[产漆酶真菌筛选及其固态发酵条件的初步研究]真菌漆酶抑制剂.docx

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1、产漆酶真菌筛选及其固态发酵条件的初步研究真菌漆酶抑制剂 摘要：目的筛选产漆酶真菌，优化固态发酵培育基组成，探讨粗酶的酶学性质。方法平板筛选获得菌株，通过测定漆酶活性优化培育基的组成。结果获得了固态发酵条件下产漆酶活性较高的菌株。优化后培育基的组成：豆粕和木屑比例11，木糖0.5 %，酒石酸铵2.0 %，培育基含水量65 %。漆酶最适温度60 ，低于50 时漆酶较稳定，最适pH 3.5，pH 6.59.0之间漆酶稳定性较好。结论得到了产漆酶活性较高的菌株，培育基优化后漆酶活性提高7倍。 关键词：漆酶；筛选；固态发酵；粗酶性质 中图分类号：Q554文献标识码：A文章编号：1672-979X(200

2、9)01-0011-04 Screening of Laccase-Producing Fungal Strain and the Preliminary Study on the Solid-State Fermentation Conditions SHI Xiao-yan1, CAI Yu-jie1, WANG Zhi-xin1, LIAO Xiang-ru1*, ZHANG Da-bing2 (1. The Ministry of Education, Key Laboratory of Industrial Biotechnology, School of Biotechnology

3、, Jiangnan University, Wuxi 214122 China; 2. Hanbon Science & Technology Co. Ltd, Huaian 223001, China) Abstract：Objective To Screen the laccase-producing fungi and optimize its solid-state fermentation medium as well as study the property of crude enzyme. Methods The strains wereobtained by plate s

4、creening and the optimization of medium was performed by measuring the activity of laccase. Results A fungal strain with a high laccase-producing activity was obtained under solid-state fermentation. The optimal medium contained: soybean meal and sawdust with the ratio of 11, 0.5 % xylose, 2.0 % amm

5、onium tartrate and 65 % moisture. The optimal temperature was 60 for laccase, and the laccase was stable at less than 50 . The optimal pH value was 3.5, and the laccase was stable at pH 6.59.0. Conclusion A fungal strain with a high laccase-producing activity was obtained and the activity of laccase

6、 was increased 7 times with the optimization of medium. Key words：laccase; screening; solid-state fermentation; property of crude enzyme 漆酶（laccase，-diphenol oxidase，EC 1.10.3.2）是一种结合多个铜离子的多酚氧化酶，能催化酚类、芳胺类、羧酸类、甾体类激素、生物色素、金属有机化合物和非酚类物质生成醌类化合物、羰基化合物和水。漆酶与抗坏血酸氧化酶和哺乳动物血浆铜蓝蛋白同源，都属于蓝色多铜氧化酶家族1。 漆酶能降解木素，可与有毒

7、的酚类物质作用，还可降解苯氧基类除草剂及去除石油工业废水的毒性。漆酶用于食品加工可提高产量、效率和质量，而且不明显增加投资和生产成本，不产生有毒物质。如：用于提高果汁、果酒和啤酒的稳定性2,3；处理食品工业中产生的废水4；用于面包加工可增加面包体积，改善面包结构和松软性，提高面团的机械强度、稳定性，降低面团黏性5。漆酶可特异降解木质素，制取膳食纤维，现已取得有好用价值的结果1。 自然界中，漆酶分布于多种植物、真菌及少数昆虫和细菌中，分泌漆酶的真菌主要集中在担子菌（Basidimycetes）、多孔菌（Polyporus）、子囊菌（A-somycetes）、脉胞菌（Neurospora）、柄胞壳

8、菌（Po-dospora）和曲霉菌（Aspergillus）等6，担子菌纲的白腐菌是漆酶的主要生产者，迄今只发觉一种细菌Azospirillum lipoferum能分泌漆酶1,2。本探讨从自然界筛选能产漆酶的真菌，优化其发酵条件，并初步探讨了其酶学性质，以期为今后的探讨和工业生产供应理论依据。 1材料和方法 1.1材料 菌种来源从江南高校青山湾校区，无锡市龙山、梅园等地采集大型真菌子实体约40株，从中筛选。 培育基（1）愈创木酚PDA固体培育基：马铃薯20 %，葡萄糖2 %，琼脂2 %，KH2PO4 0.3 %，MgSO4 0.15 %，灭菌后添加愈创木酚0.04 %；（2）液体种子培育基：

