芹菜素对大鼠脑缺血再灌注ＮＦ－κＢｉＮＯＳ动态表达的影响_大鼠脑缺血再灌注模型.docx

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1、芹菜素对大鼠脑缺血再灌注动态表达的影响_大鼠脑缺血再灌注模型 摘 要：目的:探讨芹菜素对局灶性脑缺血再灌注损伤后核转录因子-B（NF-B）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）动态表达的影响。方法:将大鼠135只随机分为假手术组（S组）、模型组（M组）及芹菜素组（A组），后2组按再灌注时间不同又分为再灌注24h、48h、72h和7天各4小组，总共9小组，每组15只大鼠。采纳线栓法制备大鼠左侧大脑中动脉缺血（1.5h）再灌注模型。光镜电镜视察脑组织病理形态变更，免疫组织化学法检测NF-Bp65蛋白表达，比色法检测iNOS活性。结果:大鼠脑缺血再灌注后M组各时间点NF-Bp65表达增多（P24h,gro

2、up M48h,group M72h,group M7d,n=15)and apigenin-treated groups(group A24h,group A48h,group A72h,grouop A7d,n=15).The transient focal cerebral ischemia and reperfusion(1.5hours) model in rat was established with insertion of thread embolish into middle cerebral artery. The cellular and subcellular mor

3、phology under optic microscope and electromicroscope, the expression of NF-B p65 by immuno-histochemistry (ICH ) and the activity of inducible nitric oxide synthase (iNOS) by colorimetric method were measured.Results：The expression of NF-B p65 were significantly higher in group M (P72h and A7d were

4、obviously lower than ones in group M(P72h and group A7d were significantly lower than ones at the corresponding time points in group M respectively(P48h.There were karyopycnosis and organelle broaden and dissolution and vacuolization in glias and neurons, especially in group M24h. The cellular edema

5、 in group A was lessened compared to one in group M, cellular morphologic change was scarcely observed between group A and group M. Conclusion：Apigenin may play a neuroprotective effect which was related with depression of NF-B activation and of the iNOS generation in transient focal cerebral ischem

6、ia and reperfusion of rats. Key words:ischemia and reperfusion；nuclear factor-appaB；inducible nitric oxide synthase；apigenin 脑卒中是导致致残、生活依靠和丢失社交实力的首要缘由，大部分脑卒中是缺血性卒中。核转录因子-B（nuclear factor-appaB,NF-B）和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）在缺血性脑损伤中起重要作用。NF-B是脑缺血再灌注时调控炎症反应的重要核转录因子，亦是iNOS重要的调控因子

7、。芹菜素是一种来源广泛的植物黄酮，有“植物雌激素”之称，探讨发觉它具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、神经爱护、调整免疫等作用。但芹菜素对脑缺血再灌注损伤后NF-B表达及iNOS活性的影响尚未见报道。本试验旨在视察大鼠脑缺血再灌注后不同时间内NF-B表达及iNOS活性的改变，以进一步阐明芹菜素的作用及机制。 1材料与方法 1.1试验动物 健康雄性SD大鼠135只，34月龄，体重(25020)g，由温州医学院试验动物中心供应。 1.2药物 芹菜素（粉剂）购自陕西慧科植物开发有限公司，纯度98，分子量270.25，批号060313。运用时先用二甲基亚砜配成母液，再用生理盐水配成浓度11.610-3M溶液。

8、1.3试剂和仪器 即用型快速免疫组化maxvision TM检测试剂盒购自福建迈新生物技术有限公司，批号607315004；NF-Bp65多克隆抗体购自美国Newmarker公司（福建迈新生物技术有限公司代理），批号9034P501J；iNOS活性检测试剂盒购自南京建成生物工程探讨所，批号20060622。FA2104型电子天平，上海天平仪器厂；Olympus CX21FS1型一般光学显微镜，JAPAN；LKB-V2088超薄切片机，USA；H-7500透射电镜，JAPAN；Image-pro plus5.0（IPP5.0）彩色医学图像分析系统，美国Media Cybernetics公司；尼龙

9、渔线（2号，直径0.234），JAPAN。 1.4试验方法 1.4.1脑缺血再灌注动物模型的制备 参照Belayev1报道的线栓法加以改良后建立左侧大脑中动脉栓塞缺血模型。将栓线插入颈内动脉约（180.5）mm，阻断大脑中动脉血流1.5h再灌注。S组操作步骤同上，但栓线只插到颈外动脉和颈内动脉分叉处。 1.4.2试验动物分组及药物干预 大鼠随机分为假手术组（S组）15只，模型组（M组）60只，芹菜素组（A组）60只，M组和A组按再灌注时间不同又分为再灌注24h组（M24h,A24h,n=15）、48h组（M48h,A48h,n=15）、72h组（M72h,A72h,n=15）、7天组（M7d,

10、A7d,n=15），各4小组，共9小组。A组于再灌注同时及其后每24h腹腔注射芹菜素液25mg/kg（0.8mL/100g），S组和M组在相同的时间注射等体积生理盐水。 1.4.3免疫组织化学法视察NF-B p65的表达 各组6只大鼠视察至规定时间，灌注固定后取脑，冠状切取前囟前1.0mm至前囟后2.0mm的脑组织，常规制备石蜡切片，片厚约5m。切片常规脱蜡水化，操作步骤严格根据试剂盒说明书进行。每只大鼠任取1张免疫组化切片，在统一放大倍数（2010）下，于脑缺血梗死区四周随机选取5个视野摄片，用美国IPP5.0分析软件行图像分析，测定核阳性细胞OD值。 1.4.4脑组织匀浆制备及iNOS活性

