细胞工程实验指导-重庆邮电大学主15730.docx

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1、细胞工程程实验指指导目录实验室安安全守则则3实验操作作须知55实验一培培养基母母液的制制备8实验二培培养基的的配制与与灭菌112实验三培培养材料料灭菌和和接种116实验四愈愈伤组织织的诱导导与增殖殖19实验五愈愈伤组织织的分化化21实验六植植物细胞胞悬浮培培养与同同步化222实验七细细胞微室室培养223实验八原原生质体体培养224实验九烟烟草原生生质体融融合266实验十烟烟草叶片片组织培培养288实验十一一月季组组织培养养29实验十二二菊花组组织培养养与快速速繁殖330实验十三三马铃薯薯茎尖脱脱毒322实验十四四马铃薯薯试管微微薯的诱诱导333实验十五五小麦幼幼胚培养养34实验十六六小麦成成熟

2、胚培培养366实验十七七小麦花花药培养养38实验十八八生物反反应器中中芹菜体体胚发生生的大规规模培养养39实验十九九植物细细胞的生生长计量量技术441实验二十十烟草遗遗传转化化实验445实验二十十一细胞胞原代培培养466实验二十十二细胞胞传代培培养488实验二十十三细胞胞的冻存存和复苏苏49实验二十十四细胞胞的分裂裂指数551实验二十十五细胞胞周期的的测定552实验室安安全守则则一般规定定 1、上课课第一天天请先熟熟悉环境境，察看看紧急冲冲洗站、洗洗眼站、灭灭火器、急急救箱及及安全梯梯等的位位置，牢牢记“安全”是进行行任何实实验最重重要的准准则。 2、在实实验室內內请穿着着实验服服，避免免穿凉

3、鞋鞋、拖鞋鞋。留有有长发者者，戴帽帽套将头头发捲入入套內，或或以橡皮皮筋束于于后，以以防止引引火危险险或污染染实验。 3、在实实验室内内禁止吸吸烟、饮饮食、化化妆、嚼嚼口香糖糖、嬉戏戏奔跑，食食物饮料料勿存放放于实验验室的冰冰箱中，实实验桌上上勿堆放放书包、书书籍、衣衣服及杂杂物等。 4、所有有实验仪仪器、耗耗材、药药品等均均属实验验室所有有，不得得带出实实验室。每每组分配配的仪器器、耗材材请确定定清点与与保管，课课程结束束后如数数清点缴缴回。公公用仪器器请善加加爱惜使使用，实实验前后后，请把把工作区区域清理理擦拭，并并随时保保持环境境卫生。 5、实验验前详阅阅实验内内容，了了解实验验细节的的

4、原理及及操作规规程，注注意上课课所告知知的注意意事项。实实验进行行中有任任何状况况或疑问问，随时时发问，切切勿私自自变更实实验程序序。打翻翻任何药药品试剂剂及器皿皿时，请请随即清清理。实实验后，确确切记下下自己的的结果，严严禁抄袭袭，确定定关闭不不用的电电源、水水、酒精精灯及煤煤气等。 6、睡眠眠不足、精精神不济济或注意意力无法法集中，请请立即停停止实验验。实验验时间若若延长，请请注意时时间的管管制及自自身的安安全，不不可自行行逗留实实验室过过夜。 7、实验验完毕，请请清理实实验室、倒倒垃圾、灭灭菌、关关闭灯光光及电源源，离开开实验室室前记得得洗手。 8、任何何意外事事件应立立即报告告师长，并

5、并应熟知知相关的的应急措措施。 药品1、使用用任何药药品，请请先看清清楚标示示、注意意事项，翻翻阅物质质安全资资料表，查查明是否否对人体体造成伤伤害，使使用完毕毕请放回回原位。 2、新配配制的试试剂请清清楚注明明内溶物物、浓度度、注意意事事项项及配制制日期，为为避免污污染，勿勿将未用用完的药药剂倒回回容器内内。 3、挥发发性、腐腐蚀性、有有毒溶剂剂（如甲甲醇、丙丙酮、醋醋酸、氯氯仿、盐盐酸、硫硫酸、bb-meercaaptooethhanool、酚酚等）要要在通风风橱中戴戴手套量量取配制制，取用用完后随随即盖好好盖子，若若不小心心打翻试试剂，马马上处理理。 4、有毒毒、致癌癌药剂例例如accr

6、yllamiide（神神经毒）、eethiidiuum bbrommidee（突变变剂）、SSDS、秋秋水仙素素请戴手手套及口口罩取用用，并勿勿到处污污染，脱脱下手套套后，应应养成洗洗手的好好习惯。 5、接触触到病原原材料或或细菌，应应迅速消消毒。所所有被污污染的物物品，在在丢弃或或重复使使用前均均需先灭灭菌，固固体培养养基不得得倒入水水槽或下下水道中中。 6、使用用刻度吸吸管取物物时，切切勿用嘴嘴吸取，请请用自动动吸管或或安全吸吸球。 仪器1、使用用仪器前前先了解解其性能能、配置置及正确确操作方方法，零零件及附附件严禁禁拆卸，勿勿私自调调整，并并注意插插座电压压（1110V或或2200V）之

