人力资源液相色谱培训讲义6920.doc

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1、液相色谱谱培训讲讲义(十)x转转载自：发布日日期：20007-55-222第十一章章 柱子的的应用与与维护 色谱柱柱的液相相色谱系系统获得得分离的的中心部部件，许许多分离离问题都都归结于于色谱柱柱。对柱柱注意适适当的维维护，则则可缓解解许多故故障的发发生。 柱故障障主要是是由机械械、色谱谱或者化化学方面面的原因因引起的的。维护护色谱柱柱和排除除故障，；需要懂懂得液相相色谱的的分离过过程以及及色谱柱柱本身的的构造是是非常重重要的。色谱柱柱的价格格昂贵，应应避免人人为地损损坏，并并尽可能能延长其其寿命。一、色谱谱柱的种种类与评评价 一般地地说，根根据样品品的性质质决定采采用何种种液相色色谱方法法，

2、然后后再选择择不同类类型的柱柱。即不不同类型型的柱则则代表了了不同的的色谱方方法。 不同种种类色谱谱柱的差差异在于于柱结构构、柱填填料和柱柱尺寸的的不同。 色谱柱柱有不同同的尺寸寸(长度和和内径)，分制制备型、常规分分析型和和微型。不同类类型柱的的硬件也也不同，(包括接接头、柱柱管等方方面)，还有有径向加加压柱和和夹套加加热柱等等。 不同液液相色谱谱法的尺尺寸根据据需要可可以选取取，普通通分析330ccm长，内内径48mm。常用20ccm长、4.66mm内径的的柱。制制备型柱柱内径一一般为8mm、25ccm长。微微型柱内内径l3mm，长1020ccm。不同同的填料料分析的的效果可可能不同同，这

3、是是因为生生产过程程不同所所致。同同一厂商商生产的的同种填填料因批批号不同同也会有有差异，这这种差异异可能从从基质就就开始(表面积积、杂质质、特殊殊处理)，还有有键合的的化学物物质(一氯或或三氯硅硅烷反应应剂)，不同同厂家生生产的填填料还会会因专利利技术(预处理理、键合合过程、填装技技术)等不同同而呈现现较大差差异。由由于种种种差异、仅能假假设同一一批号的的柱有基基本相同同的性质质。 多数柱柱填料基基质采用用多孔硅硅胶微粒粒，通常常有球形形和无定定形两种种，具有有不同的的粒度、孔径和和表面积积。多孔孔聚合物物微粒也也适用于于反相色色谱。聚聚合物柱柱的流动动相范围围广，流流动相pH值可在1至一三

4、三之间。而硅胶胶基质pH仅能在2.5和7之间。显然，聚聚合物柱柱要好一一些，但但目前仍仍是以硅硅胶基质质的柱为为主。原原则上，聚聚合物柱柱可以克克服硅胶胶基质柱柱的某些些不足，但但需要大大量的实实验来证证实，要要进一步步考查聚聚合物基基质填料料的全面面优越性性。 在实际际工作中中，选择择性能良良好的柱柱可得到到好的结结果，首首先要注注意柱径径、长度度、填料料种类和和填料粒粒度。 评价柱柱的好坏坏不仅只只是N数，还还应考虑虑组分在在柱上的的保留、键合相相表面的的物性、柱压降降以及峰峰不对称称因子As等。每每一根新新柱都应应标出详详细参数数，主要要内容包包括公司司名称、柱名称称(商标)、柱填填料、

5、尺尺寸。附附一张标标准参考考色谱图图，并标标出色谱谱条件、样品名名称、流流动相组组成、流流速、柱柱温、进进样体积积、检测测器、峰峰的保留留时间及及峰名称称等。评评价一根根色谱柱柱的主要要指标是是：塔板数N值；峰不对对称因子子As；柱压降降；键合相相浓度。二、色谱谱柱预防防性保护护与柱寿寿命的延延长 通常，一一根色谱谱柱在分分析数千千个样品品之后性性能仍然然保持良良好，但但也有的的柱仅分分析不多多的样品品后几乎乎就报废废了。影影响柱寿寿命和其其它问题题的因素素很多，而而有些因因素是操操作者很很难控制制的，如如果被分分析的样样品(如分析析生物样样品)，怎么么净化样样品也是是“脏”的，对对于色谱谱柱

