微生物实验论文grct.docx

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1、微 生 物 实实 验 论 文文功能微生生物的筛筛选和选选育本 科 生：指导教师师：培养单位位：学科专业业：完成时间间：前言：微微生物与与我们的的生活息息息相关关，在生生产实践践中起着着重要的的作用。比如一些微生物被广泛应用于工业发酵，生产乙醇、食品及各种酶制剂等；一些微生物能够降解塑料、处理废水废气；另一些微生物能产生抗生素，被大量应用于生物制药领域微生物产业在21世纪将呈现全新的局面。微生物从发现到现在短短的300年间，特别是20世纪中叶，已在人类的生活和生产实践中得到广泛的应用，并形成了继动、植物两大生物产业后的第三大产业。这是以微生物的代谢产物和菌体本身为生产对象的生物产业，所用的微生物

2、主要是从自然界获得的高产菌种。那么如何从自然界中得到高产菌株呢？这就是接下来我要探讨的问题。摘要：本本论文通通过培养养基制备备及灭菌菌、菌种种分离纯纯化、菌菌种鉴定定、培养养条件优优化以及及诱变育育种等五五个实验验，从土土壤中筛筛选获得得产淀粉粉酶细菌菌和选育育高产菌菌株。从从而掌握握相关实实验技术术和方法法，学会会如何应应用这些些技术去去解决科科学实验验和生产产实践中中的具体体问题。关键词：筛选、选选育、诱诱变育种种、高产产菌株Absttracct: Thiis ppapeer tthrooughh cuultuure meddiumm prrepaarattionn annd ssterr

3、iliizattionn, iisollatiion purrifiicattionn, iidenntifficaatioon, opttimiizattionn off cuultuure conndittionns aand muttatiion breeediing of fivve eexpeerimmentts, scrreenned froom ssoill too obbtaiin aamyllasee prroduucedd baacteeriaa annd bbreeedinng hhighh yiieldd sttraiins. Inn orrderr too grras

4、pp thhe rrelaatedd exxperrimeentaal ttechhniqquess annd mmethhodss, llearrn hhow to appply theese tecchniiquees tto ssolvve sscieentiificc exxperrimeentss annd pprodducttionn prractticee off thhe sspeccifiic pprobblemms.Key worrds: sccreeeninng, breeediing, muutattionn brreeddingg, hhighh yiieldd st

5、traiin实验原理理：在自然然界的土土壤中存存在产淀淀粉酶的的细菌，通通过土样样悬液稀稀释涂布布和平板板划线分分离于含含有淀粉粉的培养养基上，诱诱导产生生淀粉酶酶。产淀淀粉酶的的细菌可可在菌落落周围水水解淀粉粉出现水水解圈。滴滴加碘液液，未水水解的淀淀粉呈蓝蓝色，水水解圈无无色。通通过计算算水解圈圈大小（HH）和菌菌落大小小（C）的的比值获获得产淀淀粉酶能能力强的的菌落。通过形态学鉴定和分子鉴定确定产淀粉酶菌株的种类。并将之转接于不同条件的液体摇瓶发酵培养基中培养一段时间后，计算淀粉酶酶活，得到最佳培养条件。然后在紫外线下照射，对诱变后的菌种进行筛选和复筛得到产淀粉酶的高产菌菌株。1材料和和

6、方法1.1样样品采集集分离样品品来源：20110年 11 月 115 日日于333幢宿舍舍楼下花花坛采集集土壤若若干，装装于信封封中。鉴别培养养基为淀淀粉培养养基、优优化培养养基为摇摇瓶发酵酵培养基基。1.2方方法1.2.1产胞胞外淀粉粉酶细菌菌的分离离和筛选选将新鲜土土样依次次稀释至至10-3、10-4 稀释度度，分别别涂布于于淀粉培培养基中中，再将将10-1 的土壤稀稀释液在在一块淀淀粉培养养基上进进行划线线分离，将将这3块块培养基基倒置于于恒温箱箱培养。24小时时后，选选取典型型细菌菌菌落，并并用记号号笔进行行编号。将将编号后后的菌落落用无菌菌牙签挑挑取，在在备用的的1块淀粉粉培养基基平