7、之类别。 2、使用用离心机机时，离离心管要要两两对对称、重重量平衡衡，锁紧紧离心机机转陀。冷冷冻离心心机于开开机状态态时，务务必盖紧紧盖子，以以保持离离心槽之之低温并并避免结结霜。 3、实验验时不要要用潮湿湿有汗的的手去操操作电器器，不要要用手紧紧握可能能荷电的的电器，不不应以两两手同时时触及电电器，电电器设备备外壳均均应接地地。万一一不慎发发生触电电事故，应应立即切切断电源源开关，对对触电者者采取急急救措施施。4、使用用微波炉炉加热时时，不可可有铝箔箔等金属属物品，瓶瓶盖必须须松开，以以免爆炸炸。加热热后戴防防热手套套取出瓶瓶子。5、使用用UV灯灯时，不不要以眼眼睛直视视UV，应应隔着挡挡板

8、观察察，完毕毕立即关关灯。 6、超净净工作台台內的酒酒精有机机溶剂及及易燃物物（如甲甲醇、乙乙醇、乙乙醚、瓦瓦斯等）要要远离火火苗，不不可留置置火焰燃燃烧，万万一着火火，应力力持镇定定，沉着着处理。酒酒精或乙乙醚等着着火时，应应使用泡泡沫灭火火剂或湿湿毛巾覆覆盖，勿勿使用水水冲洗。 7、使用用震荡器器震荡培培养时，注注意三角角瓶务必必对称放放置，并并用橡皮皮筋等夹夹紧，勿勿使其摇摇晃摔出出台面，否否则需拆拆开并清清除玻璃璃碎片与与培养液液。 急救措施施1、急性性呼吸系系统中毒毒：应使使中毒者者迅速离离开现场场，移到到通风良良好的地地方，呼呼吸新鲜鲜空气。如如有休克克、虚脱脱或心肺肺机能不不全，

9、必必须先作作抗休克克处理，如如人工呼呼吸、给给予氧气气、喝兴兴奋剂（如如浓茶，咖咖啡）等等。2、经由由口服而而中毒：需立即即用3-5%小小苏打溶溶液或11：50000高锰锰酸钾溶溶液洗胃胃，洗胃胃时要大大量地喝喝，边喝喝边使之之呕吐，最最简单的的催吐办办法是用用手指或或筷子压压舌根，或或给中毒毒者喝少少量（115-225毫升升）1%硫酸铜铜或硫酸酸锌溶液液（催吐吐剂）。使使之迅速速将毒物物吐出。洗洗胃要反反复进行行多次，直直至吐出出物中基基本无毒毒物为止止。再服服解毒剂剂，一般般解毒剂剂有鸡蛋蛋清、牛牛奶、淀淀粉糊、桔桔子汁等等。另外外有些特特殊解毒毒剂专对对某种中中毒而用用。如磷磷中毒时时用

10、硫酸酸铜，钡钡中毒时时用硫酸酸钠，氰氰化物中中毒时用用硫代硫硫酸钠等等。3、皮肤肤、眼、鼻鼻、咽喉喉受毒物物侵害时时，应立立即用大大量自来来水冲洗洗，然后后送医院院请各专专科医生生处理。4、一度度烧伤：只损伤伤表皮，皮皮肤呈红红斑，微微痛，微微肿，无无水泡。如如被化学学药品烧烧伤，应应立即用用大量水水冲洗，除除去残留留在创面面上的化化学物质质，并用用冷水浸浸沐伤处处，可减减轻疼痛痛，最后后需要消消毒，保保护创面面不受感感染。 5、二二度烧伤伤：损伤伤表皮及及真皮层层，皮肤肤起水泡泡，疼痛痛，水肿肿明显。创创面如污污染严重重，先用用清水或或生理盐盐水冲洗洗，再以以1：10000新洁洁尔灭消消毒，

11、不不要挑破破水泡，用用消毒纱纱布轻轻轻包扎好好，请医医生治疗疗。 6、三三度烧伤伤：损伤伤皮肤全全层，包包括皮下下组织，肌肌肉，骨骨骼，创创面呈灰灰白色或或焦黄色色，无水水泡，不不痛，感感觉消失失。在送送医院前前，主要要防止感感染和休休克，可可用消毒毒纱布轻轻轻包扎扎好，给给伤者保保暖和供供氧，必必要时注注射吗啡啡止痛。7、炸伤伤：其急救救措施基基本同烧烧伤处理理。但炸炸伤后伤伤口往往往大量出出血，应应立即将将伤口上上部扎紧紧，防止止流血过过多。如如发生昏昏迷、休休克等，应应进行人人工呼吸吸，给氧氧，并送送医院治治疗。8、电击击伤：急急救时首首先使触触电者脱脱离电源源，为此此可拉下下电闸或或用

