人3型腺病毒重组六邻体蛋白的纯化及免疫学研究(研究生)25293.docx

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1、Q260046902 专业做论文目 录中文摘要 2英文摘要 3文献综述 4前言 13实验材料 15实验方法 21实验结果 27讨论 32结论 35参考文献 36致谢 41个人简历 42中文摘要目的 腺病病毒(Addenovviruss,AdVV)是引起起人类呼吸吸道和消化化道感染的的重要病原原之一，严严重威胁着着人类的健健康。腺病病毒导致小小儿肺炎，尤尤其是6个月至2岁的婴幼幼儿腺病毒毒肺炎最为为严重，感感染主要是是以3, 5, 77型为主,所以建立立有效的防防治腺病毒毒感染措施施意义重大大。六邻体体是腺病毒毒主要的结结构蛋白，能能够刺激机机体产生相相应的抗体体，抑制病病毒体构象象的改变，从从

2、而中和病病毒体。本本实验组已已经成功克克隆并表达达了重组人人3型腺病病毒六邻体体L1、LL2亚基，本本次实验旨旨在纯化重重组六邻体体亚基蛋白白，检测其其抗原性、特特异性及体体外保护情情况。方法法在原核表表达系统EE.colli M115中高效效表达重组组人3型腺腺病毒六邻邻体蛋白。利利用Ni-NTA琼琼脂糖亲和和层析柱进进行蛋白纯纯化。用纯纯化的重组组六邻体蛋蛋白免疫新新西兰家兔兔,利用免免疫印迹技技术检测其其血清中抗抗体，鉴定定该蛋白的的免疫原性性和反应原原性。利用用固定病毒毒-稀释血血清方法进进行中和实实验，计算算其中和抗抗体效价。结结果得到到纯化的重重组人3型型腺病毒六六邻体蛋白白，该蛋

3、白白免疫动物物后产生高高效价抗体体,达到11：102240000，该抗体体能与人33型腺病毒毒、含有该该蛋白的重重组工程菌菌株以及重重组六邻体体蛋白发生生特异性的的免疫印迹迹反应(WWesteern bblot)，不与E.colii M155菌株、BBSA蛋白白、柯萨奇奇病毒和HHela细细胞等反应应，证明该该重组六邻邻体蛋白具具有良好的的免疫原性性和反应原原性以及33型腺病毒毒特异性。在在中和实验验中，该抗抗体可以有有效地中和和人型腺腺病毒的感感染，中和和效价为11:8000，结论所获得的的重组人33型腺病毒毒六邻体蛋蛋白具有良良好的抗原原性和特异异性,其产生的的抗体具有有良好的保保护作用，

4、为为开发研制制高效、无无毒的腺病病毒基因工工程疫苗奠奠定基础。 关键词词 六邻邻体；纯化化；免疫保保护；中和和抗体Purifficattion and studdy onn thee immmunollogy of rrecommbinaant hhexonn of humaan tyype-33 adeenoviirusAbstrractObjecct: TThe aadenooviruus onne off thee maiin paathoggeny whicch caause resppirattory tracct annd allimenntaryy inffectiion aan

5、d ccausee morre annd moore sserioous. Adennovirrus ccan ccausee chilld pnneumoonia and the majoor innfectted ttypess aree typpe 3, 5 aand 77 et al，sso too esttabliish aan efffecttive stepp to prevventiion aand ccure Adennovirrus iinfecctionn hass a ssigniificaant mmeaniing. Hexoon iss thee majjor ss

6、truccturee prooteinn of adennovirrus. It sstimuulatees thhe boody tto prroducce annti-bbody and inhiibitss connstruuct sshiftt of viruus too neuutrallize the viruus boody iitsellf.wee havve allreaddy cllonedd andd exppresssed tthe rrecommbinaant hhexonn of humaan tyype-33 adeenoviirus.Now we iintenn

7、d too purrify the recoombinnant hexoon off humman ttype-3 addenovviruss andd dettect its antiigeniicityy、speecifiicityy andd connservvatioon exx vittro. Methoods： Undeer thhe opptimuum eexpreessioon coondittionss, thhe heexon prottein of hhumann typpe 3 adennovirrus wwas eefficcienttly eexpreessedd

