基因重组蛛丝蛋白聚乙烯醇复合支架材料的制备wyk.docx

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1、基因重组蛛丝蛋白-聚乙烯醇复合支架材料的制备魏梅红 涂桂云 陈登龙 李敏基金项目：国家自自然科学学基金（33057709556）；福建省省发改委委项目（220066-7881）作者单位：35000077 福州 福建师师范大学学生命科科学学院院（魏梅红红、涂桂桂云、李李敏），化学与与材料学学院（陈登龙龙）通信作者：李敏，Emaail:mliin【摘要】 目的 探讨致致孔剂NNaCll粒径和和比例、变变性剂和和聚乙烯烯醇（PVAA）等因素素对基因因重组蛛蛛丝蛋白白- PPVA复复合支架架材料形形态及性性能的影影响。 方法 基因重组组蛛丝蛋蛋白溶解解于988%甲酸酸，采用冷冻干干燥粒子子滤沥法法制备

2、重重组蛛丝丝蛋白-PVAA复合多多孔支架架，采用用扫描电电子显微微镜观察察支架的的形态，采用单纤纤维强力力试验机机测试支架架机械性性能。 结果 乙醇作作变性剂剂制得的的多孔支支架力学学性能较较好，支架架的断裂裂应力、断断裂比强强度均提提高5倍倍，断裂裂伸长率率可达112.221%。以粒径 5000 m的NaCCl为致致孔剂制制得的多多孔支架架力学性性能较好。高分子子材料PPVA能能明显改改善重组组蛛丝蛋蛋白多孔孔支架的的性能。 结论 重组蛛蛛丝蛋白白-PVAA复合支支架材料料有望在在组织工工程领域域得以应应用。【关键词】 重组蛛蛛丝蛋白白； 冷冻干干燥； 聚乙烯烯醇； 支架Prepaaratt

3、ionn off recoombiinannt sspidder sillk pprotteinn/pollyviinyll allcohhol commpossitee sccafffoldd matteriial WEEI MMei-honng, TU Guii-yuun, CHEEN DDengg-loong, LI Minn*. *Colllegge oof LLifee Sccienncess, Fujjiann Noormaal UUnivverssityy, Fuzzhouu 35500007, ChiinaCorreespoondiing autthorr: LI MMin,

4、Emmaill:mlliffjnuu.eddu.ccn Sncllusiionssldss ,CChinna【Absstraact】 Objeectiive To invvesttigaate thee efffeccts off maany facctorrs ssuchh ass pooroggen,dennatuurannt aand pollyviinyll alccohool(PPVA) poolymmer on thee sttruccturre aand mecchannicaal oof rrecoombiinannt sspidder sillk pprotteinn/PVA

5、A coompoositte sscafffolld matteriial. Methhodss Thee siilk fibbrouus pprotteinn sooluttionn waas ppreppareed bby ddisssolvvingg thhe rrecoombiinannt sspidder sillk pprotteinn inn 988% fformmic aciid, recoombiinannt sspidder sillk pprotteinn / pollyviinyll alccohool(PVAA) coompoositte pporoous scaaf

6、fooldss weere preeparred by freeezee-drryinngparrticcle-leaachiing metthodd. Scannninng eelecctroon mmicrrosccopee waas uusedd too obbserrve thee connforrmattionn of thee sccafffoldds, sinnglee sttrannd sstreengtth ttesttingg maachiine wass ussed to tesst tthe mecchannicaal pproppertty oof tthe scaa

7、ffooldss. Resuultss It inddicaatedd thhat usiing ethhanool aas ddenaaturrantt, tthe mecchannicaal pproppertty oof tthe scaaffooldss iss beetteer, thee brreakkingg sttresss aand breeak speeciffic tennaciity enhhancces 5 ttimees, thee brreakkingg ellonggatiion rattio cann reeachh 122.211%. Usiing NaCC

8、l (5500m) as porrogeen, or tthe inttrodducttionn off PVVA ccan impprovve tthe perrforrmanncess off poorouus sscafffolld eeviddenttly. Concclussionn Reccombbinaant spiiderr siilk prooteiin / PVVA ccompposiite porrouss sccafffoldds wwilll haave a pprosspecctivve aappllicaatioon iin ttisssue enggineeer