7、板上上分别点点种。在在3块淀粉粉培养基基滴加路路哥氏碘碘液显色色，观察察水解圈圈并测量量菌落大大小(CC) 和和水解圈圈大小(H) 。找到到水解圈圈最大的的1-22个菌落落和编号号，在对对应编号号的点种种平板上上做好标标记。将将点种平平板继续续置于330培养。1.2.2产淀淀粉酶菌菌种的鉴鉴定（一）产产淀粉酶酶待检菌菌的培养养特征与与形态特特征的观观察与鉴鉴定 首首先进行行培养特特征的观观察：菌菌落形状状与大小小，边缘缘，表面面，隆起起形状，透透明度，菌菌落与培培养基颜颜色等；再用显微微观察细细菌细胞胞：细胞胞形状是是杆状（长长杆或短短杆）还还是球状状？有无无芽孢？有无荚荚膜？最最后对细细菌进

8、行行革兰氏氏染色：是革兰兰氏阳性性菌还是是阴性菌菌。(二)细细菌的116S rDNNA分子子鉴定从平板上上取单菌菌落加入入20l无菌水水，1000加热100 miin。轻轻微离心心后，取取5l作为模模板。反应体系系：在一一个PCCR管中中用微量量移液枪枪依次加加入列物物质： TTaq buffferr（10）2.5l MMgCll2（25mmM） 1 l ddNTPP（2.55 mMM）2.55 l PPrimmer Forrwarrd（50 mM） 1 l PPrimmer Revversse（50 mmM） 11 l dddH22O 166.5 l rrTaqq（2U/l） 0.5 llP

9、CR反反应条件件：955预变性性5 mmin后后，955变性1 minn，59退火1mmin，72延伸1mmin，共共25个循循环，772延伸100minn。（三）琼琼脂糖凝凝胶电泳泳1.制胶胶：配制制0.77%琼脂脂糖溶液液20mmL，用用1TAEE电泳缓缓冲液做做溶剂，加加热溶解解，稍冷冷后，加加入模具具中，插插入梳子子，待胶胶凝固； 2.制样：PCRR反应结结束后，取取出PCCR管，吸吸取5 l与1l 66样品Buuffeer混合合后全部部点入浸浸于TAAE电泳泳缓冲液液中的琼琼脂糖凝凝胶的样样品孔中中； 3.电泳：1000V电泳泳20mmin； 4.染色：将凝胶胶置于样样品染料料溴化乙

10、乙锭中染染色；110miin，然然后将凝凝胶置于于紫外灯灯下进行行检测，当当在凝胶胶上出现现预期大大小的DDNA条条带（约约1.55Kb），则则认为是是PCRR阳性，这这时将与与此电泳泳样品对对应的PPCR反反应管放放置冰箱箱短期保保存。（四）PPCR扩扩增片段段测序获得的PPCR阳阳性样品品由专人人送往测测序公司司进行测测序，大大约一周周后测序序结果可可以返回回，然后后在电脑脑的相关关软件上上进行读读序。（五）序序列比对对分析使用NCCBI 网站对对待测菌菌的166SrDDNA 序列与与数据库库中各种种菌的116SrrDNAA 序列列进行比比对。登登陆htttp:/wwww.ncbbi.nn

11、lm.nihh.goov 美美国国立立生物技技术信息息中心网网站，使使用BLLASTTn 在在GenneBaank+EMBBL+DDDBJJ+PDDB 基基因库中中进行同同源性搜搜索。从从Gennebaank 中选择择近与待待测菌目目的基因因序列同同源性最最高的已已知分类类的菌株株的166SrRRNA基基因序列列, 初步步确定待待测菌的的分类位位置。用用Cluustaal软件件将已知知分类菌菌株的116SrrRNAA序列与与待测菌菌的166SrRRNA序序列进行行多序列列比较。1.2.3培养养条件的的优化（一）发发酵液接接提前244h将平平板菌种种用接种种环挑取取，在液液体试管管中打散散混匀，