8、in E Cooli. The exprresseed prroteiins wwere puriifiedd by meanns off Ni-NTA affiinityy chrromattograaphy. Usiing tthe ppuriffied hexoon too immmune rabbbit aand ttest the hexoons anntigeeniciity wwith the methhod oof Weesterrn-bllot ttechnniquee. too tesst nneutrralizzatioon anntiboody bby meeans o

9、f ffixedd virrus-ddilutted sserummwayy.Ressultss： Thhe heexon of hhumann typpe 3 adennovirrus wwas ppuriffied and was provved tto immmunee thee rabbbit withh higgh anntiboody ttiterr (1:10244000)and the antiibodyy reaactedd speecifiic wiith tthe ppuriffied recoombinnant hexoon,noot reeacteed wiith E

10、E.colli、BSSA、Cooxsacckie viruus annd Heela ccell , thhe reecombbinannt E.colii strrain conttainiing tthe hhexonn prooteinn andd thee typpe 3 adennovirrus iitsellf. TThus it wwas pproveed thhat tthe rrecommbinaant pproteein pposseessedd botth off thee higgh anntigeeniciity aand hhigh speccificcity to

11、 ttype 3 addenovviruss.In NA ttest , thhe anntiboody ccan nneutrralizze addenovviruss efffectiivelyy andd itss neuutrallizattion antiibodyy titter iis 1：800 .Connclussionss： Thee reccombiinantt hexxon hhas hhigh immuunogeeniciity aand rreacttionoogeniicityy andd speecifiicityy.Its anntiboody hhas rr

12、emarrkablle prrotecctionn. Thiss is veryy impportaant tto prroducce efficieent aand nnontooxic geneetic engiineerring vacccine agaiinst adennovimms innfecttionKey wwordss： heexon, prooteinn purrificcatioon, iimmunnogennicitty,neeutraalizaationn anttiboddy文献综述腺病毒(AAdenooviruus,AddV)是引引起人类呼呼吸道和消消化道感染染

13、的重要病病原之一，严严重威胁着着人类的健健康1。在55岁儿童的的急性呼吸吸系统疾病病中，腺病病毒引起的的肺炎较为为严重；在在3岁以下下儿童还易易引起急性性肺炎，以以3，5，77型为主2。近些年在北北方地区曾曾有过腺病病毒的暴发发流行，严严重地威胁胁着儿童的的健康和生生命安全，因因此，对腺腺病毒进行行快速、特特异性诊断断和预防具具有重大意意义。腺病病毒六邻体体是腺病毒毒的主要抗抗原，刺激激机体产生生抗体，抑抑制病毒体体构象的改改变，从而而中和病毒毒体3。本文综综述了近些些年来腺病病毒的国内内外研究现现状，对其其致病性、一一般特征、免免疫学特性性、疫苗及及应用进行行探讨。一.腺病毒毒(Adeeno

14、viirus,AdV)是引起人人呼吸道和和消化道感感染的重要要病原之一一。腺病毒肺炎炎是由腺病病毒感染肺肺部引起的的肺炎,是病毒性性肺炎中最最严重的一一种。它是是由3 型和7 型腺病病毒所引起起的,主要是由由腺病毒造造成的气管管、支气管管上皮广泛泛坏死,引起支气气管管腔闭闭塞,致使病情情加重,最终导致致肺功能损损害和其他他功能障碍碍。不少危危重患儿虽虽然经过抢抢救挽回了了生命,但由于肺肺组织破坏坏较重,遗留不同同程度的慢慢性肺部疾疾病,如支气管管扩张症等等,对儿童的的健康危害害极大4 。肠腺病毒(enteeric adennovirrus)是是婴幼儿腹腹泻的重要要病原体。属属于普通腺腺病毒的4

15、40 ,441 血清清型,外形与普普通腺病毒毒相同,为直径70080nmm 的双链链DNA 病毒,主要侵犯犯婴幼儿,通过人与与人的接触触传播,也可经粪粪口途径及及呼吸道传传播5 。本病病无明显季季节性,夏秋季略略多,可呈暴发发流行。临临床表现为为较重的腹腹泻,稀水样便便,每日330 次。常常有呼吸道道症状。如如咽炎、鼻鼻炎、咳嗽嗽等,发热及呕呕吐较轻,可有不同同程度的脱脱水征。病病程812 dd。多数患患儿病后557 个月内内对蔗糖不不耐受,并可伴有有吸收不良良。二、 腺病病毒的分类类及其一般般特征腺病毒在自自然界分布布十分广泛泛，存在于于各种动物物体内, 分为感染染鸟类(AAviaddeno

