《微生物学及实验》实验指导书dvt.docx

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1、微生物物学及实实验实实验指导导书第一部分分 实实验目的的微生物物学及实实验实实验课是是我院环环境科学学专业学学生必修修的一门门重要的的基础实实验课，是是学生进进入我院院实验室室的第一一门实验验课。微生物物学及实实验实实验的目目的是使使学生掌掌握微生生物学的的基本实实验方法法和技术术，正确确的使用用实验的的仪器设设备，在在学生头头脑中建建立无菌菌概念和和掌握无无菌操作作技能是是最重要要的内容容，是学学生进行行后续课课实验和和研究的的基础。在在目前的的实验室室条件和和有限学学时的情情况下，得得到微生生物实验验技术的的基本操操作和技技能训练练，培养养学生动动手操作作能力和和创新能能力。通通过微生生物

2、学实实验课教教学，加加深理解解和巩固固课堂所所学的知知识，熟熟悉微生生物学实实验的基基本操作作技术，了了解微生生物实验验的基础础知识。通通过微生生物学实实验培养养学生观观察、思思考、分分析问题题、解决决问题的的能力，养养成实事事求是、严严肃认真真的科学学态度、创创新精神神、创新新思维和和创新能能力。本实验指指导书主主要内容容包括：微生物物个体和和菌落形形态观察察、染色色方法、培培养基制制备和灭灭菌、无无菌操作作、微生生物检测测和分离离、生理理生化反反应、影影响微生生物生长长的因素素和污染染物微生生物降解解实验，水水中微生生物分布布调查等等内容。同同时也注注意和环环境微生生物学的的联系与与区别。

3、整个实验验课中贯贯穿了显显微镜使使用灭菌方方法无菌操操作微生物物菌种分分离筛选选鉴定、选选育微生物物代谢作作用这一一主线。微微生物学学需掌握握的基本本操作在在实验中中得到训训练，同同时加深深了学生生对所学学微生物物学基本本概念的的理解。实实验设计计贴近生生活，可可以大大大提高同同学们学学习微生生物学的的兴趣。实实验内容容与目录录如下：序 号号实验名称称学时实验类型型实验一光学显微微镜的使使用及活活性污泥泥中生物物相的观观察3基础验证证实验实验二微生物的的染色及及观察3实验三培养基的的制备和和灭菌3实验四纯种微生生物的分分离、转转种和培培养3实验五有机污染染物质的的生物降降解实验验*4综合性实实

4、验实验六双歧杆菌菌口服液液的发酵酵制备*4*注：实实验六为为选做实实验。第二部分分 微微生物学学实验室室规则微生物学学实验的的对象大大多为环环境微生生物，其其中某些些微生物物对人体体具有危危害性，因因此要求求进入实实验室后后必须严严格遵守守以下实实验室规规则：1.进入入实验室室应先穿穿白大衣衣，离开开实验室室时要脱脱下白大大衣，反反折放回回原处，不不必要的的物品不不得带入入实验室室，必须须带入的的书籍和和文具等等应放在在指定的的非操作作区，以以免受到到污染。无无菌操作作时必须须戴口罩罩，并不不得开电电风扇。2进入入实验室室进行实实验前应应先洗手手，避免免手上的的分秘物物、食物物油、护护肤用品品

5、和沾染染的微生生物等对对实验造造成污染染。3实验验室内禁禁止饮食食、抽烟烟，不得得高声说说笑或乱乱走乱串串。4各种种实验物物品应按按指定地地点存放放，用过过的器材材必须经经消毒处处理，禁禁止随意意放置。5须送送恒温生生化培养养箱培养养的物品品，应做做好标记记（标明明姓名、编编号、日日期、培培养时间间）后送送到指定定地点。6实验验过程中中如发生生意外事事故时，禁禁止隐瞒瞒或自作作主张不不按规定定处理，应应立即报报告老师师进行正正确的处处理。如如有传染染性、腐腐蚀性的的材料污污染桌面面、地面面等，应应立即用用0.22%-00.5% “84”消毒液液浸泡污污染部位位，作用用5110miin后方方可抹

6、去去。如手手被活菌菌污染也也应使用用上述消消毒液浸浸泡510mmin或或肥皂清清洗后，再再以自来来水反复复冲洗干干净，必必要时去去医院就就医。7爱护护室内仪仪器设备备，严格格按操作作规则使使用。节节约使用用实验材材料，不不慎损坏坏了器材材等，应应主动报报告老师师进行处处理。8实验验完毕，应应物归原原处、将将台面整整理清洁洁，将实实验室打打扫干净净。最后后以肥皂皂洗手后后方可离离开实验验室。第三部分分 实验验内容实验一 光学学显微镜镜的使用用及活性性污泥中中生物相相的观察察实验项目目性质：基础验验证实验验所属课程程名称：微生生物学及及实验实验计划划学时：3学时时一、实验验目的1. 学习并并掌握显