12、然然后按00.5接种量量分别转转接如下下六种液液体摇瓶瓶发酵培培养基。1.pHH 4.0 22. ppH 77.23.碳源源淀粉44.碳源源葡萄糖糖5.氮源源硝酸钠钠6.氮源源硫酸铵铵(二)菌菌种保藏藏挑取平板板菌落，在在斜面试试管培养养基上划划线，330培养，然然后置冰冰箱低温温保藏。(三) 菌体生生长量的的测定将培养224h后后液体摇摇瓶培养养物分别别取出2mLL于试管管中，加加入8mmL蒸馏馏水，进进行5倍稀释释。将各各稀释液液分别倒倒入比色色杯中，在在7211型分光光光度计计6000nm波波长下测测定吸光光值(OOD6000值)。分别别记录各各种不同同培养基基和不同同培养条条件下OOD

13、6000值大大小，评评价对菌菌体生长长量的影影响。（四）不不同条件件对淀粉粉酶活性性的影响响测定加入试剂剂测定管空白管1的淀淀粉溶液液0.1mmL0.1mmL缓冲液0.1mmL0.1mmL摇匀后440恒温水水浴保温温5miin发酵液0.2mmL-蒸馏水-0.2mmL摇匀后440保温155minn乙酸溶液液0.5mmL0.5mmL80000rpmm离心5mmin取上清,加入1mmL稀碘碘液试管管中加蒸馏水水稀释至至10mmL计算淀粉粉酶酶活活：显色色后，立立即于6660nnm波长长测定其其吸光度度（A）。计计算各样样品吸光光度大小小酶活力力。即以以1mLL粗酶液液在400，pH66.0条条件下1

14、15miin所分分解0.1mgg的淀粉粉质量为为1个酶活活力单位位。 A空白管 A测定管A空白管（ ）115150.20.1100.1比较各发发酵菌液液酶活力力，判断断哪种培培养条件件下酶活活力最高高。1.2.4产淀淀粉酶菌菌种紫外外诱变育育种(一)菌菌种的活活化与接接种培养244 h后后，挑取取一环活活化菌株株，接种种至含110mll淀粉培培养基的的50mml三角角瓶中，于于25，1500 r/minn的摇床床中振荡荡培养。(二) 诱变1.菌悬悬液的制制备：取出培培养约224h 的摇瓶瓶，分别别取1mml菌悬悬液（吸吸取前三三角瓶要要摇匀）于于2个离离心管中中，50000 r/mmin离离心

15、5mmin，弃弃去上清清液，将将菌体用用无菌生生理盐水水洗涤22次，加加入1.5mll无菌生生理盐水水制成菌菌悬液。2.平板板制作：融化淀淀粉培养养基，倒倒4块平板板，在平平板上做做好标识识。3. 诱诱变处理理：(1)开开启紫外外灯预热热10-20 minn。(2)紫紫外处理理：取制制备好的的菌悬液液3 mmL 移移入6 cm的的无菌培培养皿中中，将上上述平皿皿置于紫紫外灯下下的脱色色摇床上上，打开开皿盖，距距离紫外外灯管330cmm，照射射3miin，盖盖上皿盖盖。(3)稀稀释菌液液：在超超净台内内，将照照射后的的菌悬液液用无菌菌水按110倍稀稀释法依依次稀释释成100-1-100-5（do