16、vviruss)和哺乳乳动物(MMastaadenooviruus)的两两个属。后后者从9种种不同的宿宿主中共分分离到1001种,其其中研究最最广泛的是是人腺病毒毒。目前,人类腺病病毒共发现现51种血血清型66（以英英文字母和和数字表示示）,可分分为AFF六个亚属属。它们在在组织趋向向性等方面面都有着不不同的特性性7。AAE各组组型病毒能能在人的组组织细胞（肾肾细胞）常常规培养中中增殖, 称为普通通腺病毒,F组的440、411型病毒是是从粪便中中发现用常常规细胞培培养不能增增殖的腺病病毒,称为为肠道腺病病毒。有些些腺病毒在在动物体内内可致瘤，在在体外能转转化细胞8。 腺病毒无无包膜，220面体

17、对对称，直径径为7090nmm，有2552壳粒，其其中20面面顶角壳粒粒为12个个五邻体（ppentoon，822KD），每每个五邻体体有2条纤纤维，长度度相同或不不同纤维上上带有主要要的种特异异性抗原决决定簇和次次要的亚属属特异性抗抗原决定簇簇。除五邻邻体外有2240个非非顶角壳粒粒，称为六六邻体（HHexonn,1200KD），后后者带有主主要的属和和亚属特异异性抗原决决定簇和次次要的种特特异性抗原原决定簇9（图一）。 图一、腺腺病毒的结结构Fig 11. Sttructture of aadenooviruus腺病毒的形形态是特征征性的二十十面体病毒毒壳体（SStewaart eet a

18、ll., 11993）。其其病毒壳体体含有三种种主要的蛋蛋白：六邻邻体（III），五邻邻体基底（IIII）和和纤突（IIV），还还有多种其其他的辅助助蛋白VII，VIIII，IXX，IIIIa和Ivva2（FFig. 1）。腺腺病毒基因因组是一个个线性的双双链DNAA，其5端与一种种末端蛋白白（TP）共共价结合，55端上还还具有末端端反向重复复序列（IITRs）。病病毒DNAA与核心蛋蛋白VIII和一个称称为mu的的小肽紧密密结合。另另一种蛋白白V包被在在DNA-蛋白复合合物上，并并且通过蛋蛋白VI为为DNA-蛋白复合合物和病毒毒壳体间提提供了结构构上的联系系10。病毒含含有一种病病毒自身编编

19、码的蛋白白酶，这种种蛋白酶对对于加工某某些结构蛋蛋白从而产产生成熟的的具有感染染性的病毒毒是必需的的11。腺病病毒家族（AAdenooviriidae）的的成员可感感染种类相相当广泛的的有丝分裂裂后细胞，甚甚至包括来来自高度分分化的组织织中的细胞胞，例如骨骨骼肌细胞胞，肺细胞胞，脑细胞胞和心脏细细胞。因为为腺病毒可可将自身的的基因组递递送到细胞胞核中，并并且高效率率地复制，所所以腺病毒毒成为表达达和传递治治疗基因的的主要候选选者122，13。三、六邻体体蛋白的结结构和功能能目前,已对对六邻体蛋蛋白（图二二）进行了了广泛的结结构和功能能的研究14。每每个六邻体体是六邻体体蛋白的同同源三聚体体，是

20、大于于900个个残基的复复杂蛋白15。三三聚体的六六邻体分子子有一个五五面体的基基底和三角角形的塔尖尖，基底包包含两个区区域P1、PP2区，经经过对Add2电子显显微镜观察察和x线衍衍射分析，PP1、P22在内部卷卷曲成8个个稳定的折叠反向向平行结构构,塔区由由三个环构构成Looop1、LLoop2、和和Loopp4。通过过用一组单单克隆抗体体来检测不不同型的纯纯化的六邻邻体蛋白表表明，在六六邻体表面面有许多的的抗原决定定簇存在在在这几个环环上。对LLoop11、Looop2、Loopp4进行了了研究，其其中Looop2、Loopp4卷曲成成团，和三三聚体中的的其它两个个多肽链的的相应区域域相