7、显微镜的的原理和和使用方方法。 2. 复复习普通通台式显显微镜的的结构、各各部分的的功能和和使用方方法。 3. 观观察几种种真核微微生物的的个体形形态，掌掌握生物物图的绘绘制方法法。二、显微微镜的基基本结构构及油镜镜的工作作原理 现代普通通光学显显微镜利利用目镜镜和物镜镜两组透透镜系统统来放大大成像，故故又常被被称为复复式显微微镜，它它们由机机械装置置和光学学系统两两大部分分组成。在在显微镜镜的光学学系统中中，物镜镜的性能能最为关关键，它它直接影影响着显显微镜的的分辨率率。而在在普通光光学显微微镜通常常配置的的几种物物镜中，油油镜的放放大倍数数最大，对对微生物物学研究究最为重重要。与与其他物物

8、镜相比比，油镜镜的使用用比较特特殊，需需在载玻玻片与镜镜头之间间滴加镜镜油，这这主要有有如下二二方面的的原因： 1. 增增加照明明亮度 油镜的放放大倍数数可达1100，放大大倍数这这样大的的镜头，焦焦距很短短，直径径很小，但但所需要要的光照照强度却却最大。从从承载标标本的玻玻片透过过来的光光线，因因介质密密度不同同（从玻玻片进入入空气，再再进入镜镜头），有有些光线线会因折折射或全全反射，不不能进入入镜头，致致使在使使用油镜镜时会因因射入的的光线较较少，物物像显现现不清。所所以为了了不使通通过的光光线有所所损失，在在使用油油镜时须须在油镜镜与玻片片之间加加入与玻玻璃的折折射率（nn=1.55）相

9、相仿的油油镜（通通常用香香柏油，其其折射率率 n=1.552）。2. 增增加显微微镜的分分辨率 显微镜的的分辨率率或分辨辨力是指指显微镜镜能辨别别两点之之间的最最小距离离的能力力。从物物理学角角度看，光光学显微微镜的分分辨率受受光的干干涉现象象及所用用物镜性性能的限限制，分分辨力DD可表示示为：DD=/2NNA，式式中= 光光波波长长； NNA= 物镜的的数值孔孔径值。 光学显微微镜的光光源不可可能超出出可见光光的波长长范围（00.4-0.77），而而数值孔孔径值则则取决于于物镜的的镜口角角和玻片片与镜头头间介质质的折射射率，可可表示为为：NA=nnsinn式中为为光线最最大入射射角的半半数。

10、它它取决于于物镜的的直径和和焦距，一一般来说说在实际际应用中中最大只只能达到到12000，而而n为介介质折射射率。由由于香柏柏油的折折射率（11.522）比空空气及水水的折射射率（分分别为11.0 和1.33）要要高，因因此以香香柏油作作为镜头头于玻片片之间介介质的油油镜所能能达到的的数值孔孔径值（NNA 一一般在11.2-1.44）要高高于低倍倍镜、高高倍镜等等干镜（NNA 都都低于11.0）。若若以可见见光的平平均波长长0.555来计计算，数数值孔径径通常在在0.665左右右的高倍倍镜只能能分辨出出距离不不小于00.4的的物体，而而油镜的的分辨率率却可达达到0.2左右右。利用显微微镜的放放

11、大原理理观察视视野中的的各种生生物，根根据观察察到的生生物形态态、运动动方式、生生物（细细胞）结结构初步步判断所所观察到到的生物物的种类类。三、实验验器材 1. 菌菌种：枯枯草芽孢孢杆菌（Bacillus subtilis）染色玻片标本、青霉（Penicillium sp.）的水封片等（教师可根据具体情况选用菌种）、活性污泥混合液。2. 溶溶液或试试剂：香香柏油、乙乙醇：乙乙醚混合合液 3. 仪仪器或其其他用具具：显微微镜、擦擦镜纸等等。 四、操作作步骤 1. 观观察前的的准备 （1） 显微镜镜的安置置：置显显微镜于于平整的的实验台台上，镜镜座距实实验台边边缘约33-4ccm 。镜镜检时姿姿势

12、要端端正。 取放显显微镜时时应一手手握住镜镜臂，一一手托住住底座，使使显微镜镜保持直直立、平平稳。切切忌用单单手拎提提；且不不论使用用单筒显显微镜或或双筒显显微镜均均应双眼眼同时睁睁开观察察，以减减少眼睛睛疲劳，也也便于边边观察边边绘图或或记录。（2） 光源调调节：安安装在镜镜座内的的光源灯灯可通过过调节电电压以获获得适当当的照明明亮度，而而使用反反光镜采采集自然然光或灯灯光作为为照明光光源时，应应根据光光源的强强度及所所用物镜镜的放大大倍数选选用凹面面或凸面面反光镜镜并调节节其角度度，使视视野内的的光线均均匀，亮亮度适宜宜。 （3）根根据使用用者的个个人情况况，调节节双筒显显微镜的的目镜，双