16、rrf管中中稀释）。(4) 涂布平平板：取取10-3、10-4（紫紫外照射射3miin）两两个稀释释度的菌菌悬液各各0.11ml涂涂布均匀匀。以同同样的操操作，取取未经紫紫外线处处理的菌菌悬液稀稀释涂布布平板作作为对照照。平板于337倒置培培养488 h(用黑布布包好平平板)。（三）计计算成活活率和致致死率1. 存存活率：将培养养48 h 后后的平板板取出进进行细胞胞计数。根根据平板板上菌落落数，计计算出对对照样品品1 mmL 菌菌液中的的活菌数数。2致死死率：将培养养48 h 后后的平板板取出进进行细胞胞计数。根根据平板板上菌落落数，计计算出对对照样品品1 mmL 菌菌液中的的活菌数数。（四

17、）观观察诱变变效应在平板菌菌类计数数后，分分别向菌菌落数在在5-6个左右右的平板板内加入入碘液，分分别测量量透明圈圈直径与与菌落直直径并计计算比值值(H/C值)，与对对照平板板进行比比较（紫紫外照射射和对照照组随机机选出66个算平平均值）。选取H/C 比比值大的的菌落移移接到新新鲜牛肉肉膏斜面面上培养养，用于于复筛。2结果与与分析2.1细菌的的分离与与鉴定：在100-33的培养养基上典典型的菌菌落有112个分分别编号号1112；在在10-4的的培养基基中有77个分别别编号为为1319；在划线线培养基基中有55个分别别编号为为2024。滴滴加碘液液显色后后发现55、133、177、188、211

18、的水解解圈明显显较大。计计算其HH/C值值得表如如下：菌落号513171821水解圈直直径(HH)mmm3.22.61.82.92.4菌落直径径(C)mm1.20.70.50.90.7H/C值值2.6773.7113.63.2223.433得13号号菌株为为最佳菌菌株。2.2 产淀粉酶酶菌种的的鉴定：形态特征征的观察察与鉴定定：菌落落为乳白白色，较较小，中中央有微微小隆起起，表面面较光滑滑。革兰兰氏染色色为紫色色，说明明为阳性性菌。显显微镜下下为长杆杆状，个个体较大大。琼脂凝胶胶电泳结结果：泳泳动较慢慢，说明明该菌的的DNAA分子的的分子量量较大。PCR扩扩增片段段测序：通过序序列比对对分析初

19、初步确定定为超大大芽孢杆杆菌。2.3培培养条件件的优化化：OD6000值计计算：测测得的OOD6000的值如下：试管号123456OD6000值0.72270.89950.79950.08870.71190.4883可得试管管、33、5中中的菌体体生长量量较大。淀粉酶酶酶活：测测得的淀淀粉酶酶酶活值如如下：离心管号号1234560空白管管）吸光度(A)1.03311.11161.13340.32210.74410.61181.1887淀粉酶活活性6.5771 2.9991 2.2333 36.4479 18.7787 23.9968 可得离心心管4、55、6的的淀粉酶酶的活性性较大。（在测量酶

20、活时由于把写有编号的试管塞取了下来，导致编号顺序错误，以上的编号为离心管的编号。根据另外几组的实验结果可得试管2、3、5的酶活比同组变量的大。）综合以上上两组数数据知：该菌株株的最佳佳培养条条件是440，PHH=7.2，氮氮源为硝酸钠钠，碳源为淀粉。2.4产产淀粉酶酶菌种紫紫外诱变变育种：经紫外照照射后的的10-3的的细菌存存活率为为72%和致死死率为228%，110-4的细细菌存活活率为333.333%和和致死率率为666.677%。紫外线照照射处理理结果:稀释度10-310-4菌落数218复筛得到到产淀粉粉酶的高高产菌株株。参考文献献：1 陈双林林等著. 袁生生主编微生物物学MM高高等教育育出版社社200092 胡宝龙龙等著周德庆庆主编微生物物学实验验教程M高等教教育出版版社2200663 （美）特特拉诺（TTalaaro,K.PP.）著著Kaathlleenn Paark Tallaroo主编微生物物学基础础M高等等教育出出版社200054 李根喜喜等著杨荣武武主编生物化化学原理理M高等等教育出出版