12、木棍棍将触电电者从电电源上拨拨开。当当心别把把触电者者摔伤。断断开电源源后，检检查伤员员呼吸和和心跳情情况，若若呼吸停停止，立立即进行行人工呼呼吸。对对心跳亦亦停止者者要同时时进行心心脏挤压压。电击击伤比较较轻微者者，很快快能恢复复健康，重重者必需需请医生生治疗。应应该注意意，触电电者在进进行急救救时，一一般不要要注射强强心针和和喝兴奋奋剂。实验操作作须知1、实验验室设计计与要求求实验室设设计是由由工作的的目的和和规模决决定的，要要合理布布局，通通常按自自然工作作程序先先后安排排成一条条连续的的生产线线，避免免有的环环节倒排排增加日日后工作作的负担担或引起起混乱。房房屋可规规划为洗洗涤室、灭灭

13、菌室、配配制室、无无菌操作作室、培培养室、鉴鉴定室、驯驯化移栽栽室等。1. 11准备室室需备有的的设备有有：鼓风风干燥箱箱、落水水架、工工作台、水水池、水水桶、水水盆、试试管刷等等，主要要用于玻玻璃器皿皿、用具具和培养养材料清清洗；还还需要有有高压水水龙头用用于冲洗洗。1.2灭灭菌室需备有高高压蒸汽汽灭菌装装置、细细菌过滤滤器、用用于培养养基及培培养器械械的灭菌菌。1.3配配制室需备有冰冰箱、化化学实验验台、药药品柜、器器械柜、物物品存放放架以及及各种玻玻璃器皿皿和用具具，包括括各种不不同容积积的容量量瓶、烧烧杯、量量筒、移移液管、三三角瓶、磨磨口瓶、广广口瓶、各各种类型型培养瓶瓶、玻璃璃棒、

14、移移液管架架、试管管刷、电电炉、微微波炉等等。1.4无无菌操作作室(接种室室) 无菌操作作室在工工作方便便的前提提下，宜宜小不宜宜大，宜宜精细密密闭，忌忌粗陋放放散，是是植物组组织培养养研究或或生产工工作中最最关键的的部分，关关系到培培养物的的污染率率，接种种工作效效率等重重要指标标。要求求如下:(1)地地面、天天花板及及四壁尽尽可能光光洁、避避免积染染灰尘，易易于采取取各种清清洁措施施。(2)干干爽、安安静、清清洁明亮亮，在适适当的位位置吊装装紫外灯灯1-22盏，用用以经常常照射灭灭菌，使使室内保保持良好好的无菌菌、低密密度有菌菌状态。(3)最最好安置置一小型型空调机机，使室室内温度度保持在

15、在26左右，这这样就可可以在工工作时或或不工作作时都把把工作室室的门窗窗紧闭，保保持与外外界相对对隔绝的的状态，尽尽量减少少与外界界的空气气对流，减减少尘埃埃与微生生物侵入入。(4)经经常采用用消毒措措施，达达到较高高的无菌菌水平，以以利完全全操作提提高工作作的质量量与效率率。(5)无无菌室外外应留有有缓冲间间，进入入无菌室室前在此此更衣换换鞋洗手手及处理理外界采采回准备备消毒培培养的材材料等。无菌操作作室应备备有超净净工作台台或接种种箱、固固定式载载物台、移移动式载载物台、广广口瓶、酒酒精灯、纱纱布、器器械支架架、手术术剪、解解剖刀、解解剖针、镊镊子等。1.5培培养室应尽量安安排在楼楼层较高

16、高处，以以利于采采光，减减少尘埃埃和杂菌菌污染的的机会。此此外应考考虑清洁洁、干燥燥，培养养室保温温隔热。培培养室中中距离窗窗户较远远处的培培养架应应适当安安装人工工辅助照照明的日日光灯。应应设计能能有效通通风的窗窗户、定定期或需需要时加加强通风风散热，如如在室内内地板稍稍高处设设置进风风气窗，在在气窗的的对侧近近天花板板设置排排风窗，也也可安装装小功率率的排风风扇。室内应备备有制冷冷设备、加加热设备备、控光光设备、固固定式培培养架、旋旋转式培培养架、摇摇床等。1.6鉴鉴定室需备有高高倍显微微镜、倒倒置显微微镜、相相差显微微镜、解解剖镜、恒恒温箱、切切片机、烤烤片台、恒恒温水浴浴、滴瓶瓶、染色