6、的影影响是非非常大的的。然而而采取下下列措施施后，在在多数情情况下总总能够人人为地减减少柱上上故障，达达到延长长寿命的的目的。1、加流流路过滤滤器和保保护柱 流路过过滤器紧紧靠进样样阀后面面，位于于分析柱柱前。0.5m烧结不不锈钢片片夹在死死体积很很小的套套子中，挡挡住来源源于样品品和进样样阀垫圈圈的微粒粒入柱。因为每每个样品品都过滤滤既费事事又带来来误差，样样品量少少过滤更更困难，因因此流路路上装过过滤器是是比较省省事的办办法。也也可以在在流路加加上保护护柱，放放在流路路过滤器器和分析析柱之间间，或者者代替流流路过滤滤器。保保护柱的的使命是是收集阻阻塞柱进进口的来来自样品品的化学学“垃圾”。

7、这种种垃圾最最终降低低柱效能能。保护护柱是消消耗品，分分析50100个比较较脏的样样品之后后就要调调换新的的。保护护柱应该该是小体体积，用用分析柱柱的同种种填料填填装。保保护柱使使用得当当，对分分离无影影响，好好像未装装保护柱柱一样。有些厂厂商的商商品将保保护柱和和流路过过滤器连连在一个个单元内内，使用用起来非非常方便便。自己己填装保保护柱都都是用短短柱、不不超过3cm长，内内径23mm，用较较大粒度度的填粒粒(一五20m)干法填填装，会会使分析析柱效略略微有所所降低。2、避免免高压冲冲击 一般色色谱柱都都能经得得起高压压，但经经不起突突然变化化的高压压冲击。引起高高压突然然冲击，主主要是因因

8、样品阀阀的缓慢慢转动、泵起动动快、柱柱切换操操作等。转动六六通进样样阀时从从泵到柱柱的液流流会瞬时时切断。在阀的的泵侧压压力升高高，在阀阀的柱侧侧压力降降低(变化超超过20)。阀转转到底后后压力突突然冲击击一下恢恢复正常常。手动动进样阀阀的变化化不大，自自动进样样阀比较较慢，可可能造成成压力冲冲击，可可用氦气气代替空空气驱动动进样阀阀。因氮氮压缩系系数小。另外泵泵起动不不应过快快，可分分步操作作。如用用3mLmin流速，先先从lmLmin到2mLmin，然后后再3mLmin，每个个间隔应应大于20s。柱切切换技术术的应用用也很广广泛，切切换过程程中在色色谱柱的的入口处处压力在在零到很很大数字字

9、之间变变化，会会很快使使柱报废废。3、分离离条件 多数色色谱柱有有很宽的的试验条条件范围围，但具具体应用用又受到到限制，主主要是pH值、柱柱温和流流动相的的选择。 硅胶为为基质的的键合相相要求PH在2.57之间，极极端pH的流动动相能“溶解”硅胶，使使键合相相流失。结果非非碱性组组分的保保留不断断减少，碱碱性组分分的保留留增加，引引起碱性性组分峰峰变宽。如果一一定要用用高或低低pH的流动动相，可可加预柱柱(饱和柱)。预柱柱装在泵泵和进样样阀之间间，用分分析柱相相同的填填料填装装，或者者用普通通硅胶。硅胶饱饱和了流流动相，减减少了分分析柱填填料的损损失。预预柱不要要求柱效效高，用用价格低低的一般

10、般硅胶疏疏松地填填装，按按期检查查硅胶的的溶解情情况。用用预柱也也有不利利的影响响，即新新流动相相难以平平衡，保保留时间间不稳定定或稳定定慢。使使用了预预柱一定定要加流流路过滤滤器，以以防止硅硅胶微粒粒引起的的麻烦。 以硅胶胶为基质质的柱和和阴离子子交换柱柱超过60后，会会增加对对流动相相中化学学物质的的吸附。在高温温下用小小颗粒柱柱引起柱柱床塌陷陷，降低低柱效，改改变峰形形。在40以上使使用3m柱，70以上使使用5m柱，会会使值降降低50。 有些流流动相中中的溶剂剂不能用用于某些些柱，如如小颗粒粒的聚苯苯乙烯填填料不能能用于非非水的排排阻色谱谱。另一一方面，有有些柱与与某些溶溶剂(如四氢氢呋