9、iing.【Key wordds】 Recoombiinannt sspidder sillk pprotteinn； LLyopphillizeed；Polyyvinnyl alccohool； Scafffollds在组织工程程中，种种子细胞胞、支架架材料以以及细胞胞生长调调节因子子被称为为组织工工程三大大基本要要素11。其其中支架架材料在在组织工工程研究究中起中中心作用用，它不不仅为细细胞、组组织提供供结构支支撑和模模板作用用，还可可作为活活性因子子的缓释释载体，促促进细胞胞的生长长、分化化和增殖殖 2，3。寻找找一种既既具有良良好生物物相容性性、生物物降解性性，又具具有连通通三维多多孔

10、结构构及优良良的力学学性能的的支架材材料是组组织工程程的研究究热点。丝纤维蛋白白具有较较好的生生物相容容性、生生物降解解性、韧韧性及高高强度，可可广泛应应用于生生物医学学领域，如酶固定4、人造血管5、哺乳动物细胞培养6、肌腱7与韧带组织工程8等。天然蜘蛛丝是一种特殊的丝纤维蛋白，高强度、高韧性和高弹性等优良性质使其成为近年来生物医学领域研究的热点之一。天然蛛丝蛋白的获得并非易事，基因工程技术为获取重组蛛丝蛋白开拓了渠道。本室曾报道道成功地地将RGGD（精精氨酸-甘氨酸酸-天冬氨氨酸）三三肽与蛛蛛丝蛋白白基因融融合表达达，从而而规模化化地获得得重组蛛蛛丝蛋白白9,110。本实验验以基因重组组蛛丝

11、蛋蛋白为基基础原料料，采用用冷冻干干燥粒子子滤沥法法制得重重组蛛丝丝蛋白/聚乙烯烯醇（PPVA）复合支架材料，探讨致孔剂NaCl粒径和比例、变性剂以及PVA等因素对支架形态及性能的影响。材料与方法法一、材料1.主要试试剂：重组蛛蛛丝蛋白白（本室室自制），98%甲酸及甲醇（分析纯，上海化工厂）、乙醇（分析纯，广东汕头西陇化工厂）、聚乙烯醇(PVA-117、PVA-124) （分析纯，广州新易化工有限公司）。2.主要仪仪器: Lyollab 30000冷冻冻干燥仪仪（丹麦Heeto公公司）、BH-2显微微镜（日本Ollymppus公公司）、KYKKY AAMRAAY-110000B扫描描电子显显微

12、镜（中国科学学院仪器器厂）、YYP2002N电电子天平平（上海海精密科科学仪器器有限公公司）。二、方法1. 重组组蛛丝蛋蛋白-聚乙烯烯醇多孔孔复合支架架的制备备：取一定量冻干的的重组蛛蛛丝蛋白白粉溶解解于988%甲酸酸，配成成30%的重组组蛛丝蛋蛋白-甲酸溶液液，与100%(ww/v)PVAA溶液按按一定体体积比混混合后，再按比例例（重组组蛛丝蛋蛋白与NNaCll的质量量比为11：1）加入NaCl颗粒，混合均匀。所得混合液倒入膜具（1 cm3 cm），经55干燥、甲醇或乙醇变性、单蒸水浸泡沥盐、冷冻干燥，即得重组蛛丝蛋白-聚乙烯醇多孔复合支架。2. 复合合支架的的表征: (1)扫描电电子显微微

13、镜观察察:支架材材料表面面喷金，扫扫描电子子显微镜镜下观察察。(2)机械性性能测定定:用YGG0011单纤维维强力试试验机测测定支架架材料的的拉伸断断裂比强强度、拉拉伸断裂裂伸长率率、拉伸伸断脱比比功、拉拉伸断脱脱伸长率率。结 果果1.变性剂剂对共混多多孔支架架材料力力学性能能的影响响:分别以以甲醇和和乙醇为为变性剂剂，探讨讨其对支支架力学学性能的的影响，结结果见表表1。可可看出乙乙醇作变性剂剂时，支支架材料料的断裂裂应力、断断裂比强强度均为为以甲醇醇为变性性剂的55倍，且且断裂伸伸长率可可达122.211%，以以甲醇作作变性剂剂时，支支架的断断裂伸长长率仅达达到100.977%。表1 变性性