11、检测 每组8只大鼠，取左侧大脑组织（视交叉和脚间窝两个冠状切面间），制成10组织匀浆。比色法检测iNOS活性，操作步骤按试剂盒说明书进行。 1.4.5光镜电镜标本制备 电镜：各组随机取1只大鼠，依据电镜取材要求分别出左侧海马和中部大脑皮层（视交叉和脚间窝两个冠状切面间的脑皮层）约1mm1mm1mm大小，常规方法处理电镜视察。 光镜：用于做免疫组织化学的石蜡切片，每组随机抽取1张，苏木素伊红染色，光镜视察。 1.5统计学处理 计量资料均以均数标准差（s）表示，用SPSS11.5统计软件处理数据。多组间比较采纳单因素方差（ANOVA）分析，组间比较用t检验。 2结果 2.1NF-B p65表达的检

12、测结果 与S组比较，M组和A组NF-B p65有明显活化移位，其核表达量较S组差异有统计学意义（P7d组。A72h和A7d组较相应M组活化显著减弱（P72h组iNOS活性较M24h组上升，差异有统计学意义（P72h组和A7d组较相应M组显著降低（P2。NF-B在脑内主要存在于神经胶质细胞和血管内皮细胞内，是多种信号转导途径的汇聚点，在调整炎症反应的基因中起关键作用。NF-B由Rel蛋白家族成员以同源或异源二聚体形式组成，不同组合形式功能不同。NF-B经典的二聚体是由p65和p50亚基组成，仅p65含有激活转录的处理区3，因此p65探讨较多。 活化的NF-B快速从细胞浆移位到细胞核，在脑缺血损伤

13、后的一大堆炎性细胞因子表达上调中起重要作用。目前探讨发觉，具有B位点并受NF-B调控的靶基因有：前炎性细胞因子（TNF、IL-1和IL-6等）、炎症反应酶类（如iNOS）、黏附因子等4。因此，笔者推想，脑缺血后，NF-B的活化可促使多种炎性介质的释放和激活，并形成一困难的网络，通过之间的相互作用扩大炎症反应加重脑损伤。NF-B是iNOS的一个重要调控因子，有动物试验表明NF-B对iNOS表达的调控可能是其参加脑缺血再灌注损伤的机制之一5。因此，NF-B被认为是血管内皮细胞受损的始动机制之一。NF-B通过启动和调整这些基因的转录，在神经细胞炎症，免疫应答和细胞的增殖、凋亡等方面发挥着重要的作用，

14、进而加重脑缺血再灌注神经细胞的损伤。 本探讨结果显示：S组免疫组化可见NF-Bp65存在于细胞浆内无明显核移位，说明这时NF-B是以无活性的形式存在的。M组各时间点NF-Bp65在细胞浆和细胞核内均有表达，与S组差异有统计学意义（P6。探讨发觉经iNOS催化生成的NO，其作用主要是引起脑损伤7，并可干脆引起动物认知实力下降8，从而产生神经毒性作用。iNOS mRNA半衰期特殊长，可持续长时间翻译合成iNOS，产生NO的量也较大，对缺血脑组织的损伤也特殊大9。本试验通过检测iNOS活性来间接反映NO在脑缺血再灌注损伤中的作用。试验结果显示M组和A组脑缺血再灌注损伤后各时间段iNOS活性均明显上升

15、，提示此时脑组织中可能生成过量NO, 成为导致脑损伤的缘由之一。芹菜素的抗炎作用不仅表现在对细胞因子的作用上，而且在抗氧化和抑制iNOS活性上均有体现10。本试验在芹菜素干预后可不同程度地降低iNOS的活性，尤其在缺血再灌注72h和7天段作用更明显，提示芹菜素可降低iNOS活性，说明肯定程度及肯定时相上削减脑组织iNOS的表达从而抑制NO神经毒性，减轻脑组织水肿，可能是芹菜素发挥脑爱护作用的机制之一。 本试验发觉，在NF-Bp65表达和iNOS活性增高的同时，脑组织水肿和神经细胞变性明显，说明两者参加了脑缺血再灌注损伤。因此，抑制NF-Bp65表达和iNOS活性的治疗，可以减轻脑缺血再灌注损伤

16、，改善其预后。芹菜素干预后，NF-Bp65表达削减，iNOS活性降低，同时脑组织水肿明显有改善，提示芹菜素可通过抑制NF-B的活化及削减iNOS产生，从而抑制大鼠脑缺血再灌注继发的炎症反应。其详细的作用机制有待进一步的阐明。 参考文献 1 Belayev L,Alonso OF,Busto R,et al.Middle cerebral artery occlusion in the rat by intraluminal suture:Neurological and pathological evaluation of an improved modelJ.Stroke,1996,27:1

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18、ol loading of NF-B transcription factor decoys in human brain microvascular endothelial cells blocks upregulation of ICAM-1J.Stroke,2000,31(5):1179-1186. 5 Han HS,Karabiyikoglu M,Kelly S,et al.Mild hypothermia inhibits nuclear factor-kappaB translocation in experimental strokeJ.J Cereb Blood Flow Me

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