9、酵母膏 0.3 %，葡萄糖 2 %，蛋白胨 0.5 %，pH自然；（3）固态发酵初始培育基7：豆粕 57.3 %，麸皮38.2 %，葡萄糖0.5 %，（NH4）2SO4 2.5 %，CaCl2 0.48 %，KH2PO4 0.5 %，MgSO47H2O 0.5 %，CuSO4 0.02 %。培育基含水量65 %。 1.2产漆酶真菌筛选 将经表面消毒处理的大型真菌子实体组织接种至愈创木酚PDA固体培育基上，30 培育35 d，视察菌落四周颜色的改变。挑出产生红色变色圈的菌株，反复分别纯化，直至得到单一菌落。 1.3固态发酵培育 从固体培育基上取一接种环的菌体接入种子培育基（50 mL，250 m

10、L三角瓶），30 、200 r/min摇床培育2 d。取菌悬液接入固态发酵培育基（50 g，250 mL三角瓶），接种量10 %，30 恒温培育。 1.4粗酶液的制备 利用固态发酵产酶，将所得酶曲按15的比例加水，浸泡过夜，8 000 r/min、4 离心得上清，即为粗酶液，4 保存备用。 1.5酶活性的测定 称取1 g湿曲，加入99 mL蒸馏水，室温浸泡2 h，5 000 r/min、4 离心得上清，其他测定步骤与液体测定酶活性步骤相同。 按文献8方法进行，以每1 min氧化1 mol的DMP（2,6-二甲氧基酚）成为3,5,3, 5四甲氧基二苯醌（= 4 916 mmol-1Lcm-1）所

11、需的酶量定义为1 个酶活性单位，以U/mL表示，并按U/g湿曲=U/mL上清液100计算酶活性。 2结果 2.1漆酶高产菌株的筛选 2.1.1初筛将采集的子实体分别编号为lac-140，用75 %酒精消毒子实体表面，镊取小块子实体组织接种到加有愈创木酚的PDA固体培育基上，培育3 d后菌体生长良好，lac-1，2，5，7，8，10，13，16，18，21，22，26，29，33，35等的培育皿中，菌体底部及四周有红色变色圈，将菌体挑出划线分别，lac-1，2，5，7，22，26等菌体的颜色较深。 2.1.2复筛为进一步验证菌株固态发酵产漆酶的实力，分别将lac-1，2，5，7，22，26等6株

12、菌接入种子培育基，30 、200 r/min摇床培育2 d转接到固态发酵培育基，30 培育，长出菌体后每天测酶活性。结果见表1。 其中，lac-7固态发酵漆酶活性最高，但是发酵周期过长；lac-22固态发酵周期最短，但是漆酶活性较低。所以最终选用lac-2作为试验菌株，优化其固态发酵条件，并探讨其酶学性质。 2.2lac-2初始条件下固态发酵产酶曲线 固态发酵初始培育基30 恒温培育，测定漆酶活性。菌株lac-2在第7天起先产酶，第10天漆酶活性达到最高（1.914 U/g），此后起先下降。因此，确定10 d作为探讨培育条件对酶活性影响的相宜时间。 2.3培育条件对lac-2产漆酶的影响 2.

13、3.1不同固体成分及其比例对产酶的影响初始培育基以豆粕为主要成分，分别加入米糠、麸皮、木屑、稻草、高粱杆、水葫芦等。接菌，30 恒温培育10 d测产酶状况，酶活性随培育基中不同固体物质而异，结果见表2。 加入木屑时漆酶活性最高（3.992 U/g），确定豆粕和木屑为固态发酵培育基的主要成分，同时调整豆粕和木屑比例，结果见表3。豆粕和木屑之比为33（11）时，菌体产酶活性最高（6.986 U/g）。 2.3.2培育基含水量对产酶的影响菌体固态发酵生长过程中须要相宜的含水量，但过高或过低都不能满意菌体的生长代谢，在确定豆粕和木屑之比为11的基础上，变更培育基含水量。菌体的产酶实力随培育基含水量的增

14、加而增加，含水量65 %时，漆酶活性最大，进一步增加含水量，产酶实力下降。 2.3.3不同碳源对产酶的影响采纳不同碳源（葡萄糖、麦芽糖、果糖、木糖、乳糖、蔗糖），各添加5 %，30 恒温培育10 d测酶活性，产酶状况随碳源不同而异，见表4。添加木糖时漆酶活性最高（8.377 U/g），因此，确定木糖为最佳碳源。 2.3.4木糖浓度对产酶的影响菌体生长前期在培育基中添加肯定量的木糖有利于菌体生长和漆酶形成；但添加木糖过多，菌体生长过快，不利于后期漆酶的产生。培育基添加不同浓度的木糖，培育10 d测酶活性，木糖浓度0.5 %时漆酶活性最高。 2.3.5不同氮源对产酶的影响用不同氮源（硫酸铵、尿素、