14、剂对共混多多孔支架架材料力力学性能能的影响响T项目变性剂甲醇乙醇断裂应力（ccN/ mm22）7994184断裂比强度度（cNN/dttx）0.06220.3277断裂伸长率率（%）10.97712.2112. NaaCl颗颗粒大小小对共混多多孔支架架材料力力学性能能的影响响:以不同同粒径大小小NaCCl颗粒粒做致孔孔剂，多多孔支架架材料的的孔径均均可以达达到1000mm左右，但粒径径小于5500m的NaaCl颗颗粒制得得的支架架孔径较较为均一一，连通通性较好好。见图1。 A.粒径500m B. 粒径500m 图1 不同大小NaCl颗粒为致孔剂的共混多孔支架扫描电镜 NaCl粒粒径小于于500

15、0m时多孔孔支架的的拉伸断断裂比强强度为为0.9924 cN/dteex，拉伸断断脱伸长长率为37.55%，拉伸断断脱比功功Wr为为2.882699J/dteex，三三个指标标均比NNaCll粒径大大于5000m时制制得的多多孔支架架高，说说明NaaCl粒粒径小于于5000m时制制得多孔孔支架的的力学性性能较好。见表22。表2 NaaCl颗颗粒大小小对共混多多孔支架架材料力力学性能能的影响响项目NaCl粒粒径5500mNaCl粒粒径5500m拉伸断裂比比强度（cNN/dttex）0.92440.7388拉伸断脱伸伸长率(%)37.55531.099拉伸断脱比比功Wrr(JJ/dttex)2.8

16、26690.638813.PVAA对多孔孔支架材材料力学学性能的的影响： PVVA-1244含量只只有0%时，支支架的几几个重要要数据都都无法测测得，比较PPVA-1244含量2%和4%时，含含量增高拉伸伸断脱伸伸长率、拉伸断断裂比强强度和拉拉伸断脱脱比功均均随着增增大；比比较PVVA-1124含含量4%和6%时，含含量增高拉伸伸断脱伸伸长率就就大；而而对于拉拉伸断裂裂比强度度和拉伸伸断脱比比功，在在PVAA含量高高时，这这两个数数据反而而低。这这说明支支架中含含有一定定量的PPVA，可可以提高高支架的的强度。见表3。表3 PVVA-1124用用量对多多孔支架架力学性性能的影影响项目PVA-1

17、124用用量 (%)0246拉伸断裂比比强度（cNN/dttex）-0.68220.79000.7388拉伸断脱伸伸长率(%)-22.83325.97731.099拉伸断脱比比功Wrr(JJ/dttex)-0.283390.935530.63881注：“-”表表示由于于样品原原因，没没有测得得数据4. PVVA的聚合度度对共混多多孔支架架材料力力学性能能的影响响：就复合合效果而而言， PVAA-1224与PPVA-1177 相比比，前者者拉伸断断脱伸长长率为25.97%，稍差差于后者者26.98%；但是复复合PVVA-1124后后，支架架的拉伸伸断裂比比强度为为0.7790 cN/dteex、

18、拉伸断断脱比功功为0.993533J/dteex，均明显高高于复合合PVAA-1117制成成的支架架。见表4。表4 PVVA的聚合度度对共混多多孔支架架材料力力学性能能的影响响项目PVA-1117PVA-1124拉伸断裂比比强度（cNN/dttex）0.49880.7900拉伸断脱伸伸长率(%)26.98825.977拉伸断脱比比功Wrr(JJ/dttex)0.505510.93553讨 论醇类作为凝凝固剂，可可以诱导导折叠叠构象的的形成，其其中以甲甲醇和乙乙醇最为为常用。因因甲醇有有较强的的毒性，对对人体的的神经系系统和血血液系统统影响大大，它经经消化道道、呼吸吸道或皮皮肤摄入入都会产产生毒