21、互作用用,环间相相互指状突突起使得三三聚体的结结构相当稳稳定16。Loopp1是最长长、最复杂杂的环，自自身折叠许许多倍，向向外突起最最大限度的的与周围环环境相互作作用。对115个不同同型的腺病病毒的六邻邻体蛋白的的核酸序列列研究表明明基底的PP1、P22区是保守守的，变化化区主要集集中在Looop1、LLoop2区区17。Loopp1、Looop2的所所对应的氨氨基酸是1141914288个氨基酸酸，其中有有250个个变化的残残基，存在在有七个独独特的超变变区（HVVR），在在这七个HHVRS中中，HVRR1HVVR6出现现在Looop1中，HHVR7在在Loopp2的塔尖尖。这些HHVRS

22、在在不同的血血清型之间间的长度有有所不同，变变化范围在在2388个氨基酸酸之间。其其中HVRR1、HVVR2、HHVR4、HHVR5、HHVR7中中含有中和和抗原决定定簇的一部部分188，而且且抗原决定定簇的至少少包括两个个或两个以以上的HVVRS。在在这五个HHVRS中中包括大于于99%的的六邻体型型特异性残残基。在LLoop1、Looop2当中中，这些保保守性残基基形成HVVR区的框框架，代表表着临近区区域的不连连续链的相相互作用，22/3的保保守序列是是疏水性的的更说明它它们承担的的是结构功功能。在HHVRS区区中，HVVR1、HHVR6是是Loopp1内部支支持区，而而且HVRR1是残

23、基基变化最多多的区域。HHVR4、HHVR5是是Loopp1的主要要外部支持持区，HVVR5位于于塔尖，塔塔区的重量量变化主要要由这两个个区域来决决定。目前前，这五个个HVRSS区相应的的氨基酸序序列以及所所对应的核核苷酸序列列已经确定定。由于这这五个HVVRS位于于Loopp1、Loopp2, 所所以Looop1、Loopp2是较好好的中和抗抗原决定簇簇19。图二、六邻邻体蛋白的的结构Fig 22.Strructuure oof heexon六邻体是病病毒的主要要抗原蛋白白,含有大大量的抗原原表位,如如型、型间间及组特异异性抗原表表位及中和和性表位。但但大部分抗抗原表位在在蛋白的一一级结构上

24、上还没有被被确切定位位20。不同型型别的六邻邻体有很高高的保守(78%95%)21，型间与与组特异性性抗原表位位定位于这这些保守的的区域，可可能具有一一定的抗原原性，可作作为病毒感感染性疾病病诊断的靶靶抗原位点点。在六邻体的的前段和中中段,有大大量的抗原原性高峰及及较密的亲亲水性高峰峰区域。该该区域含有有大量的保保守区，可可能具有较较强的抗原原性及很好好的暴露性性，并期望望能够作为为型间特异异性表位，诱诱导高效价价的抗HAAdV特异异性抗体。六六邻体的后后段主要由由环4、PP2区组成成，尽管该该区域在病病毒颗粒上上亦有较好好的抗原暴暴露性，并并且序列的的同源性较较高，但疏疏水性氨基基酸残基较较

25、多。抗原原性预测分分析显示，六六邻体后段段的抗原性性高峰较稀稀少，相反反，疏水性性高峰多而而密，提示示该区域的的总体抗原原性较弱。四、腺病毒毒血清型的的确定腺病毒血清清型的确定定是根据感感染性中和和反应，它它是型特异异性，直接接针对六邻邻体蛋白的的中和抗原原决定簇。血血清型又根根据核苷酸酸的同源性性、纤维蛋蛋白的特性性以及生物物学特性来来区分为六六个亚型（AA、B、CC、D、EE、F）另另据研究发发现，在这这几个中和和抗原决定定簇所在的的几个超变变区HVRR1、HVRR2、HVVR4、HHVR5、HHVR7当当中，发生生了广泛的的染色体的的非正常重重组222，包括括短的直接接重复序列列的缺失、

26、插插入、重叠叠。而且AAdv血清型型的进化是是由于在HHVRS中中发生非正正常的重组组（抗原行行迁移），并并伴随有单单一碱基的的突变。，而而且六邻体体蛋白的血血清特异型型也位于LLoop1、LLoop22的七个HHVRS中。在HHVRS的重组又又形成独特特的新的血血清型，这这种独特的的血清型由由组成中和和抗原决定定簇的残基基的数目、位位置、生物物学特性所所决定。此此处需要指指出的是血血清型的鉴鉴定不局限限于中和反反应，有研研究者利用用限制性酶酶切分析，鉴鉴定特异性性区域(SSSR)来来确定血清清型，而且且所需的时时间比中和和反应所需需的时间少少的多，前前者只需一一周，后者者要三周，最最后二者的