17、色缸、载载玻片、盖盖玻片等等。1.7驯驯化移植植室应备有温温室、弥弥雾装置置、荫棚棚、移植植床、钵钵、盆、塑塑料布、草草炭、蛭蛭石、粗粗沙等，用用于试管管小植株株的锻炼炼和移植植。2、操作作前的准准备工作作接种室在在接种前前4-55 d必必须通风风换气。在在接种前前一天对对接种室室进行全全面消毒毒，一般般用400%福尔尔马林进进行全面面喷雾，并并密闭224 hh，然后后打开换换气窗110-115 mmin.。接种前11 h打打开超净净工作台台和棚面面的紫外外灯照射射30 minn。杀菌结束束后，先先关掉棚棚面的紫紫外灯，再再打开风风机，最最后关掉掉超净工工作台上上的紫外外灯。在在接种后后体息时

18、时，要先先打开台台面的紫紫外灯，再再关风机机，最后后打开棚棚面紫外外灯。不不能将风风机与台台面上的的紫外灯灯同时关关闭或先先关闭风风机再开开紫外灯灯。不可可穿工作作服离开开接种室室，接种种期间两两边的门门切记要要关闭。3、准备备进台进入接种种室前，应应先将手手表、手手镯、戒戒子、耳耳环等放放在室外外，将手手和手腕腕用肥皂皂洗净后后才能进进入接种种室，并并用755%酒精精纱布擦擦拭双手手、双腕腕(此纱布布置于超超净工作作台外烧烧杯内，并并适时注注入酒精精)之后换换上消毒毒的工作作服、帽帽子、口口罩(盖上鼻鼻子和嘴嘴、着装装时注意意头发不不得置于于帽子外外，袖口口用皮筋筋扎紧)，进入入台内。操作前

19、用用台内的的酒精棉棉团擦拭拭手、手手腕，再再擦培养养基和超超净工作作台，一一般按如如下顺序序擦拭培培养瓶：瓶的棉棉塞、瓶瓶身、瓶瓶底，彻彻底擦拭拭后放入入超净工工作台。4、接种种操作4.1、剪剪、镊消消毒每次取出出时剪口口并拢，不不可接触触磨口瓶瓶和其它它器皿，并并保持尖尖端向下下;剪、镊镊分别在在酒精灯灯外焰彻彻底灼烧烧，烧时时将剪口口镊口张张开，烧烧至剪、镊镊上部，火火焰熄灭灭后，插插回磨口口瓶。4.2、用用上述消消毒过的的器械，将将切割好好的外植植体插植植到培养养基表面面上，具具体操作作是：(1)左左手拿三三角瓶，解解开包头头纸，将将三角瓶瓶几乎水水平拿着着，靠近近酒精灯灯焰，将将瓶口外

20、外部在灯灯焰上燎燎数秒钟钟，使瓶瓶口的水水气散发发掉。(2)右右手小指指和无名名指配合合手掌将将棉塞在在灯焰附附近慢慢慢拔出，以以免空气气速向瓶瓶内冲击击，引起起瓶口灰灰尘等冲冲入，造造成污染染。(3)棉棉塞始终终夹在右右手两手手指之间间，这时时再将瓶瓶口在灯灯焰上旋旋转，使使充分灼灼烧灭菌菌。(4)用用右手大大、食、中中指拿镊镊子夹一一块外植植体送入入瓶内轻轻轻的插插入培养养基中，镊镊子灼烧烧后放回回磨口瓶瓶，再把把棉塞在在灯焰上上灼燎数数秒，灼灼燎时应应旋转，避避免烧坏坏，塞好好棉塞，包包上报纸纸，便完完成了第第一瓶的的操作，接接着再做做第二瓶瓶，如此此直到外外植体全全部接完完。操作中必必

21、须遵守守的事项项：（1）棉棉塞不能能乱放。手手拿的部部分限于于棉塞膨膨大的上上半部分分，塞入入瓶口的的那一段段始终悬悬空，并并不要碰碰到其它它任何物物体；若若是螺旋旋盖或薄薄膜，则则应解下下放置在在灭过菌菌的台面面上，放放置处应应随时用用酒精棉棉团涂抹抹灭菌。（2）操操作人员员的头、胳胳膊等不不得进入入台内。（3）操操作人员员不得随随意谈话话、说笑笑，以免免造成污污染。（4）台台外人员员走动要要轻、动动作要小小。（5）接接种完毕毕后注意意标明接接种材料料名称、日日期、处处理。5、培养养器材的的清洗在细胞工工程实验验中，离离体细胞胞对任何何毒性物物质都十十分敏感感。毒性性物质包包括解体体的微生生

22、物和细细胞残余余物以及及非营养养的化学学物质。某某些化学学物质仅仅0.001g/LL就会对对细胞产产生毒性性作用，因因此对培培养器皿皿的清洗洗是组织织培养中中一项极极为重要要的环节节。5.1、玻玻璃器皿皿浸泡初次次使用和和培养后后的玻璃璃器皿都都需用水水浸泡。新新用的玻玻璃器皿皿，常带带有许多多干涸在在上面的的灰尘，同同时又由由于生产产的原因因，常呈呈碱性并并带有一一些对细细胞有毒毒性的物物质，如如铅和砷砷等。在在使用前前要经稀稀盐酸（5%）浸泡，中和其中的碱性物质便于清洗。用过的玻璃器皿往往带有大量蛋白质附着，干涸后不易刷洗掉，故用后要立即用清水浸泡。刷洗浸泡泡后的玻玻璃器皿皿一般仍仍然要用

