动脉粥样硬化的治疗.docx

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1、 动脉粥样硬化的治疗 摘要：目的 视察活血(三七总皂苷)、解毒(黄连提取物)、活血解毒中药有效部位(虎杖提取物、大黄醇提物)对ApoE基固敲除小鼠动脉粥样硬化(AS)斑块炎症反应的影响。方法 70只(68)周龄小鼠ApoE基因敲除小鼠子高脂饮食喂养13周后，待其形成成熟的AS斑块后，随机分为活血解毒组(虎杖提取物组、大黄醇提物组)、活血比照组(三七总皂苷组)、解毒比照组(黄连提取物组)、模型组、阳性比照组(辛伐他汀组)。接着高脂喂养并按体重比折算的临床举荐剂量赐予相应药物治疗13周后，处死动物，检测血清超敏C反应蛋白(hs-CRP)及可溶性白细胞分化抗原40配体(sCINOL)水平，并取主动脉

2、根部4个切面，分别行HE染色和Movat染色，用免疫组化染色法视察小鼠主动脉根部斑块内过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR-r)的蛋白表达，实时荧光定量PCR法检测主动脉内PPAR-r及核转录因子kB(NF-kB)mRNA的表达。结果 与模型组比较，大黄醇提物组及虎杖提取物组血清hs-CRP和sCD40L水平均明显降低(P0.01或P0.05)。解毒比照组黄连提取物主动脉斑块内PPAR-r蛋白及基因表达均明显增多(P0.01)，而中药各组小鼠主动脉斑块内NF-Kb d3mRNA的表达与模型组比较均无统计学意义(P0.05)。结论 采纳临床举荐剂量治疗的活血解毒中药有效部位中，虎杖提取物和大黄醇

3、提物可明显降低ApoE基因敲除小鼠血清炎症标记物hs-CRP及sCD40L水平，其效果优于单纯活血或解毒组，但对PPAR-r和NF-kB的作用并不明显。而黄连提取物却可明显增加具有抗AS炎症作用的爱护性受体PPAR-r的蛋白和基因表达，提示其作用环节有所不同，值得深化探讨。 关键词：易损斑块；活血；解毒；动脉粥样硬化；炎症反应 中图分类号：R543.5R285.5文献标识码：A文章编号：1672-1349(2007)12-1202-04 Ross动脉粥样硬化(AS)炎症假说认为，炎症反应贯穿于AS起始、进展及斑块裂开血栓形成的全过程，是斑块不稳定发生裂开的中心环节。抑制炎症反应，防止斑块裂开现

4、已成为该领域的重要探讨方向。既往的探讨结果表明活血中药酒大黄具有良好的稳定易损斑块作用，效果优于其他常用活血中药组，其机制与抑制炎症反应有关，由于大黄兼有活血和解毒作用，现代药理探讨表明清热解毒中药多具有抗炎的类效应，而抑制炎症反应又是稳定易损斑块的重要机制，为此，提出了“活血解毒抑制炎症反应稳定斑块”的假说，并在此基础上，深化探讨活血、解毒、活血解每中药有效部位三七总皂苷、黄连提取物、虎杖提取物、大黄醇提物对ApoE基因敲除小鼠主动脉粥样硬化斑块炎症反应的影响。 1 材料与方法 11 动物 (68)周龄ApoE基因敲除小鼠(品系C57BL/6J，北京高校试验动物中心自美国Jackson试验室

5、引进并培育)70只，均为雄性，体重18g20g，饲以含脂肪21、胆固醇0.15的高脂饲料(60Cor灭菌照耀处理)，饲养条件为2级，室温保持在2224，相对湿度50，光照时间07:0019:00。 12 药物 虎杖提取物由湖南省洪江华光生物有限责任公司供应，批号：20050601；大黄醇提物及黄连提取物均由西安奥晶科技发展有限公司供应，批号分别为050841、050910；血塞通片(三七总皂苷)由云南特安呐制药股份有限公司供应，批号为050118；辛伐他汀(商品名舒降之)，由杭州默沙东制药有限公司出品。批号为P1196， 13 试剂与仪器 小鼠血清超敏C反应蛋白(hs-CRP)和可溶性白细胞分

6、化抗原40配体(sCD40L)ELISA试剂盒购于R&B公司(进口分装)；一抗小鼠来源单克隆抗体过氧化物酶体增殖物激活受体r(PPAR-r)由Sant Cruz公司供应；二抗为通用型二抗，购自Sant Cruz公司；cDNA合成试剂盒和荧光定量RCR试剂盒均由TaKaRa公司供应；PPAR-R及核转录因子kB(NF-kB)的上下游引物均由Invitrogen公司供应；全自动生化测定仪型号：RX-2000，美国TECHNICON公司生产；gemeAmpPCR Systerne 9700由美国ABI公司供应；定量PCR仪型号Rotor gene-3000A，芬兰基因公司供应；美国Image-Pro