13、双筒显微微镜的目目镜间距距可以适适当调节节，而左左目镜上上一般还还配有曲曲光度调调节环，可可以适应应眼距不不同或两两眼视力力有差异异的不同同观察者者。 （4） 聚光器器数值孔孔径值的的调节：调节聚聚光器虹虹彩光圈圈值与物物镜的数数值孔径径值相符符或略低低。有些些显微镜镜的聚光光器只标标有最大大数值孔孔径值，而而没有具具体的光光圈数刻刻度。使使用这种种显微镜镜时可在在样品聚聚焦后取取下一目目镜，从从镜筒中中一边看看着视野野，一边边缩放光光圈，调调整光圈圈的边缘缘与物镜镜边缘黑黑圈相切切或略小小于其边边缘。因因为各物物镜的数数值孔径径值不同同，所以以每转换换一次物物镜都应应进行这这种调节节。在聚聚

14、光器的的数值孔孔径值确确定后，若若需改变变光照强强度，可可通过升升降聚光光器或改改变光源源的亮度度来实现现，原则则上不应应再通过过虹彩光光圈调节节。当然然，有关关虹彩光光圈、聚聚光器高高度及照照明光源源强度的的使用原原则也不不是固定定不变的的，只要要能获得得良好的的观察效效果，有有时也可可根据不不同的具具体情况况灵活运运用，不不一定拘拘泥不变变。 2. 显显微观察察 在目镜保保持不变变的情况况下，使使用不同同放大倍倍数的物物镜所能能达到的的分辨率率及放大大率都是是不同的的。一般般情况下下，特别别是初学学者，进进行显微微观察时时应遵守守从低倍倍镜到高高倍镜再再到油镜镜的观察察程序，因因为低倍倍数

15、物镜镜视野相相对大，易易发现目目标及确确定检查查的位置置。 低倍镜观观察：金黄色葡葡萄球菌菌染色标标本玻片片置于载载物台上上，用标标本夹夹夹住，移移动推进进器使观观察对象象处在物物镜的正正下方。下下降 110物镜，使使其接近近标本，用用粗调节节器慢慢慢升起镜镜筒，使使标本在在视野中中初步聚聚焦，再再使用细细调节器器调节至至图像清清晰。通通过玻片片夹推进进器慢慢慢移动玻玻片，认认真观察察标本各各部位，找找到合适适的目的的物，仔仔细观察察并记录录所观察察到的结结果。 在任何时时候使用用粗调节节器聚焦焦物像时时，必需需养成先先从侧面面注视小小心调节节物镜靠靠近标本本，然后后用目镜镜观察，慢慢慢调节节

16、物镜离离开标本本进行准准焦的习习惯，以以免因一一时的误误操作而而损坏镜镜头及玻玻片。 高倍镜观观察：低倍镜下下找到合合适的观观察目标标并将其其移至视视野中心心后，轻轻轻转动动物镜转转换器将将高倍镜镜移至工工作位置置。对聚聚光器光光圈及视视野亮度度进行适适当调节节后微调调细调节节器使物物像清晰晰，利用用推进器器移动标标本仔细细观察并并记录所所观察到到的结果果。在一般情情况下，当当物像在在一种物物镜中已已清晰聚聚焦后，转转动物镜镜转换器器将其他他物镜转转到工作作位置进进行观察察时，物物像将保保持基本本准焦的的状态，这这种现象象称为物物镜的同同焦 (parrfoccal) 。利利用这种种同焦现现象，

17、可可以保证证在使用用高倍镜镜或油镜镜等放大大倍数高高、工作作距离短短的物镜镜时仅用用细调节节器即可可对物像像清晰聚聚焦，从从而避免免由于使使用粗调调节器时时可能的的误操作作而损坏坏镜头或或载玻片片。 油镜观察察：高倍镜或或低倍镜镜下找到到要观察察的样品品区域后后，用粗粗调节器器将镜筒筒升高，然然后将油油镜转到到工作位位置。在在待观察察的样品品区域加加滴香柏柏油，从从侧面注注视，用用粗调节节器将镜镜筒小心心地降下下，使油油镜浸在在镜油中中并几乎乎与标本本相接。将将聚光器器升至最最高位置置并开足足光圈，若若所用聚聚光器的的数值孔孔径值超超过1.0，还还应在聚聚光镜与与载玻片片之间也也加滴香香柏油，

18、保保证其达达到最大大的效能能。调节节照明使使视野亮亮度合适适，用粗粗调节器器将镜筒筒徐徐上上升，直直至视野野中出现现物像并并用细调调节器使使其清晰晰准焦为为止。 有时按上上述操作作还找不不到目的的物，则则可能是是由于油油镜头下下降还未未到位，或或因油镜镜上升太太快，以以至眼睛睛捕捉不不到一闪闪而过的的物像。遇遇此情况况，应重重新操作作。另外外应特别别注意不不要因在在下降镜镜头时用用力过猛猛，或调调焦时误误将粗调调节器向向反方向向转动而而损坏镜镜头及载载玻片。 （4）活活性污泥泥观察 取一片干干净的载载玻片放放在实验验台上，用用一支滴滴管吸取取试管中中藻类培培养液于于载玻片片的中央央，用干干净的