23、用毛刷沾沾洗涤剂剂洗去玻玻璃器皿皿上的杂杂质。刷刷洗次数数太多，会会损害器器皿的表表面光洁洁度，洗洗涤剂有有使pHH上升的的趋势，所所以宜选选用软毛毛刷和优优质的洗洗涤剂。禁禁用去污污粉，因因其含有有沙粒，会会严重破破坏玻璃璃器皿的的光洁。酸洗刷洗洗不掉的的极微量量杂质经经过洗液液的强氧氧化作用用可被除除掉。洗洗液对玻玻璃器皿皿无腐蚀蚀作用，去去污十分分有效，是是清洗过过程中最最关键的的一环。洗洗液是由由重铬酸酸钾、浓浓硫酸和和水按一一定比例例配制而而成，浸浸泡时，器器皿要充充满洗液液。常用用的洗液液配方见见附表一一。冲洗刷洗洗和洗液液浸泡后后都必须须用水充充分冲洗洗，不留留任何残残迹，然然后

24、用蒸蒸馏水漂漂洗23次，凉凉干备用用。5.2 塑料料器皿塑料器皿皿耐腐蚀蚀能力强强，但质质地较软软，且不不耐热，因因此它和和玻璃器器皿清洗洗不同。通通常的方方法是：先用清清水充分分浸泡和和冲洗；再用22%NaaOH溶溶液浸泡泡过夜，自自来水冲冲洗，然然后用55%稀盐盐酸浸泡泡30分钟钟，再用用自来水水冲洗，最最后用蒸蒸馏水漂漂洗3次，晾晾干备用用。5.3 滤器玻璃滤器器与玻璃璃器皿清清洗相同同。无论论是浸泡泡还是酸酸浸，都都可用抽抽滤法。1） 使用后后，立即即将清水水注入滤滤器，抽抽气过滤滤，反复复抽滤55次。2） 干净铬铬硫酸洗洗液或热热浓硫酸酸注入滤滤器，抽抽气过滤滤至酸液液滤过完完毕。3

25、） 用清水水再次抽抽滤100次。4） 蒸馏水水抽气过过滤3次。蔡氏滤器器使用后后弃去石石棉滤膜膜，金属属部分刷刷洗干净净，最后后用蒸馏馏水漂洗洗233次，晾晾干备用用。新购置的的胶塞带带有大量量滑石粉粉，先用用自来水水冲洗干干净，常常规处理理，每次次用后的的胶塞用用水浸泡泡，然后后用2%NaOOH煮沸沸15mmin左左右，自自来水冲冲洗，再再用1%稀盐酸酸浸泡330miin，最最后用自自来水冲冲洗和蒸蒸馏水漂漂洗，晾晾干后备备用。实验一培培养基母母液的制制备一、实实验目的的与意义义学习和掌掌握培养养基母液液的配制制方法。在配制培培养基前前，为了了使用方方便和用用量准确确，常常常将大量量元素、微

26、微量元素素、铁盐盐、有机机物质、激激素类分分别配制制成比培培养基配配方需要要量大若若干倍的的母液。当当配制培培养基时时，只需需要按预预先计算算好的量量吸取母母液即可可。二、实验验器材电光分析析天平（感感量为00.00001gg）、扭扭力天平平（感量量为0.01gg）、台台秤（感感量0.5g）、烧烧杯（5500mml、1000ml、50mml）、容容量瓶（1000ml、100 ml、50 ml、25 ml）、细口瓶（1000 ml、100 ml、50 ml、25 ml）、药勺、玻璃棒、电炉。三、实验验药品NH4NNO3、KNNO3、CaCCl22HH2O、MggSO447HH2O、KH2PO4、

27、KII、 HH3BO3、 MnnSO444HH2O、 ZnnSO447H2O、 Naa2MoOO42HH2O、CuSSO45HH2O、CoCCl26HH2O、FeSSO47HH2O、Na2-EDDTA2H22O、肌肌醇、烟烟酸、盐酸吡吡哆醇(维生素素B6)、盐酸酸硫胺素素(维生素素B1)、甘甘氨酸。四、实验验步骤1、大量量元素母母液的配配制各成分按按照表11培养基基浓度含含量扩大大10倍，用用感量为为0.001g的的扭力天天平称取取，用蒸蒸馏水分分别溶解解，按顺顺序逐步步混合。后后用蒸馏馏水定容容到10000mml的容容量瓶中中，即为为10倍的的大量元元素母液液。到入入细口瓶瓶，贴好好标签保保