27、的结果完全全相同。也也有人利用用六邻体蛋蛋白的一个个结构部分分pIX进进行亚型的的鉴定，ppIX是114.3KKDa六邻邻体很小的的组成蛋白白，它位于于每个六邻邻体壳粒的的中间，CC末端序列列暴露在壳壳粒表面，NN末端伸向向壳粒内部部，pIXX的作用是是作为一个个粘性因子子连接六邻邻体六邻体，而而且它在DDNA包装装的过程中中也起到重重要作用。ppIX的核核甘酸序列列在不同的的亚型间表表现出明显显的差别。有有研究小组组设计特异异的引物，应应用聚合酶酶链反应(PCR)，可以是是全部的ppIX基因因以亚型特特异的方式式进行扩增增，说明利利用pIXX进行PCCR分析，有有助于腺病病毒亚型的的鉴定22

28、3,244。另据研究发发现，在这这几个中和和抗原决定定簇所在的的几个超变变区HVRR1、HVVR2、HHVR4、HHVR5、HHVR7当当中,发生生了广泛的的染色体的的非正常重重组，包括括短的直接接重复序列列的缺失、插插入、重叠叠。而且AAd血清型型的进化是是由于在HHVRs中中发生了染染色体非正正常的重组组(抗原性性迁移)，并并伴随有单单一碱基的的突变。HHVRs的的重组又形形成了独特特的新的血血清型，这这种独特的的血清型由由组成中和和抗原决定定簇的残基基的数目、位位置、生物物学特性所所决定。五、六邻体体的免疫学学反应为了研究腺腺病毒衣壳壳的三个主主要成分所所引起的免免疫反应，将将复制缺陷陷

29、型腺病毒毒（Recc-Ad）注注射到BAALB/CC小鼠体内内进行研究究。实验结结果表明，采采用不同的的免疫方式式，产生的的免疫反应应有所不同同。通过iiv途径进进行免疫，产产生antti-Fii(抗纤维维)、annti-PPb(抗五五邻体)、anti-Hx(抗六邻体)的抗体；通过ip途径进行免疫，则可以产生anti-Hx抗体。由此表明腺病毒有三个结构性抗原25，抗体可以与其结合，发生感染性失活：这些抗原分别是纤维、五邻体、六邻体。Anti-Fi抗体的作用主要是聚集病毒体；Anti-pb抗体的中和作用是阻断酸性细胞进入细胞浆；Anti-Hx抗体，既可以通过聚集病毒体起中和作用又可以在低PH值（

30、PH5.0-PH6.0）下部分抑制病毒体的构象改变，从而中和病毒体26。病毒的六邻体包膜在最初的感染阶段起着很大的作用，在PH值降低的情况下，六邻体蛋白发生构象的改变，暴露出分子的N-端。PH值诱导的六邻体构象的改变，对于以后五邻体基底的暴露，或是参与病毒体脱去包膜是很必要的27。1983年年，有研究究人员认为为六邻体蛋蛋白为型特特异性抗原原决定簇，是是中和抗原原的靶点，是是病毒体对对免疫选择择压力最敏敏感的部分分。它的特特异型很可可能氨基酸酸的靶序列列决定228。为了研究不不同腺病毒毒六邻体的的抗原决定定簇的组成成，应用661个小鼠鼠腹水（包包含Mabb），分为为三组进行行。其中不不同的抗原

31、原决定簇的的分布和标标志由Maab进行识别别。在研究究抗原决定定簇组成的的过程中，反反应型和所所有的611个Mabb的滴度间间接由ELLISA来来确定229。由由Mab识别的的抗原决定定簇是六邻邻体型特异异性抗原决决定簇。用用Mab来区分分21个不不同的六邻邻体，这661个Maab用交叉反反应类型和和滴度的相相关系数进进行处理，由由此识别出出25个抗抗原决定簇簇类型，而而且型特异异性表位只只存在于同同源六邻体体的表面30。有研究表明明，anti-Hx抗体体有着极强强的中和反反应，而且且antii-Fi和和antii-pb抗抗体在annti-HHx抗体所所获得的中中和反应上上有着协同同效应，而而