19、盖盖玻片覆覆盖在液液滴上(注意不不要有气气泡)即即成标本本片。用用低倍镜镜和高倍倍镜观察察。3. 显显微镜用用毕后的的处理 （1） 上升镜镜筒，取取下载玻玻片。 （2） 用擦镜镜纸拭去去镜头上上的镜油油，然后后用擦镜镜纸蘸取取少许二二甲苯（香香柏油溶溶于二甲甲苯）擦擦去镜头头上残留留的油迹迹，最后后再用干干净的擦擦镜纸擦擦去残留留的二甲甲苯。 （3） 用擦镜镜纸清洁洁其他物物镜及目目镜；用用绸布清清洁显微微镜的金金属部件件。（4） 将各部部分还原原，反光光镜垂直直于镜座座，将物物镜转成成“八”字形，再再向下旋旋。同时时把聚光光镜降下下，以免免接物镜镜与聚光光镜发生生碰撞危危险。 五、实验验报告

20、 1.分别别绘出你你在低倍倍镜、高高倍镜和和油镜下下观察到到的金黄黄色葡萄萄球菌、枯枯草芽孢孢杆菌、链链霉菌及及青霉的的形态，包包括在三三种情况况下视野野中的变变化。同同时注明明物镜放放大倍数数和总放放大率。2.绘出出活性污污泥生物物相观察察中和各各种微生生物和菌菌胶团。六、思考考题 1、用油油镜观察察时应注注意哪些些问题？在载玻玻片和镜镜头之间间加滴什什么油？起什么么作用？ 2、试列列表比较较低倍镜镜、高倍倍镜及油油镜各方方面的差差异。为为什么在在使用高高倍镜及及油镜时时应特别别注意避避免粗调调节器的的误操作作？ 3、什么么是物镜镜的同焦焦现象？它在显显微镜观观察中有有什么意意义？ 4、影响

21、响显微镜镜分辨率率的因素素有哪些些？ 5、根据据实验体体会，谈谈谈应如如何根据据所观察察微生物物的大小小，选择择不同的的物镜进进行有效效的观察察。 6、根据据你观察察到的活活性污泥泥中的微微生物种种类，说说明水质质污泥情情况。实验二 微生生物的染染色及观观察实验项目目性质：基础验验证实验验所属课程程名称：微生生物学及及实验实验计划划学时：3学时时一、细菌菌的简单单染色法法 1实验验目的 1.1学习微微生物涂涂片、染染色的基基本技术术。 1.2掌握细细菌的简简单染色色法。 1.3初步认认识细菌菌的形态态特征，巩巩固学习习油镜的的使用方方法和无无菌操作作技术。 2实验验原理 细菌的涂涂片和染染色是

22、微微生物学学实验中中的一项项基本技技术。细细菌的细细胞小而而透明，在在普通的的光学显显微镜下下不易识识别，必必须对它它们进行行染色。利利用单一一染料对对细菌进进行染色色，使经经染色后后的菌体体与背景景形成明明显的色色差，从从而能更更清楚地地观察到到其形态态和结构构。此法法操作简简便，适适用于菌菌体一般般形状和和细菌排排列的观观察。常用碱性性染料进进行简单单染色，这这是因为为在中性性、碱性性或弱酸酸性溶液液中，细细菌细胞胞通常带带负电荷荷，而碱碱性染料料在电离离时，其其分子的的染色部部分带正正电荷，因因此碱性性染料的的染色部部分很容容易与细细菌结合合使细菌菌着色。经经染色后后的细菌菌细胞与与背景

23、形形成鲜明明的对比比，在显显微镜下下更易于于识别。常常用作简简单染色色的染料料有美蓝蓝、结晶晶紫、碱碱性复红红等。 当细菌分分解糖类类产酸使使培养基基pH下下降时，细细菌所带带正电荷荷增加，此此时可用用伊红、酸酸性复红红或刚果果红等酸酸性染料料染色。 染色前必必须固定定细菌。其其目的有有二：一一是杀死死细菌并并使菌体体粘附于于玻片上上；二是是增加其其对染料料的亲和和力。常常用的有有加热和和化学固固定两种种方法。固固定时尽尽量维持持细胞原原有的形形态。 3材料料 3.1菌种种 枯草芽孢孢杆菌112118h营营养琼脂脂斜面培培养物、金金黄色葡葡萄球菌菌约244h营养养琼脂斜斜面培养养物、大大肠杆菌

24、菌24hh营养琼琼脂斜面面培养物物、面包包酵母琼琼脂斜面面培养物物。实验验教师可可根据具具体情况况提供合合适的菌菌种。3.2染色色剂 吕氏碱性性美蓝染染液(或或草酸铵铵结晶紫紫染液)，石炭炭酸复红红染液。 3.3仪器器或其他他用具 显微镜，酒酒精灯，载载玻片，接接种环，玻玻片搁架架、双层层瓶(内内装香柏柏油和二二甲苯)，擦镜镜纸，生生理盐水水或蒸馏馏水等。 4流程程 涂片干干燥固定染色水洗干燥镜检。 5步骤骤 5.1涂片片 取两块洁洁净无油油的载玻玻片，在在无菌的的条件下下各滴一一小滴生生理盐水水(或蒸蒸馏水)于玻片片中央，用用接种环环以无菌菌操作，分分别从枯枯草芽孢孢杆菌、藤藤黄微球球菌和大