7、Plus Version 5.0(IPP)图像分析软件。 14 分组及给药方法 小鼠喂养13周后，随机处死4只，取主动脉根部，HE染色一般光镜下视察，确定AS形成后，其余小鼠随机分为6组：辛伐他汀组、虎杖提取物组、大黄醇提物组、黄连提取物组、模型组及三七总皂苷组各11只。依据成人每日用药临床举荐的常用量：虎杖提取物组0.25s/kg，大黄醇提物组、黄连提取物组均为0.1g/ks，三七总皂苷组0.005g/kg，辛伐他汀组0.0001g/ks。按体重系数比折算成小鼠用量：虎杖提取物组2252。5 m#M，大黄醇提物组、黄连提取物组均为901mg/kg，三七总皂苷组45.05mg/kg，辛伐他汀组

8、9.01mg/kg。药物溶于蒸馏水，灌胃给药，每日1次，接着喂养13周。取材前夜禁食，经小鼠眼眶静脉丛采血，离心分别血清，-80冻存，用作测定血清ks-CRP和sCD40 L浓度。处死全部小鼠，无菌条件下取出心脏及主动脉，心脏10甲醛固定，主动脉放在冻存管内液氮骤冷，-80保存。 15 检测项目及检测方法 151 特别病理染色 改良的Movat五色套染法参考文献7并略加改进，最终的染色结果为：细胞核及弹力纤维为黑色；基质和黏蛋白为蓝色；胶原纤维为黄色；平滑肌为红色；泡沫细胞为淡紫色。 152 血清炎症标记物测定 采纳双抗夹心ELISA法对小鼠血清ks-CRP和sCD40 L进行测定，严格根据说

9、明书进行操作。 153 免疫组织化学染色 小鼠心底部横断面连续切片，每隔50/n连续取6张切片，切片厚5m。按Suzuki等确立的方法，每只小鼠的主动脉根部取4个相同的切面，分别为：升主动脉最近端横截面，切面形态呈圆形；主动脉附着部位，并有冠状动脉开口；主动脉起始横截面；主动脉完全出现并汇合在一起。分别进行病理HE和Movat染色。免疫组化染色选取第三切面，采纳两步法测定斑块内PPAR-r蛋白表达(抗体稀释度为1:200)，每组均以PBS代替一抗作为阴性比照，在100倍镜下海张切片选取5个不同的视野，对阳性区域累积面积进行定量测定，最终求取斑块内阳性区域面积占斑块面积的百分比。 154 实时荧

10、光定量PCR检测 先提取总RNA，然后取4L 总RNA经反转录酶及随机引物等反应物混合配成20L体系，4215min，95，2min反转录成cDNA，随后进行实时荧光定量PCR反应，小鼠NF-kB引物序列：forward 5，-GGAG-GCATGTTAGTGG-3，reverse 5，-CCCTG CGTTGGATTTCGTG-3，扩增片段105bp；小鼠PPAR-r引物序列：forward 5，-TGTCG GTTCAGAAGTGCC TG-3，reverse5，-TTCAG CTGGTC GATAT CACTGGAG-3，扩增片段122bp；扩增条件是9510s，955s，6034s，共

11、40个循环。以小鼠肌动蛋白actin为内参照，引物序列为：forward 5CAGAA GGAGATT AC TGCn：IGGCT-3reverse 5-GGAGCCAC CGATCCACACA-3，扩增片段93 bp。最终与模型组比较得出相对浓度值。 16 统计学处理 数据以均数标准差(xs)表示，采纳SPSS11.5软件进行统计分析，单因素分析各组差异。 2 结 果 21 对模型组动脉硬化斑块的视察 高脂饮食喂养26周后，HE染色显示小鼠主动脉斑块内胆固醇酯及胆固醇结晶增多，纤维帽菲薄，表面有大量的泡沫细胞覆，呈现易损斑块特征。Movat染色显示斑块内细胞外脂质成分较多，胶原成分较少，血管

12、中膜结构萎缩、变薄。 22 各组小鼠血清炎症标记物比较 给药13周后，人黄醇提物组、虎杖提取物组及辛伐他汀组血清hs-CRP水平较模型组显著降低(P0.01)，大黄醇提物组及虎杖提取物组血清sCD40L水平较模型组显著降低(P0.05)，三七总皂苷组和黄连提取物组血清hs-CRP和sCD40L水平与模型组比较，差异均无统计学意义(P0.05)。大黄醇提物组、虎杖提取物组血清hs-CRP和sCD40L水平的降低与三七总皂苷组或黄连提取物组比较亦有统计学意义(P0.01)。详见表1。 23 给药后各组小鼠主动脉斑块内PPARr蛋白表达的变更 与模型组比较，给药13周后黄连提取物组小鼠主动脉斑块内P