19、性性反应，甲甲醇蒸气气能损害害人的呼呼吸道黏黏膜和视视力，所所以考虑虑能否以以乙醇代代替甲醇醇作为凝凝固变性性剂。本本实验比比较了分分别以甲甲醇、乙乙醇为变变性剂，制制得支架架材料力力学性能能的差异异。以乙乙醇为变变性剂制制得支架架材料的的断裂应应力、断断裂比强强度均约约为以甲甲醇为变变性剂的的5倍，且且断裂伸伸长率可可达122.211%。这这可能是是因为乙乙醇的RR基团大大，诱导导折叠叠结晶区区的形成成缓慢，分分子排列列整齐产产生的分分子应力力也较大大，所以以制得支支架材料料力学性性能好。以不同颗粒粒大小致致孔剂制制得的多多孔支架架，它们们的孔径径约1000mm以上，均均能满足足一些细细胞生

20、长长的要求求。以NNaCll晶体为为致孔剂剂的多孔支支架力学学性能稍稍好，这这可能是是因为晶晶体颗粒粒小，支支架内部部分子(蛋白质质和PVVA-1124)接触反反应机会会比较多多，所以以力学性性能好；相反地地，NaaCl颗颗粒大，由由于互相相之间的的排挤，造造成支架架内部分分子(蛋蛋白质和和PVAA-1224)接触反应少，势势必会造造成力学学性能变变差。单独重组蛛蛛丝纤维维制备支支架材料料韧性不不够，所所以期望望通过与与其它聚聚合物混混合改善善性能。PPVA是是一种含含有大量量羟基的的聚合物物，羟基基是强亲亲水基团团，因此此PVAA是水溶溶性高分分子。PPVA具具有很好好的成膜膜性、耐耐磨性、

21、耐耐化学腐腐蚀性、可可生物降降解等良良好性能能，从而而被广泛泛研究试试图应用用于人工工关节、人人工血管管、药物物缓释体体系等生生物医学学领域。本本实验试试图用PPVA聚聚合物来来改善丝丝纤维的的性质。结结果表明明，添加加一定量量的PVVA能提提高薄膜膜的强度度，这可能能是因为为PVAA通过分分子中的的羟基与与蛋白质质分子形形成氢键键或其它它共价键键，使分分子间作作用力增增强，所所以抗拉拉强度就就大。PVA的聚聚合度间间接体现现其分子子量的大大小，分分子量的的不同可可能导致致支架材材料力学学性能的的改变。本实验验考察两两种聚合合度的PPVA（PPVA-1177和PVVA-1124）对对支架力力学

22、性能能的影响响，实验验结果表表明PVVA-1124共共混改性性效果优优于PVVA-1117。这这是因为为PVAA-1224分子子量较高高，分子子主链较较长，其其较长的分子链链与蛋白白分子链链之间的的相互缠缠绕作用用更强，拉力作作用下，它它的抗拉拉能力更更强。总之，重组组蛛丝蛋蛋白与高分子子材料PPVA共共混可以以明显改改善重组组蛛丝蛋蛋白多孔孔支架的的力学性性能，且且PVAA的聚合度度越高，对对多孔支支架力学学性能的的改善越越明显。以NaaCl晶晶体为致致孔剂、乙乙醇作变变性剂制制得的共共混多孔孔支架力力学性能能较好。志谢 感谢谢西安工工程科技技学院姚姚穆院士士对本实实验提供供材料测测试的支支

23、持和帮帮助参考文献1 焦焦国豪.组织工工程支架架材料研研究进展展.化工中中间体,20007,44:266-299. 2 DDiettmarr WHH. SScafffollds in tisssuee ennginneerringg boone andd caartiilagge. Bioomatteriialss, 220000, 221: 25229-25443. 3 胡胡蕴玉.把握契契机加快快我国组组织工程程学的应应用研究究.中华骨骨科杂志志, 20000, 20:5177-5119.4 ZZhanng YYQ. Natturaal ssilkk fiibrooin as a ssupp

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