25、大肠杆菌菌斜面上上挑取少少许菌苔苔于水滴滴中，混混匀并涂涂成薄膜膜。若用用菌悬液液(或液液体培养养物)涂涂片，可可用接种种环挑取取233环直接接涂于载载玻片上上。注意意滴生理理盐水（蒸蒸馏水）和和取菌时时不宜过过多且涂涂抹要均均匀，不不宜过厚厚。 5.2干燥燥 室温自然然干燥。也也可以将将涂面朝朝上在酒酒精灯上上方稍微微加热，使使其干燥燥。但切切勿离火火焰太近近，因温温度太高高会破坏坏菌体形形态。5.3固定定 如用加热热干燥，固固定与干干燥合为为一步，方方法同干干燥。涂片片、干燥燥和热固固定。5.4染色色 将玻片平平放于玻玻片搁架架上，滴滴加染液液122滴于涂涂片上(染液刚刚好覆盖盖涂片薄薄膜

26、为宜宜)。吕吕氏碱性性美蓝染染色12miin，石石炭酸复复红(或或草酸铵铵结晶紫紫)染色色约1mmin。 5.5水洗洗 倾去染液液，用自自来水从从载玻片片一端轻轻轻冲洗洗，直至至从涂片片上流下下的水无无色为止止。水洗洗时，不不要水流流直接冲冲洗涂面面。水流流不宜过过急、过过大，以以免涂片片薄膜脱脱落。 5.6干燥 甩去玻片片上的水水珠自然然干燥、电电吹风吹吹干或用用吸水纸纸吸干均均可以（注注意勿擦擦去菌体体）。 5.7镜检检 涂片干后后镜检。涂涂片必须须完全干干燥后才才能用油油镜观察察。 6结果果 绘制单染染色后观观察到的的大肠杆杆菌和藤藤黄微球球菌的形形态图。 二、革兰兰氏染色色法 1实验验

27、目的 1.1了解革革兰氏染染色法的的原理及及其在细细菌分类类鉴定中中的重要要性。1.2学习掌掌握革兰兰氏染色色技术，巩巩固学习习光学显显微镜油油镜的使使用方法法。 2实验验原理 革兰氏染染色法是是18884年由由丹麦病病理学家家ChrristtainnGraam氏创创立的，革革兰氏染染色法可可将所有有的细菌菌区分为为革兰氏氏阳性菌菌（G+）和革革兰氏阴阴性菌（GG-）两两大类。革革兰氏染染色法是是细菌学学中最重重要的鉴鉴别染色色法。革兰氏染染色法所所以能将将细菌分分为革兰兰氏阳性性和革兰兰氏阴性性，是由由这两类类细菌细细胞壁的的结构和和组成不不同决定定的。实实际上，当当用结晶晶紫初染染后，像像

28、简单染染色法一一样，所所有细菌菌都被染染成初染染剂的蓝蓝紫色。碘碘作为媒媒染剂，它它能与结结晶紫结结合成结结晶紫-碘的复复合物，从从而增强强了染料料与细菌菌的结合合力。当当用脱色色剂处理理时，两两类细菌菌的脱色色效果是是不同的的。革兰兰氏阳性性细菌的的细胞壁壁主要由由肽聚糖糖形成的的网状结结构组成成，壁厚厚、类脂脂质含量量低，用用乙醇(或丙酮酮)脱色色时细胞胞壁脱水水、使肽肽聚糖层层的网状状结构孔孔径缩小小，透性性降低，从从而使结结晶紫-碘的复复合物不不易被洗洗脱而保保留在细细胞内，经经脱色和和复染后后仍保留留初染剂剂的蓝紫紫色。革革兰氏阴阴性菌则则不同，由由于其细细胞壁肽肽聚糖层层较薄、类类

29、脂含量量高，所所以当脱脱色处理理时，类类脂质被被乙醇(或丙酮酮)溶解解，细胞胞壁透性性增大，使使结晶紫紫-碘的的复合物物比较容容易被洗洗脱出来来，用复复染剂复复染后，细细胞被染染上复染染剂的红红色。 3材料料 3.1菌种种 大肠杆菌菌（Esscheericchiaaccolii）约224h营营养琼脂脂斜面菌菌种一支支，枯草草芽孢杆杆菌（BBaciilluusssubttiliis）约约16hh牛肉膏膏琼脂斜斜面菌种种一支。 3.2染色色剂 结晶紫染染色液、卢卢戈氏碘碘液、995%乙乙醇、石石炭酸复复红液。3.3仪器器或其他他用具 显微镜、擦擦镜纸、接接种环、载载玻片、酒酒精灯、蒸蒸馏水、香香柏

30、油、二二甲苯。 4流程程 涂片干干燥固定染色（初初染媒染脱色复染）镜检。 5步步骤 5.1涂片片 5.1.1常规涂涂片法 取一洁净净的载玻玻片，用用特种笔笔在载玻玻片的左左右两侧侧标上菌菌号，并并在两端端各滴一一小滴蒸蒸馏水，以以无菌接接种环分分别挑取取少量菌菌体涂片片，干燥燥、固定定。玻片片要洁净净无油，否否则菌液液涂不开开。 5.2初染染 滴加结晶晶紫(以以刚好将将菌膜覆覆盖为宜宜)于两两个玻片片的涂面面上，染染色12miin，倾去去染色液液，细水水冲洗至至洗出液液为无色色，将载载玻片上上水甩净净。 5.3媒染染用卢戈氏氏碘液媒媒染约llminn，水洗洗。 5.4脱色色 用滤纸吸吸去玻片片