32、且在由iiv中可以以引起最强强的中和反反应活性。AAnti-Fi抗体体虽然存在在，但是它它们不能有有效的阻断断病毒感染染，所以说说纤维蛋白白不是一个个很强的中中和抗原决决定簇，只只具有很弱弱的免疫原原性。腺病病毒的中和和抗原决定定簇主要在在于六邻体体上，在当当六邻体被被替代或突突变将会导导致中和免免疫反应的的缺失。因因为六邻体体作为腺病病毒的主要要结构蛋白白，参与各各种各样的的复杂蛋白白的相互作作用311。有研究者应应用比色法法进行中和和反应的分分析。用于于定量测定定Adv抗体的的血清学滴滴度；在血血清学的流流行病研究究中筛选型型特异性中中和抗体。尤尤其当抗体体的水平低低于50-80%时时，用

33、比色色法来确定定低水平感感染更为有有效。使用用这种方法法来大规模模地筛选血血清和Maab，以获得得存在血清清标本中的的中和抗体体值322。六、疫苗的的研究八十年代，在在军队中广广泛应用AAd7作为减减毒活疫苗苗，来预防防呼吸道疾疾病和眼疾疾病333。有人人研究过应应用六邻体体亚单位通通过阴离子子交换层析析纯化，以以获得纯化化的牛型腺腺病毒型的六邻邻体免疫刺激复合合体进行免免疫，它可可以在兔和和牛体内诱诱导产生中中和抗体。由由此表明BBAV-33六邻体可可以制备成成多价亚单单位疫苗，保保护牛抵抗抗多种呼吸吸道疾病34。目前国际上上主要集中中研制腺病病毒的基因因工程疫苗苗。病毒的的复制及病病毒基因

34、表表达的减少少，对于开开发活疫苗苗和用做基基因疗法的的载体是所所必要的。例例如，细胞胞毒性基因因的失活，对对于产生减减毒活疫苗苗是很有意意义的335。在在转导细胞胞内减少病病毒基因的的表达，可可以导致病病毒载体安安全性增加加。在腺病病毒体内，病病毒基因的的复制和病病毒基因的的表达可以以通过转换换控制因素素，启动子子的替换来来减少。曾曾有人通过过E4启动子子的转换，使使启动子功功能减少，减减少病毒后后期基因的的表达。在在H12229细胞内内，通过EE4启动子子的替换而而构建的载载体，所诱诱导表达的的纤维，与与野生型相相比，大大大减少336。随着分子生生物学技术术的开展，对对腺病毒的的基因工程程疫

35、苗的研研究也开展展了起来。国国际上，有有人应用AAd2的loopp1区的抗抗原决定簇簇在B组苛苛萨奇病毒毒中的表达达。以苛萨萨奇病毒作作为载体，重重组腺病毒毒六邻体蛋蛋白的L11环，以使使其在HeeLa细胞胞内稳定地地表达，所所表达的蛋蛋白，可以以诱导产生生既抗腺病病毒又抗苛苛萨奇病毒毒的中和抗抗体，进而而研制多价价的基因工工程疫苗37,338。七、病毒感感染的特异异性免疫（一）体液液免疫作用用病毒的抗体体可自感染染者血清中中检出，因因此较早被被发现并进进行了较深深入的研究究。病毒感感染后最先先出现的是是IgM类类特异抗体体，一般在在感染后223d血清中开开始出现39。以以后则出现现IgG类类

36、抗体，并并随不同病病毒种类而而持续时间间长短不等等。一般经经粘膜感染染并在粘膜膜上皮细胞胞中复制的的病毒在局局部可诱生生IgA类类抗体。特特异性抗体体可用于诊诊断。在体体内，中和和抗体的抗抗病毒作用用至为重要要。1、中和抗抗体 这种抗体体能与病毒毒结合后消消除病毒的的感染能力力，故在杀杀灭细胞外外的游离病病毒中起主主要作用。其其作用机制制是改变病病毒表面构构型，或与与吸附于易易感细胞受受体的病毒毒表位结合合，阻止病病毒吸附并并侵入易感感细胞和增增殖。病毒毒与中和抗抗体形成的的免疫复合合物更容易易被巨噬细细胞所吞噬噬、清除或或改变抗原原递呈途径径。有包膜膜的病毒表表面抗原与与中和抗体体结合后，激