28、存于冰冰箱中。配配制培养养基时，每每配1LL培养基基取此液液1000ml。表1 MMS培养养基大量量元素母母液制备备序号药品名称称培养基浓浓度（mmg/LL）扩大100称量(mmg)1NH4NNO316500165000蒸馏水定定容至110000ml2KNO33190001900003CaCll22HH2O440440004MgSOO47HH2O370370005KH2PPO417017000注意：(1) 配制大大量元素素母液时时，某些些无机成成分如CCa2+、SO42一、Mg 2十和H2PO4一等在一一起可能能发生化化学反应应，产生生沉淀物物。为避避免此现现象发生生，母液液配制时时要用纯纯度

29、高的的重蒸馏馏水溶解解，药品品采用等等级较高高的分析析纯，各各种化学学药品必必须先以以少量重重蒸馏水水使其充充分溶解解后才能能混合，混混合时应应注意先先后顺序序。特别别应将CCa2+、SO42一、Mg 2十和H2PO4一等离子子错开混混合，速速度宜慢慢，边搅搅拌边混混合。(2)CCaCll22HH2O要在最最后单独独加入，在在溶解CCaCll22HH2O时，蒸蒸馏水需需加热沸沸腾，除除去水中中的COO2，以防防沉淀。另另外，CCaCll22HH2O放入沸沸水中易易沸腾，操操作时要要防止其其溢出。、微量量元素母母液的配配制MS培养养基的微微量元素素无机盐盐由7种化合合物（除除Fe）组成成。微量量

30、元素用用量较少少，特别别是CCuSOO45HH2O、CooCl226HH2O，因因此在配配制中分分微量、配制。按按照表22，表3配方，用用感量为为0.000011g的电电光分析析天平称称量，其其它同大大量元素素。配制制培养基基时，每每配制11L培养养基，取取微量10mml，微微量ml表2 MSS培养基基微量的配制制序号化合物名名称培养基浓浓度（mmg/LL）扩大1000倍称称量(mmg)1MnSOO44HH2O22.33223002ZnSOO47HH2O8.68603H3BOO36.26204KI0.833835Na2MMoO442HH2O02525表3 MSS培养基基微量的配制制序号化合物名

31、名称培养基浓浓度（mmg/LL）扩大10000倍倍称量(mg)1CuSOO45HH2O0.0225252CoCll26HH2O0.022525注意：使用电子子分析天天平时注注意不要要把药品品撒到称称盘上，用用完以后后，用吸吸耳球将将天平内内的脏物物清理干干净。3、铁盐盐母液的的配制铁盐不是是都需要要单独配配成母液液，如柠柠檬酸铁铁，只需需和大量量元素一一起配成成母液即即可。目目前常用用的铁盐盐是硫酸酸亚铁和和乙二胺胺四乙酸酸二钠的的螯合物物，必须须单独配配成母液液。这种种螯合物物使用起起来方便便，又比比较稳定定，不易易发生沉沉淀。配配制方法法同上，直直接用蒸蒸馏水加加热搅拌拌溶解。配配制培养养

32、基时，配配制1LL取此液液10mml。表4 MS铁铁盐母液液的配制制序号化合物名名称培养基浓浓度（mmg/LL）扩大1000倍称称量(mmg)1Na2-EDTTA37.33373002FeSOO47HH2O27.8827800注意：在配制铁铁盐时，如如果加热热搅拌时时间过短短，会造造成Fee S 04和Na2EDTTA鳌合合不彻底底，此时时若将其其冷藏，Fe S 04会结晶析出。为避免此现象发生，配制铁盐母液时，Fe S 04和Na2EDTA应分别加热溶解后混合，并置于加热搅拌器上不断搅拌至溶液呈金黄色(约加热20 - 30 min)，调pH值至5 .5，室温放置冷却后，再冷藏。4、有机机母液

33、的的配制MS培养养基的有有机成分分有甘氨氨酸、肌肌醇、烟烟酸、盐盐酸硫胺胺素和盐盐酸吡哆哆素。培培养基中中的有机机成分原原则上应应分别单单独配制制。配制制直接用用蒸馏水水溶解，注注意称量量时用电电子分析析天平。注意：由于维生生素母液液营养丰丰富，因因此贮藏藏时极易易染菌。被被菌类污污染的维维生素母母液，有有效浓度度降低，并并且易给给后期培培养造成成伤害，不不宜再用用。避免免此现象象发生的的方法是是:配制母母液时用用无菌重重蒸馏水水溶解维维生素，并并贮存在在棕色无无菌瓶中中，或缩缩短贮藏藏时间。表5 MSS培养基基有机物物质母液液的制备备序号化合物名称培养基浓浓度（mmg/LL）扩大倍数称量(m

34、g)配制体积积(L)1甘氨酸25001000.12肌醇100200200000.13盐酸硫胺胺素(VVB1)0.410000400.14盐酸吡哆哆素(VVB6)0.510000500.15烟酸0.510000500.15、激素素母液配配制植物组织织培养中中使用的的激素种种类及含含量需要要根据不不同的研研究目的的而定。一一般激素素母液的的配制的的终浓度度以0.5mgg/mll为好，需需要注意意的是：（）配配制生长长素类，例例如IAAA、NAAA、2.44-D、IBAA，应先先用少量量95%乙醇或或无水乙乙醇充分分溶解，或或者用11moll/L的的NaOOH溶解解，然后后用蒸馏馏水定容容到一定定的

