变化率，单位为每秒（s-1）或每分（min-1）。10.2 数据处理 对于计算的 AST 催化活性浓度,要进行数据处理:数据剔除：必要时，

36、每个实验室应建立适当的数据剔除规则；计算每批次测量值的均值、标准差，必要时应检查数据分布类型，计算均值的标准差（标准误）；根据 GUM 和 QUAM 原则计算测量结果的不确定度。10.3 酶活性单位及换算关系 酶催化活性常用单位为katL-1，使用时常出现多位小数，目前常以katL-1或 nkatL-1表示，但临床医学中仍习惯于使用UL-1。换算关系如下：以UL-1单位表示的催化浓度可通过乘以系数（f=0.01667）转化成katL-1。10.4 测量不确定度的评定 10.4.1 定义被测量 应至少从下面几个方面定义被测量:血清（或血浆）AST催化活性浓度；催化活性单位：katL-1或UL-1

37、；WS/T 6172018 16 AST催化活性测量主要用于临床心脏或肝脏疾病的判断；应考虑到血清中可能存在线粒体型AST（mAST）和细胞浆型AST（sAST）；溶血时sAST可显著升高；不考虑分析前和分析后因素对测量不确定度的贡献。10.4.2 建立数学模型 C为输出量，为AST测量的催化活性浓度。影响测量的直接因素有：A/T为吸光度变化率；为摩尔吸光系数；L为比色杯光径；VR1为反应液体积；VR2为起始试剂体积；VS为样品体积。影响测量的间接因素有：temp为温度；pH；wl为波长；trans为透光度；lot为试剂厂家与批号；conc为试剂浓度；line为方法线性；aging为试剂老化。

38、10.4.3 不确定度分量的定量 应至少从下面几个方面对不确定度的分量进行定量:测量结果的不精密度：一般将同一分析样品分4天测量，每天连续测量3次，计算均值、标准差与变异系数。摩尔消光系数的不确定度：根据文献摩尔消光系数的不确定度为1%，可考虑为三角形分布。比色杯光径的不确定度：比色杯光径应经有资质的计量院所检定或校准，引用证书上的不确定度，可考虑为正态分布。体积的不确定度：在重大测量前应对加反应液（VR1）、起始试剂（VR2）、分析样品（VS）的加样器或相应加样设备进行校准，校准过程中产生的不精密度即为加样的不确定度，分别为uVR1、uVR2、uVS，计算体积项（VR1+VR2+VS）/VS

39、不确定度，先计算分子项不确定度，22221VSVRVRuuuu分子，其相对值)/(%21SRRVVVuu分子分子，分母项相对不确定度SSVuu/%分母，则体积项的相对不确定度22%分母分子uuuvol；应注意计算分母项不确定度时，计算不确定度的绝对值，而不是相对值。A/t的不确定度：吸光度（A）与透光度和波长的不确定度有关，测量时间（t）的不确定度一般不考虑，因仪器计时器的精度一般都能达到十万分之一，因此可忽略不计。透光度的不确定度：根据检定证书上透光度的示值误差计算，一般考虑为矩形分布。波长的不确定度：根据检定证书上波长的示值误差和重复性，计算波长的不确定度，一般考虑为矩形分布。agingl

40、ineconclottranswlpHtempSSRRffffffffTAVVVVLC621101WS/T 6172018 17 pH的不确定度：根据pH计检定证书或校准证书上仪器的示值误差和重复性，计算pH计的不确定度，一般考虑为矩形分布。与pH有关的不确定度还应包括pH校准液的不确定度。同时应考虑pH的灵敏系数，可引用德国临床化学学会（DGKL）参考实验室数据（18%）。温度的不确定度：根据数字温度计（点温度计）检定证书或校准证书上仪器的示值误差和重复性，计算温度计的不确定度。由于在测量酶催化活性时，对温度的影响不仅来源于温度计，更主要的来源于测量系统的温控，应以实验了解温控系统的变化，计

41、算出温度影响的不确定度。同时应考虑温度影响的灵敏系数，可引用德国临床化学学会（DGKL）参考实验室数据（5.30%/）。试剂厂家与批号的不确定度：有关不同厂家与不同批号的试剂所引起的不确定度可自行进行实验，也可引用DGKL的数据（1.5%），一般考虑为矩形分布。试剂浓度的不确定度：试剂浓度或纯度导致的不确定度，可自行进行实验，也可引用DGKL的数据（1.5%），其灵敏系数为17%，一般考虑为矩形分布。方法线性的不确定度：方法线性引起的不确定度，可自行进行实验，也可引用DGKL的数据（0.6%），一般考虑为矩形分布。试剂老化的不确定度：试剂老化所导致的不确定度，可自行进行实验，也可引用DGKL的

42、数据（0.5%），一般考虑为矩形分布。10.4.4 建立不确定度预估表 可将以上各不确定度分量总结绘制不确定度预估表，见表16。表16 不确定度分量预估表 输入量 不确定度 来源 分布类型 评定类型 标准不确定度 灵敏系数 相对标准不确定度/%不精密度 实验 正态 A 1 消光系数 1%文献 三角 B 1 0.408 光径 校准证书 正态 B 1 体积 实验 正态 A 1 透光度 校准证书 矩形 B 时间 实验 忽略不计 0 波长 校准证书 矩形 B 0.20%/nm pH 校准证书 矩形 B 0.25%/0.05pH 温度 实验 5.30%/0.229 试剂批号 1.5%DGKL 矩形 B