37、激活补体，可可致病毒裂裂解。IggG、IggM、IggA三种不不同类型免免疫球蛋白白的中和抗抗体具有不不同的生物物学特性。由由于IgGG分子量小小，通过胎胎盘，新生生儿可具有有来自母体体的中和抗抗体而得到到约6个月月的被动免免疫保护期期。IgMM因分子量量大，不能能通过胎盘盘。如在新新生儿血中中测得被动动特异性IIgM抗体体，可诊断断为宫内感感染。病毒毒感染后最最早出现IIgM抗体体，故检查查IgM抗抗体可作早早期诊断。IIgA抗体体主要来源源于粘膜固固有层的浆浆细胞，存存在于粘膜膜分泌液中中，在局部部免疫中起起主要作用用，常可阻阻止病毒的的局部粘膜膜入侵。2、非中和和抗体 有些抗体体是针对有

38、有包膜病毒毒的基质或或其中的核核蛋白，有有些抗体是是针对病毒毒表面具有有细胞融合合功能的酶酶或病毒复复制酶等。因因这类抗原原与病毒入入侵易感细细胞不相关关，故相应应抗体无中中和作用，但但有时具有有诊断价值值。病毒抗抗体的诊断断方法随不不同病毒而而异。3、抗体介介导对靶细细胞的作用用 因有有包膜的病病毒感染细细胞后，细细胞膜可出出现病毒编编码的蛋白白，能与相相应抗体结结合，在补补体参与下下裂解细胞胞；也可通通过抗体依依赖性细胞胞介导的细细胞毒作用用（ADCCC）裂解解与破坏病病毒感染的的细胞。4、抗体介介导促进作作用（ennhanccemennt） 抗体与某某些病毒结结合后，可可促进病毒毒在感染

39、细细胞中的复复制，如登登革病毒、呼呼吸道合胞胞病毒等。对对抗体增强强作用的机机制还不明明确。实验验发现IggG抗体有有促进作用用，而IggM抗体则则无此作用用，推测可可能当抗体体与病毒结结合后，更更多的病毒毒进入巨噬噬细胞而增增殖，在细细胞表面出出现的病毒毒抗原激发发了机体的的免疫应答答。其中，巨巨噬细胞释释放多种酶酶（如蛋白白激酶、凝凝血酶等），进进一步激活活补体和凝凝血系统，释释放血管通通透因子而而引起一系系列病理变变化而发生生严重疾病病。（二）胞免免疫作用 对细胞胞内的病毒毒，机体主主要通过CCTL及TT细胞释放放的淋巴因因子发挥抗抗病毒作用用。细胞免免疫主要在在病毒感染染的局部发发挥作

40、用，其其作用方式式为通过免免疫细胞接接触靶细胞胞后杀伤靶靶细胞或在在局部释放放细胞因子子，因此检检测细胞免免疫的技术术较体液免免疫为复杂杂。1、杀伤性性T细胞（CCTL） CTLL的杀伤性性作用具有有病毒特异异性，一般般出现于病病毒感染后后7d左右右。当CTTL活性开开始表现则则NK细胞胞活性逐步步降低。CCTL接触触病毒感染染的细胞后后，特异地地识别与MMHC分子子结合靶细细胞表面的的病毒抗原原特异肽段段。在识别别中还有一一些附加因因子如CDD3、CDD2和一些些粘附分子子等。CTTL接触靶靶细胞后被被激活并释释放穿孔素素及细胞毒毒素，穿孔孔素是一组组酶的统称称，其作用用类似补体体的C9，致

41、靶细细胞出现许许多小孔。细细胞毒素可可激活靶细细胞内的一一些酶、细细胞，或自自身裂解，或或发生凋亡亡。在多数数病毒感染染中，因CCTL可以以杀伤靶细细胞达到清清除或释放放在细胞内内复制的病病毒体，从从而在抗体体的配合下下消除病毒毒。因此被被认为是使使病毒感染染恢复的主主要机制。2、辅助性性T（Thh）细胞 Th 细胞可以以促进B细细胞生长与与分化，并并活化CTTL 及巨巨噬细胞。由由于在小鼠鼠中发现有有分泌不同同淋巴因子子的T细胞胞类型，对对可分泌IIL2和和IFNg的T细胞胞称为Thh1类型，对对分泌ILL4，IIL5和和IL110的T细细胞称为TTh2类型型。在人类类亦有类似似的分类，但但