35、浓度度。（）细细胞分裂裂素，例例如KTT，应先先用少量量95%乙醇或或无水乙乙醇加334滴滴1mool/LL的盐酸酸溶解，再再用蒸馏馏水定容容。（）配配制生物物素，用用稀氨水水溶解，然然后定容容。注意：所有的母母液都应应保存在在044冰箱中中，若母母液出现现沉淀或或霉团则则不能继继续使用用。五、思考考题：1、 配制母母液时为为什么要要按顺序序加入各各药品？溶解CCaCll22HH2O时，为为什么要要将蒸馏馏水加热热？2、 根据所所给母液液浓度、蔗蔗糖、琼琼脂用量量、pHH值，按按给出的的培养基基配方计计算各种种母液吸吸取量，填填入下表表。培养基配配方：MMS+KKT1.0+BBA2.0+NNA

36、A00.2+蔗糖3%+琼脂脂0.77%，pH55.8。表6 按上述述配方计计算各种种母液吸吸取量并并填入下下表药品名称称母液浓度度1L培养养基母液液吸取量量0.3LL培养基基母液吸吸取量大量元素素10倍液液微量元素素100倍倍液微量元素素10000倍液铁盐100倍倍液VB10.4mmg/mmlVB60.5mmg/mml烟酸0.5mmg/mmlGly1mg/ml肌醇20mgg/mllBA0.5mmg/mmlKT0.5mmg/mmlNAA0.5mmg/mml蔗糖琼脂PH值5.8实验二培培养基的的配制与与灭菌一、实验验目的与与意义学习培养养基配制制与灭菌菌的操作作方法。对植植物外植植体进行行离体培培

37、养时，要要依靠培培养基提提供生长长所需的的营养成成分。不不同材料料对培养养基的要要求不同同，适当当的设计计和选用用培养基基，对植植物组织织培养取取得成功功至关重重要的。另另外，对对组织培培养物的的脱分化化和再分分化等状状态的调调控，次次生代谢谢产物的的生产等等都是通通过调节节培养基基成分来来实现的的。培养养基的主主要成分分包括无无机营养养物质、碳碳源、有有机物质质、植物物生长物物质等。二、实验验器材天平、烧烧杯（110000ml）、医医用瓷缸缸（10000 ml）、三三角瓶、量量筒（1100mml）、移移液管、玻玻璃棒、pH试纸、吸耳球、线绳、封口膜、石棉网。三、实验验药品蔗糖、琼琼脂、11m

38、oll/L NaOOH、HCll、各种种培养基基母液。四、实验验步骤（一） 培养基基配制（以以1L MS培培养基为为例）1、计量量 根据配制制培养基基的量和和母液的的浓度计计算需要要吸取母母液的量量，计算算公式：吸取量量 mll=培养养基中物物质的含含量（mmg/LL）10000mll/母液液浓度（mmg/LL）。2、移液液取医用瓷瓷缸一只只，按照照计算吸吸取母液液的量依依次吸取取各母液液置于医医用瓷量量杯中备备用。注意：在使用用提前配配制的母母液时，应应在量取取各种母母液之前前，轻轻轻摇动盛盛放母液液的瓶子子，如果果发现瓶瓶中有沉沉淀、悬悬浮物或或被微生生物污染染，应立立即淘汰汰这种母母液，

39、重重新进行行配制。用量筒筒或移液液管量取取培养基基母液之之前，必必须用所所量取的的母液将将量筒或或移液管管润洗22次。量取母母液时，最最好将各各种母液液按将要要量取的的顺序写写在纸上上，量取取1种，划掉掉1种，以以免出错错；移液管管不能混混用。3、称取取称取8gg琼脂，330g蔗蔗糖备用用4、融化化用搪瓷量量杯量取取60007000mll的蒸馏馏水放在在电炉上上，加入入琼脂，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状将其取下，加入蔗糖。注意：在加热琼琼脂、制制备培养养基的过过程中，操操作者千千万不能能离开，否否则沸腾腾的琼脂脂外溢，就就需要重重新称量量、制备备。此外外，如果果没有搪搪瓷量杯杯，可

40、用用大烧杯杯代替。但但要注意意大烧杯杯底的外外表面不不能沾水水，否则则加热时时烧杯容容易炸裂裂，使溶溶液外溢溢，造成成烫伤。5、混合合将融化的的琼脂和和母液充充分混合合，用蒸蒸馏水定定容到110000ml，来来回混合合几次。6、调ppH用滴管吸吸取物质质的量浓浓度为11 mool/LL的NaaOH或或HCll溶液，逐逐滴滴入入溶化的的培养基基中，边边滴边搅搅拌，并并随时用用精密的的pH试试纸(55.47.00)测培培养基的的pH，一一直到培培养基的的pH达达到要求求为止(在调制制时要比比目标ppH值偏偏高0.200.5个个单位，因因为培养养基在灭灭菌过程程中由于于糖等物物质的降降解，ppH值会