43、0.87%1 0.87 试剂浓度 1.5%DGKL 矩形 B 0.87%0.17 0.147 方法线性 0.60%DGKL 正态 B 0.30%1 0.300 试剂老化 0.5%DGKL 矩形 B 0.289%1 0.289 10.4.5 合成标准不确定度 根据不确定度传播律，将上述12个不确定度分量进行合成，即为相对合成标准不确定度uc。WS/T 6172018 18 10.4.6 扩展不确定度 扩展不确定度相对值：cukU (k=2)扩展不确定度的相对值乘以测量结果的均值，可得到扩展不确定的绝对值。10.5 结果确认 10.5.1 实验室内结果正确度评估 在进行重要测量前（如给参考物质/校

44、准品赋值、测量室间比对样品等），应先测定JCTLM或国家批准的参考物质，测量结果应在“靶值不确定度”范围内，否则应确认测量程序的正确度。10.5.2 实验室间比对进行结果确认 AST催化活性浓度参考测量程序由检验医学国际权威学术组织IFCC提出，经多个参考实验室认真评估后经JCTLM批准。30参考测量程序和37参考测量程序的比较参见附录E。实验室应有 SOP 文件和记录证实此活动。11 结果报告 应设计适宜的测量结果报告格式，包括但不限于以下内容：血清、血浆或其他；取样日期和测量日期；测量所使用的参考程序：IFCC 在 37下测量 AST 催化活性浓度的原级参考测量程序；被测量的名称、测量结果

45、的量值和测量单位；被测量：血清（或血浆）AST催化活性浓度；测量单位：katL-1或UL-1；评定测量结果的不确定度：一般取k=2；标本异常特性记录：如溶血、黄疸、乳糜等；测量方法的异常情况或改变测量程序记录。12 分析可靠性 12.1 概念、价值及其应用 222222222222aginglinconlottemppHwltransvolLRwcuuuuuuuuuuuSuWS/T 6172018 19 应依据不确定度、精密度、线性范围、检出限等来评估AST参考测量程序的分析可靠性。相关文献及参考测量实验室的有关数据表明本参考测量程序的分析性能优于临床酶活性浓度测量的常规方法，适合于临床常规测

46、量程序的溯源。12.2 测量不确定度 应根据GUM和QUAM原则计算测量不确定度。按照10.4不确定度计算方法，并结合比对实验室数据，本参考程序的测量结果的相对合成标准不确定度在浓度4.07 katL-1(244 UL-1)时宜小于2.0%。12.3 测量精密度 选择2个浓度水平的质控物质，每天测量2次（2次间隔不少于2 h），每次测量均做双份，连续测量20 d，按CLSI EP5-A3文件进行评价。应根据本实验室测量条件评估本参考程序的重复性、期间精密度。结合比对实验室结果，本参考程序重复性CV宜小于1.5%，期间精密度CV宜小于2.0%。12.4 检出限 与分光光度计的最小分析信号有关。国

47、际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)对检出限的规定，按照AST参考测量程序的操作步骤，测定试剂空白五次，用生理盐水为零值样本，测定20次，计算x与s,以x+3s为检测限。结合比对实验室数据，本参考程序测量的检出限为0.13 katL-1(7.8 UL-1)。12.5 线性范围 参考CLSI EP6-A文件，设定实验室的重复性和线性的允许误差范围分别为1%和5%，选择覆盖IFCC文件提供线性范围20%30%的高(H)、低(L)浓度水平混合血清，按比例配制成9个系列浓度样本，每个样本重复测量2次，将所得数据进行多项式回归统计，结合比对实验室数据，线性范围检测上限：4.13katL-1(247.7

48、UL-1)。12.6 误差的来源 误差主要包括以下几个来源：AST 测量的线性范围较窄。在孵育过程中，分析样品中高浓度丙酮酸将导致大量消耗 NADH，这样会减少线性范围的上限，并显著降低测量结果。偏离了参考程序中规定的延迟时间和测量时间，导致测量结果与原参考测量程序结果不一致。当质控物质和校准品 pH 值与参考程序中描述的 pH 值差别较大时，可导致 AST 测量不确定度增加。空气中的 CO2会改变反应液的 pH 值，因此反应液容器应密封。溶液 1 和溶液 2 应至少每周监测一次 pH 值。13 质量保证 13.1 实验室环境 结合比对实验室经验，控制室内温度2030，湿度30%70%。13.

49、2 室内质量控制 每个工作日开始正式测量分析样品前均测量定值的质控物质，质控结果在质控物质靶值2倍标准WS/T 6172018 20 差以内，若失控，查找原因直至在可控范围内方可进行实验。应建立包括质控规则、操作步骤的室内质控SOP文件及记录。13.3 室间质量评价/能力验证 JCTLM在2003年的国际参考实验室能力比对计划(RELA)中将本酶列为比对项目之一。定期参加IFCC和国内权威机构组织的有关参考实验室的室间质量评价计划/能力验证活动，结果应符合要求。当出现不符合情况时，应认真查找原因，建立失控及失控跟踪记录。13.4 质量日志 每个工作日完成工作日志及环境控制等质量记录。WS/T

50、6172018 21 附录A(资料性附录)试剂原料详细信息 试剂原料详细信息见表A.1。表A.1 试剂原料详细信息 试剂系统名 通用名 信息指标内容 CAS,CARN注册号 生产厂家 货号/批号 分子式 相对分子质量 纯度 特定合格要求(如有）危险度 贮存要求 失效期 三羟甲基氨基甲烷 Tris 77-86-1 C4H11NO3 121.14 Xi,R36/37/38,S26,S37/39 L-天门冬氨酸 天门冬氨酸 56-84-8 C4H7NO4 133.10 S22,S24/25 二水-酮戊二酸结晶二钠盐 -酮戊二酸 305-72-6 C5H4O5Na2.2H2O 226.09 S24/2