15、蛋白胨、酒石酸铵、硝酸钾、蛋白胨与硫酸铵混合氮源），各添加2.5 %，30 恒温培育10 d测酶活性，结果见表5。添加酒石酸铵时漆酶活性最高（10.459 U/g），因此，确定酒石酸铵为最佳氮源。 2.3.6酒石酸铵浓度对产酶的影响培育基分别添加不同浓度的酒石酸铵，30 恒温培育10 d测酶活性。酒石酸铵浓度2.0 %时漆酶活性达到13.233 U/g，然后随着酒石酸铵浓度上升而下降。 2.4 漆酶粗酶性质的探讨 将酶曲按15加水浸泡过夜，离心，4 保藏备用。 2.4.1温度对漆酶活性的影响pH 3.5环境中，以DMP为底物，测不同温度时的漆酶活性。漆酶活性随温度上升而增加，60 时漆酶活性达

16、到最高，此后随温度上升而下降，主要是因70 以上漆酶失活。 2.4.2漆酶的热稳定性将粗酶液置于不同温度的水浴中保温1 h，pH 3.5、60 时，以DMP为底物测漆酶活性，以初始活性为比照。低于50 时，漆酶稳定性较好。 2.4.3pH对漆酶活性的影响以DMP为底物，60 条件下测粗酶液酶活性。pH 2.54.0时活性较高，pH 3.5时漆酶活性最高。 2.4.4漆酶的pH稳定性将pH不同的粗酶液在30 条件下保温过夜，以DMP为底物，60 测漆酶活性。pH 6.59.5之间稳定性较好，残存酶活性在80 %以上。 3探讨 固态发酵周期虽较长，但较液态发酵操作简便、能耗低、产物浓度高、回收费用

17、较低。利用豆粕、木屑等废料进行固态发酵，原料成本低，有利于环境爱护。添加木糖和酒石酸铵作为碳氮源，有利于菌体生长繁殖和产酶。多数真菌漆酶的最适反应温度较低，一般在2550 之间。现在也有耐高温真菌漆酶的报道。Jordaan 等9从南非的嗜热白腐菌菌株中得到耐高温漆酶，其最适反应温度为70 。杏鲍菇（Plerotus erynhii）漆酶10的最适反应温度为60 。多数真菌漆酶的最适反应pH 4.06.0，Nina 等11探讨的子囊菌漆酶最适pH为中性，刘尚旭等12报告，糙皮侧耳Ax3所产漆酶的最适pH为2.8。菌株lac-2所产漆酶的最适温度为60 ，最适pH 3.5，pH稳定性和热稳定性较好

18、，可广泛用于食品工业、制浆造纸工业、环境爱护及生物检测等行业。 参考文献 1Alfer M M, Richard C S. Laccase:new functions for an old enzymeJ. Phytochemistry, 2002, 60: 551-565. 2王岁楼，王琼波. 漆酶在食品工业中的应用及产生菌的探讨J. 食品科学，2005，26（2）：260-263. 3Mathiasen T E. Laccase and beer storagep. PCT Int Appl WO, 1995, 2124A2. 4Duran N, Esposito E. Potential

19、 applications of oxidative enzyme and phenoloxidase-like compounds in waste water and soil treatment: a reviewJ. Appl Catal B: Environ, 2000, 28: 83-99. 5Labat E. Effect of laccase and ferulic acid on wheat flour doughtsJ. Cereal Chem, 2000, 77: 823-828. 6Petr B. Fungal laccases-occurrence and prope

20、rtiesJ. FEMS Microbiol, 2006(30): 215-242. 7张树江. 固态发酵产漆酶及其应用基础探讨D. 杭州：浙江高校硕士学位论文，2006：16-34. 8康从宝，刘巧，李清心，等. 白腐菌产漆酶的纯化及部分酶学性质J. 中国生物化学与分子生物学报，2002，18（5）：638-642. 9Jordaan J, Leukes W D. Isolation of a thermostable laccase with DMAB and MBTH oxidative coupling activity from a mesophilic white rot fung

21、usJ. Enzyme Microb technol, 2003, 33: 212-219. 10 兰瑞芳，林少琴，林玉满. 杏鲍菇漆酶的生物学特性J. 食用菌学报. 2002，9（2）：14-16. 11 Nina H, Laura-Leena K, Kristiina K, et al. Crystal structure of a laccase from Melanocarpus albomyces with an intact trinuclear copper siteJ. Nat Stuct Biol, 2002, 9(8): 601-605. 12 刘尚旭，董佳里，张义正. 糙皮侧耳Ax3产漆酶条件及部分酶学性质探讨J. 四川高校学报，2004，41（1）：160-163.