41、会下降00.20.55个单位位左右)。注意：调至时要要用玻璃璃棒不停停的搅拌拌,使其其充分混混合。7、分装装溶化的培培养基应应该趁热热分装。分分装时，先先将培养养基倒入入烧杯中中，然后后将烧杯杯中的培培养基倒倒入锥形形瓶(550 mml或1100 ml)中。注注意不要要让培养养基沾到到瓶口和和瓶壁上上。锥形形瓶中培培养基的的量约为为锥形瓶瓶容量的的1/551/4。每每1L培培养基，可可分装225330瓶。8、包扎扎用封口膜膜封口，外外边可加加一层牛牛皮纸，扎扎好绳子子，用铅铅笔或碳碳素墨水笔在牛牛皮纸上上写上培培养基的的代号。注意：培养基中中的部分分成分在在高温灭灭菌时易易发生化化学变化化，致

42、使使培养基基pH值值降低，从从而使琼琼脂凝固固力下降降，发生生培养基基灭菌前前凝固，灭灭菌后不不凝固现现象。避避免此现现象发生生的方法法是:调调整培养养基pHH值，一一般不低低于5.6，若若需酸性性较强培培养基，可可适当增增加琼脂脂用量。（二）培培养基的的灭菌培养基中中含有大大量的有有机物质质，特别别含糖量量较高，是是各种微微生物滋滋生、繁繁殖的好好场所。而而接种材材料需要要在无菌菌条件下下培养很很长时间间，如果果培养基基被污染染，则达达不到培培养的预预期结果果。因此此，培养养基的灭灭菌，是是植物组组织培养养中十分分重要的的环节。常常用的灭灭菌方法法是高压压灭菌和和过滤除除菌。1、高压压蒸汽灭

43、灭菌法把分装好好的培养养基及所所需灭菌菌的各种种器具、蒸蒸馏水等等，放入入高压蒸蒸汽灭菌菌锅的消消毒桶中中，外层层锅内加加水，水水位高度度不超过过支架高高度。盖盖好锅盖盖，上好好螺丝，注注意上螺螺丝要对对角线上上。加热热后，锅锅上压力力表指针针开始移移动，当当指针移移至0.5kgg/cmm2时，扭扭开放气气阀排除除冷空气气，使压压力表指指针回复复零位。当当指针移移至1.111.2kkg/ccm2时，即即1211时，维维持一定定的时间间。由于于容器的的体积不不同，瓶瓶壁的厚厚度不同同，所以以灭菌的的时间也也要适当当考虑，具具体可以以参考表表1。灭灭菌后要要趁热取取出三角角瓶，不不可久不不放汽，让

44、让压力锅锅自行冷冷却，这这样易将将棉塞等等闷得太太湿，引引起后来来长霉污污染。培培养基自自然冷却却凝固。放放置1 d后再再使用。表1 培养养基高压压蒸汽灭灭菌所必必须的最最少时间间容器的体体积(mml)在1211下最少少灭菌时时间(mmin)205501575115020250500025100003015000352000040注意：（1）锅锅内冷空空气必须须排尽，否否则压力力表指针针虽达到到一定压压力，但但由于锅锅内冷空空气的存存在事实实上达不不到应有有的温度度，因而而影响灭灭菌效果果。当达达到一定定压力后后，注意意在保持持压力过过程中，严严格遵守守灭菌时时间，时时间过长长会使一一些化学学

45、物质遭遭到破坏坏，影响响培养基基成分，时时间短则则达不到到灭菌效效果。对对蒸馏水水，各种种器具灭灭菌时，灭灭菌时间间要适当当延长，压压力也要要提高，一一般在1126维持一一个小时时。另外外三角瓶瓶中的液液体不超超过总体体积的770%，否否则当温温度超过过1000时，培培养基会会喷溢，造造成培养养瓶壁和和封口膜膜的污染染。（2）消消毒后的的培养基基不能立立即用于于接种，而而应放置置24-72hh。放置置后如果果培养基基中没有有出现菌菌落，则则说明培培养基是是无菌的的，才可可以用于于接种。另另外做好好的培养养基一般般应在11-2周周内用完完，短时时间可存存放于室室温条件件，如不不能尽快快用完，应应放在44条件下下。表2 饱饱和蒸汽汽压力与与其对应应的温度度饱和蒸汽汽压力kg/ccm2 磅/平平方英寸寸 温度饱和蒸汽汽压力kg/ccm2 磅/平方英英寸 温度0.001001.055515121.00.14412103.61.122516122.00.28814106.91.266618124.10.44426109.81.400620126.00.56638112.61.544322