31、上的残残水，将将玻片倾倾斜，在在白色背背景下，用用滴管流流加955%的乙乙醇脱色色，直至至流出的的乙醇无无紫色时时，立即即水洗，终终止脱色色，将载载玻片上上水甩净净。 革兰氏染染色结果果是否正正确，乙乙醇脱色色是革兰兰氏染色色操作的的关键环环节。脱脱色不足足，阴性性菌被误误染成阳阳性菌，脱脱色过度度，阳性性菌被误误染成阴阴性菌。脱脱色时间间一般约约2030ss。 5.5复染染 在涂片上上滴加番番红液复复染约223mmin，水洗洗，然后后用吸水水纸吸干干。在染染色的过过程中，不不可使染染液干涸涸。 5.6镜检检 干燥后，用用油镜观观察。判判断两种种菌体染染色反应应性。菌菌体被染染成蓝紫紫色的是是

32、革兰氏氏阳性菌菌（G+），被被染成红红色的为为革兰氏氏阴性菌菌（G-）。5.7实验验结束后后处理 清洁显微微镜。先先用擦镜镜纸擦去去镜头上上的油，然然后再用用擦镜纸纸沾取少少许二甲甲苯擦去去镜头上上的残留留油迹，最最后用擦擦镜纸擦擦去残留留的二甲甲苯。染染色玻片片用洗衣衣粉水煮煮沸、清清洗，凉凉干后备备用。 三、实验验结果 1.根据据观察结结果，绘绘出两种种细菌的的形态图图。 2.列表表简述两两株细菌菌的染色色结果(菌的形形状、颜颜色和革革兰氏染染色反应应)。 四、思考考题1.哪哪些环节节会影响响革兰色色染色结结果的正正确性？其中最最关键的的环节是是什么？ 2. 进进行革兰兰氏染色色时，为为什

33、么特特别强调调菌龄不不能太老老，用老老龄细菌菌染色会会出现什什么问题题? 3. 革革兰氏染染色时，初初染前能能加碘液液吗?乙乙醇脱色色后复染染之前，革革兰氏阳阳性菌和和革兰氏氏阴性菌菌应分别别是什么么颜色? 4.不不经过复复染这一一步，能能否区别别革兰氏氏阳性菌菌和革兰兰氏阴性性菌？ 5.你你认为制制备细菌菌染色标标本时，应应该注意意哪些环环节? 6.为为什么要要求制片片完全干干燥后才才能用油油镜观察察? 7.如如果涂片片未经热热固定，将将会出现现什么问问题?加加热温度度过高、时时间太长长，又会会怎样呢呢? 实验三 培养养基的制制备和灭灭菌实验项目目性质：基础验验证实验验所属课程程名称：微生生

34、物学及及实验实验计划划学时：3学时时一、实验验目的1.了解解并掌握握培养基基的配制制、分装装方法；2.掌握握各种实实验室灭灭菌方法法及技术术。二、实验验原理 培养基是是供微生生物生长长、繁殖殖、代谢谢的混合合养料。由由于微生生物具有有不同的的营养类类型，对对营养物物质的要要求也各各不相同同，加之之实验和和研究的的目的不不同，所所以培养养基的种种类很多多，使用用的原料料也各有有差异，但但从营养养角度分分析，培培养基中中一般含含有微生生物所必必需的碳碳源、氮氮源、无无机盐、生生长素以以及水分分等。另另外，培培养基还还应具有有适宜的的pH值值、一定定的缓冲冲能力、一一定的氧氧化还原原电位及及合适的的

35、渗透压压。琼脂是从从石花菜菜等海藻藻中提取取的胶体体物质，是是应用最最广的凝凝固剂。加加琼脂制制成的培培养基在在981000下融化化，于445以下凝凝固。但但多次反反复融化化，其凝凝固性降降低。任何一种种培养基基一经制制成就应应及时彻彻底灭菌菌，以备备纯培养养用。一一般培养养基的灭灭菌采用用高压蒸蒸汽灭菌菌。三、实验验材料 1、器皿皿及材料料 天平、称称量纸、牛牛角匙、精精密pHH试纸、量量筒、刻刻度搪瓷瓷杯、试试管、三三角瓶、漏漏斗、分分装架、移移液管及及移液管管筒、培培养皿及及培养皿皿盒、玻玻璃棒、烧烧杯、试试管架、铁铁丝筐、剪剪刀、酒酒精灯、棉棉花、线线绳、牛牛皮纸或或报纸、纱纱布、乳乳