42、不如鼠中中明确。在在病毒感染染中已发现现当患者的的Th细胞胞有上述类类型的转换换时，病程程可以变化化，但其机机制及意义义还有待于于对细胞因因子在免疫疫网络中的的作用进一一步分析后后方可阐明明。Th细细胞功能低低下则可影影响机体的的抗体产生生及CTLL的作用。3、细胞因因子 在在实验动物物及病毒感感染者研究究中发现，个个别病毒感感染后虽CCTL有抗抗病毒作用用，但并未未发生靶细细胞死亡的的现象。这这一现象在在神经系统统病毒感染染，以及乙乙型肝炎病病毒持续感感染中已被被证实，其其机制是由由于释放IIFNg等等细胞因子子所致。有有人称这一一现象为非非溶细胞性性T细胞的的作用，即即通过CDD4T细胞在

43、在感染病灶灶的聚集，受受特异的病病毒抗原所所激活，分分泌大量抗抗病毒因子子（IFNN、TNFF）。这些些细胞因子子又可进一一步激活TT细胞（CCTL，TTh细胞）、巨噬细胞或甚至NK细胞，在抑制病毒复制及清除靶细胞内的病毒协同发挥作用。腺病毒六邻邻体蛋白的的Loopp1、Looop2是是较好的中中和抗原决决定簇，本本实验组已已经对这段段基因的进进行了克隆隆、表达并并优化表达达条件，现现将其大量量表达，纯纯化重组蛋蛋白，并进进一步进行行活性鉴定定，用作抗抗原动物免免疫，并检检测其所产产生的抗体体。通过中中和实验检检测其体外外保护情况况。应用该该方法进行行疫苗的研研制，将是是一种安全全、可靠、行行

44、之有效的的方法。因因此本实验验组针对LLoop11、Looop2区(六邻体抗抗原决定簇簇所在区)的基因工工程疫苗的的研制，将将可能成为为未来高效效疫苗研制制的一个重重要手段。前 言腺病毒(AAdenooviruus)是DNA病毒毒,可引起多多种疾病,如呼吸道道感染、流流行性角膜膜结膜炎、腹腹泻等。目目前已知的的人腺病毒毒有41个血清清型,其中某些些型别无论论是在成人人中还是在在儿童中可可引起急性性呼吸道感感染的现象象已经备受受关注 40、441 ,其中人3 型腺病毒毒(Ad33)是引起起急性呼吸吸道疾病和和咽膜热的的常见病原原体,严重者可可引起支气气管肺炎。22003年年“非典”在我国部部分地

45、区流流行以来，给给我国人民民生命健康康和国民经经济带来了了极大的危危害，也给给人类上了了严肃的一一课。因而而，开展对对远比冠状状病毒种类类多、宿主主范围广、感感染途径多多、致病性性强、病死死率高、危危害严重的的腺病毒的的预防性研研究具有重重大的社会会意义和经经济意义。预防传染性性疾病的最最好方法就就是疫苗，目目前，3、44、7型腺腺病毒口服服减毒活疫疫苗经国外外小规模应应用已证明明有预防效效果，但尚尚未大规模模生产和应应用，国内内还没有相相关报道。基基因工程疫疫苗正在研研制过程中中。六邻体是腺腺病毒感染染的主要抗抗原蛋白，其其中Looop1、Loopp2区是较较好的中和和抗原决定定簇，能够够刺

46、激机体体产生相应应的抗体，抑抑制病毒体体构象的改改变，从而而中和病毒毒体，本实实验通过免免疫家兔，观观察其状态态变化，检检测其血清清中抗体的的产生及特特异性，并并通过体外外实验验证证了其具有有保护作用用，为今后后研制高效效、无毒的的腺病毒基基因工程疫疫苗奠定了了基础。实验材料一、菌株及及病毒1、工程菌菌大肠杆菌菌M15ppQE311Hexoon本课题题组构建42。2、Hella 细胞胞、人腺病病毒3型病病毒、M115菌株由由哈医大微微生物学教教研室保存存。二、主要试试剂盒1、SDSS-PAGGE中分子子量标准蛋蛋白质购自自中科院上上海生化所所。2、Ni-agarrose层层析柱购自自QIAGGEN公司司。3、DABB显色试剂剂、羊抗兔兔IgG抗体体购自中山山生物制品品有限公司司。4、预染MMarkeer购自中中山生物制制品有限公公司。三、主要试试剂及配制制方法（一）SDDS-PAAGE电泳泳所需试剂剂 11、 12%SSDS-PPAGE分分离胶 10.00mlddH22O 33.3 mml30%丙丙烯酰胺溶溶液