13、PARr蛋白表达明显增多(P0.01)，其余各给药组小鼠主动脉斑块内PPAR-r蛋白表达与模型组比较无统计学意义(P0.05)。详见图1、图2。 24 给药后各组小鼠主动脉斑块内PPAR-r mRNA和NF-kBmRNA表达的变更 与模型组相比，给药13周后黄连提取物组可明显增加主动脉斑块内PPAR-rmRNA的表达(P0.01)，其余给药组PPAR ymRNA的表达与模型组比较无统汁学意义(P0.05)。而各给药组中只有辛伐他汀组可明显降低NF-kBmRNA的表达(P0.01)。 3 讨 论 探讨表明，确定斑块稳定性的主要因素脂质核心的大小、纤维帽的厚度及其修复实力等与AS炎症反应亲密相关。

14、炎症引起斑块不稳定的机制主要表现在几个方面：炎症细胞可促进动脉粥样硬化斑块内脂质的沉积。脂蛋白和炎症反应相互作用，形成恶性循环，从而使斑块趋于不稳定；炎症细胞分泌的基质金属蛋白酶、肿瘤坏死因子、白细胞介素、干扰素等炎性介质，相互作用后可促进细胞外基质的降解、减弱纤维帽，或抑制细胞外基质合成，降低其修复实力，从而使斑块不稳定；炎症反应还可以促进斑块内血管新生，新生血管裂开出血可导致斑块易损。 CRP是一种急性时相反应蛋白，是机体非特异炎症反应的敏感标记物之一。多项探讨显示，ks-CRP作为目前最牢靠的AS炎症标记物，与斑块的进展亲密相关，现已被视为急性冠脉综合征(ACS)发病的独立危急因子，并用

15、于判定其预后。CD40-CD40L途径几乎贯穿AS发生发展乃至斑块裂开的全过程。探讨发觉，与稳定型心绞痛病人相比，不稳定型心绞痛病人外周血sCD40L水平明显增高。sCD40L与ACS亲密相关。本探讨中发觉给药13周后大黄醇提物组、虎杖提取物组血清ks-CRP和sCD40L水平与模型组比较均显著降低，活血解毒中药有效部位组表现出较好的降低AS斑块血清炎症标记物的作用，明显优于单纯活血或解毒组。并且所表现出的趋势与各药物组对易损斑块稳定性的改善大致相同，从而也验证了从前提出的“活血解毒抑制炎症反应稳定斑块”这一假说。 活化的PPAR-r通过活化蛋白、信号转导和转录活化因子(VXQx)信号通路能抑

16、制多种与斑块进展相关促炎症因子、黏附分子的基因表达，抑制1L-6、环氧化酶、内皮素-1、一氧化氮合酶的表达，从而抑制炎症反应以及削减基质金属蛋白酶(MMPs)的产生，最终起到稳定动脉粥样斑块的作用。而NF-KB的激活引起前炎症因子的表达是AS发生与发展的重要环节。探讨表明NF-KB的激活是斑块裂开的敏感标记物之一。本探讨结果表明，给药13周后黄连提取物可明显上调主动脉斑块内PPAR-r蛋白及基因表达，但各中药组均不能明显降低NF-KB mRNA的基因表达。因此，推想黄连提取物可能通过增加抗AS炎症的PPAR-r受体的表达而起到稳定易损斑块的作用，这在国内未见其他报道。 目前，清热解毒中药已成为

17、治疗冠心病的常用中药。临床应用的一些清热解毒药如黄连解毒汤、清热解毒方等除了抗菌、调整免疫、抑制炎症反应外，还具有抗血小板聚集、抗血栓形成的作用，并对高血脂、内毒素等各种缘由导致的血管内皮损伤有爱护作用。这些机制均能干预冠状AS的发展进程。而PPAR-r受体可通过抑制炎症反应、爱护血管内皮细胞、抗血栓形成、促进胆固醇的逆转运、调整斑块内胶原代谢等多种途径去干预易损AS斑块。结合本试验探讨结果，推想PPAR-r受体可能有望成为清热解毒中药抗AS和稳定易损斑块的潜在作用靶点，值得深化探讨。 本探讨提示，抑制炎症反应为活血、解毒类中药，尤其是具有解毒作用中药(含单纯解毒和活血解毒中药)稳定易损斑块的

18、作用机制之一。综上所述，采纳临床举荐剂量的活血解毒中药有效部位中，虎杖提取物和大黄醇提物可明显降低ApoE基因敲除小鼠主动脉血清炎症标记物ks-CRP及sCD40L水平，优于单纯活血或解毒中药有效部位三七总皂苷和黄连提取物组，但对PPAR-r，NF-kB上游炎症相关因子作用并不明显。而解毒中药有效部位黄连提取物可明显增加抗动脉粥样硬化炎症的爱护性受体PPAR-r的蛋白和基因表达，提示其作用环节有所不同，值得深化探讨。 作者简介：周明学，现为中国中医科学院2005级博士探讨生(邮编：100700)；徐浩(通讯作者)、温见燕、潘琳，工作于中日友好医院(邮编：100029)；陈可冀，工作于中日友好医院、中国中医科学院西苑医院。 (本文编辑郭怀印)