36、胶管、电电炉、灭灭菌锅、干干燥箱。 2、药品品试剂蛋白胨、牛牛肉膏、NNaCll、K22HPOO4、琼脂脂、NaaNO33、KCCl、MMgSOO4、FeeSO44、蔗糖糖、麦芽芽糖、木木糖、葡葡萄糖、半半乳糖、乳乳糖、土土豆汁、豆豆芽计、磷磷酸铵、55%NaaOH溶溶液、55%HCCl溶液液。 3、流程程 称药品溶解调pHH值融化琼琼脂过滤分分装包扎标标记灭菌摆斜面面或倒平平板。 四、实验验步骤 1培养养基的制制备 1.1称量量药品 根据培养养基配方方依次准准确称取取各种药药品，放放入适当当大小的的烧杯中中，琼脂脂不要加加入。蛋蛋白胨极极易吸潮潮，故称称量时要要迅速。 1.2溶解解 用量筒取

37、取一定量量(约占占总量的的1/22)蒸馏馏水倒入入烧杯中中，在放放有石棉棉网的电电炉上小小火加热热，并用用玻棒搅搅拌，以以防液体体溢出。待待各种药药品完全全溶解后后，停止止加热，补补足水分分。如果果配方中中有淀粉粉，则先先将淀粉粉用少量量冷水调调成糊状状，并在在火上加加热搅拌拌，然后后加足水水分及其其它原料料，待完完全溶化化后，补补足水分分。 1.3调节节pH 根据培养养基对ppH的要要求，用用5%NNaOHH或5%HC11溶液调调至所需需pH。测测定pHH可用ppH试纸纸或酸度度计等。 1.4溶化化琼脂 固体或半半固体培培养基须须加入一一定量琼琼脂。琼琼脂加入入后，置置电炉上上一面搅搅拌一面

38、面加热，直直至琼脂脂完全融融化后才才能停止止搅拌，并并补足水水分(水水需预热热)。注注意控制制火力不不要使培培养基溢溢出或烧烧焦。 1.5过滤滤分装 分装时注注意不要要使培养养基沾染染在管口口或瓶口口，以免免浸湿棉棉塞， 引起污污染。液液体分装装高度以以试管高高度的11/4左左右为宜宜。固体体分装量量为管高高的1/5，半半固体分分装试管管一般以以试管高高度的11/3为为宜；分分装三角角瓶，其其装量以以不超过过三角瓶瓶容积的的一半为为宜。 1.6包扎扎标记 培养基分分装后加加好棉塞塞或试管管帽，再再包上一一层防潮潮纸，用用棉绳系系好。在在包装纸纸上标明明培养基基名称，制制备组别别和姓名名、日期期

39、等。 1.7灭菌菌 上述培养养基应按按培养基基配方中中规定的的条件及及时进行行灭菌。普普通培养养基为112120mmin，以以保证灭灭菌效果果和不损损伤培养养基的有有效成份份。培养养基经灭灭菌后，如如需要作作斜面固固体培养养基，则则灭菌后后立即摆摆放成斜斜面，斜斜面长度度一般以以不超过过试管长长度的11/2为为宜；半半固体培培养基灭灭菌后，垂垂直冷凝凝成半固固体深层层琼脂。1.8倒倒平板 将需倒平平板的培培养基，于于水浴锅锅中冷却却到455500,立刻刻倒平板板。2 灭菌菌方法 灭菌是指指杀死或或消灭一一定环境境中的所所有微生生物，灭灭菌的方方法分物物理和化化学灭菌菌法两大大类。本本实验主主要

40、介绍绍物理方方法的一一种，即即加热灭灭菌。 加热灭菌菌包括湿湿热和干干热灭菌菌两种。通通过加热热使菌体体内蛋白质质凝固变变性，从从而达到到杀菌目目的。蛋蛋白质的的凝固变变性与其其自身含含水量有有关，含含水量越越高，其其凝固所所需要的的温度越越低。在在同一温温度下，湿湿热的杀杀菌效力力比干热热大，因因为在湿湿热情况况下，菌菌体吸收收水分，使使蛋白质质易于凝凝固；同同时湿热热的穿透透力强，可可增加灭灭菌效力力。 2.1湿湿热灭菌菌 煮沸消毒毒法 ：注射器器和解剖剖器械等等均可采采用此法法。先将将注射器器等用纱纱布包好好，然后后放进煮煮沸消毒毒器内加加水煮沸沸。对于于细菌的的营养体体煮沸约约1530

41、mmin，对对于芽孢孢则需煮煮沸约112hh。 高压蒸汽汽灭菌法法：高压压蒸汽灭灭菌用途途广，效效率高，是是微生物物学实验验中最常常用的灭灭菌方法法。这种种灭菌方方法是基基于水的的沸点随随着蒸汽汽压力的的升高而而升高的的原理设设计的。当当蒸汽压压力达到到1.005kgg/cmm2时，水水蒸气的的温度升升高到1121，经115330miin，可可全部杀杀死锅内内物品上上的各种种微生物物和它们们的孢子子或芽孢孢。一般般培养基基、玻璃璃器皿以以及传染染性标本本和工作作服等都都可应用用此法灭灭菌。 2.2操操作方法法和注意意事项 加水：打打开灭菌菌锅盖，向向锅内加加水到水水位线。立立式消毒毒锅最好好用

42、已煮煮开过的的水，以以便减少少水垢在在锅内的的积存。注注意水要要加够，防防止灭菌菌过程中中干锅。 装料、加加盖：灭灭菌材料料放好后后，关闭闭灭菌器器盖，采采用对角角式均匀匀拧紧锅锅盖上的的螺旋，使使蒸汽锅锅密闭，勿勿使漏气气。 排气：打打开排气气口(也也叫放气气阀)。用用电炉加加热，待待水煮沸沸后，水水蒸气和和空气一一起从排排气孔排排出，当当有大量量蒸汽排排出时，维维持5mmin，使使锅内冷冷空气完完全排净净。 升压、保保压和降降压：当当锅内冷冷空气排排净时，即即可关闭闭排气阀阀，压力力开始上上升。当当压力上上升至所所需压力力时，控控制电压压以维持持恒温，并并开始计计算灭菌菌时间，待待时间达达

43、到要求求（一般般培养基基和器皿皿灭菌控控制在1121，200minn）后，停停止加热热，待压压力降至至接近“0”时，打打开放气气阀。注注意不能能过早过过急地排排气，否否则会由由于瓶内内压力下下降的速速度比锅锅内慢而而造成瓶瓶内液体体冲出容容器之外外。 灭菌后的的培养基基空白培培养：灭灭菌后的的培养基基放于337培养箱箱中培养养，经224h培培养无菌菌生长，可可保存备备用；斜斜面培养养基取出出后，立立即摆成成斜面后后空白培培养；半半固体的的培养基基垂直放放置凝成成半固体体深层琼琼脂后，空空白培养养。 2.2干干热灭菌菌法 通过使用用干热空空气杀灭灭微生物物的方法法叫干热热灭菌。一一般是把把待灭菌

44、菌的物品品包装就就绪后，放放入电烘烘箱中烘烘烤，即即加热至至16001770维持112hh。 干热灭菌菌法常用用于空玻玻璃器皿皿、金属属器具的的灭菌。凡凡带有胶胶皮的物物品，液液体及固固体培养养基等都都不能用用此法灭灭菌。 2.2.1灭菌菌前的准准备 玻璃器皿皿等在灭灭菌前必必须经正正确包裹裹和加塞塞，以保保证玻璃璃器皿于于灭菌后后不被外外界杂菌菌所污染染。常用用玻璃器器皿的包包扎和加加塞方法法如下：平皿用用纸包扎扎或装在在金属平平皿筒内内；三角角瓶在棉棉塞与瓶瓶口外再再包以厚厚纸，用用棉绳以以活结扎扎紧，以以防灭菌菌后瓶口口被外部部杂菌所所污染；吸管以以拉直的的曲别针针一端放放在棉花花的中心

45、心，轻轻轻捅入管管口，松松紧必须须适中，管管口外露露的棉花花纤维统统一通过过火焰烧烧去，灭灭菌时将将吸管装装入金属属管筒内内进行灭灭菌，也也可用纸纸条斜着着从吸管管尖端包包起，逐逐步向上上卷，头头端的纸纸卷捏扁扁并拧几几下，再再将包好好的吸管管集中灭灭菌。 2.2.2干燥箱箱灭菌 将包扎好好的物品品放入干干燥烘箱箱内，注注意不要要摆放太太密，以以免妨碍碍空气流流通；不不得使器器皿与烘烘箱的内内层底板板直接接接触。将将烘箱的的温度升升至16601170并恒温温122h，注注意勿使使温度过过高，超超过1770，器皿皿外包裹裹的纸张张、棉花花会被烤烤焦燃烧烧。如果果是为了了烤干玻玻璃器皿皿，温度度为

46、1220持续330分钟钟即可。温温度降至至6070时方可可打开箱箱门，取取出物品品，否则则玻璃器器皿会因因骤冷而而爆裂。 用此法灭灭菌时，绝绝不能用用油、蜡蜡纸包扎扎物品。 2.2.3火焰灭灭菌 直接用火火焰灼烧烧灭菌，迅迅速彻底底。对于于接种环环，接种种针或其其它金属属用具，可可直接在在酒精灯灯火焰上上烧至红红热进行行灭菌。此此外，在在接种过过程中，试试管或三三角瓶口口，也采采用通过过火焰而而达到灭灭菌的目目的。 五、实验验结果 1、记录录各种不不同物品品所用的的灭菌方方法及灭灭菌条件件（温度度、压力力等）。 2、试述述高压蒸蒸汽灭菌菌的过程程及注意意事项。 六、思考考题 1、制备备培养基基的一般般程序是是什么？ 2、做过过本次实实验后，你你认为在在制备培培养基时时要注意意些什么么问题？ 3、灭菌菌在微生生物学实实验操作作中有何何重要意意义？ 4、试述述高压蒸蒸汽灭菌菌的操作作方法和和原理。 5、高压压蒸汽灭灭菌时应应注意哪哪些事项项？ 实验四 纯种种微生物物的分离离、转种种和培养养实验项目目性质：基础验验证性实实验所属课程程名称：微生生物学及及实验实验计划划学时：3学时时