11、喃)一旦达达到平衡衡，不要要随意改改用其它它溶剂。有关这这些特殊殊填料，可可以参见见有关资资料。 水溶性性流动相相会引起起微生物物生长而而造成阻阻塞柱。色谱柱柱应存放放在纯有有机溶剂剂或加了了50有机机溶剂的的水中。凝胶柱柱可存放放在水溶溶性缓冲冲液中，同同时加0.001叠氮氮钠以防防止微生生物的生生长。4、净化化样品 用溶剂剂溶解的的样品，多多数组分分在一定定的时间间内能完完全从柱柱中流出出来，不不会造成成危害。有些样样品可能能含有微微粒物质质，样品品中的某某种组分分(如蛋白白质)在柱头头上沉积积下来，组组分在固固定相上上保留很很强，溶溶剂带走走柱填料料等，这这些都会会造成柱柱效能下下降或对

12、对柱寿命命的影响响，有必必要采取取措施防防止柱变变坏。 如在光光线照射射下观察察样品是是浑浊的的或带有有乳白色色，进样样前必须须要过滤滤虽然然流路上上装有过过滤器和和保护柱柱，但不不能代替替样品的的前处理理，样品品中过多多的微粒粒会使过过滤器和和保护柱柱超载，很很快阻塞塞，或者者微粒进进入分析析柱，所所以在进进样前必必须过滤滤样品。 若怀疑疑样品与与流动相相混合有有沉淀而而对色谱谱柱有阻阻塞，应应先试验验一下，看看样品溶溶液加入入流动相相中有无无变浑或或乳白色色出现。如果进进样后压压力突然然增加而而后又慢慢慢减小小，表明明样品中中有微粒粒或发生生沉淀。如有沉沉淀要设设法改变变分离条条件，包包括

13、换样样品溶剂剂和流动动相或处处理样品品去掉不不溶物质质。应尽尽量用小小体积的的样品。 有些样样品能很很强地吸吸附在柱柱填料上上，这样样会降低低塔板数数，改变变样品的的保留物物质外，还还要加保保护柱，定定期清洗洗色谱柱柱。有时时因为疏疏忽，用用对柱有有害的溶溶剂溶解解样品，比比如用6moolL的氢氧氧化钠溶溶解样品品，这样样的样品品只要进进50100L到硅胶胶基质柱柱中，硅硅胶就很很快溶解解而使柱柱报废。在这种种情况下下，应立立即中和和样品，或或除去原原溶剂中中的有害害成分。5、用强强溶剂定定期冲洗洗柱 每次工工作结束束，用强强溶剂冲冲洗柱是是良好的的习惯。可用甲甲醇、乙乙腈冲反反相柱，冲冲去留

14、在在柱上的的强吸附附组分。用甲醇醇水为流流动相时时也应冲冲洗。冲冲洗的程程序在以以下章节节中介绍绍。柱头头的烧结结不锈钢钢滤片，要要求平整整，死体体积小，孔孔径适当当(25m)。过滤滤片选择择不好会会改变色色谱峰形形，增加加阻力或或起不到到阻挡污污染物的的作用(填料很很快变色色)。 此外，对对柱硬件件的保养养也不可可忽视实际操操作中应应注意以以下几点点：接头要要配套，用用同一厂厂商的组组接件；接头之之间、柱柱压帽螺螺母与密密封卡套套之间无无微粒(填料)，否则则收紧时时容易咬咬死；密封卡卡套与柱柱管一次次性卡紧紧后再也也不能松松动，所所以拆开开柱头再再上紧时时要小心心，不能能使卡套套移动，原原来

15、柱端端的不锈锈钢滤片片和垫片片的厚度度和强度度也不能能改变(改变这这些附件件的性能能就促使使卡套移移动；接头等等组接件件不要拧拧得过紧紧，适当当上紧后后接上泵泵试验，分分步拧紧紧，直到到不漏为为止还还有非常常重要的的是柱硬硬件的损损坏往往往会造成成不可挽挽回的损损失。综上所述述，如何何保护良良好的柱柱性能与与柱寿命命：O认真阅阅读色谱谱柱使用用说明书书；O使用填填充良好好的色谱谱柱；O尽量减减少压力力波动，避避免机械械及热冲冲击；O使用保保护柱及及在线过过滤器；O经常以以强溶剂剂冲洗色色谱柱；O充分过过滤样品品及流动动相，尽尽量避免免杂质微微粒与强强保留成成分；O用稳定定的固定定相(C一八最稳

16、稳定)：O在中等等pH值操作作时(68)，用有有机缓冲冲溶液；O色谱柱柱使用温温度最好好小于40；O硅胶基基质的色色谱柱，应应保持流流动相的的pH值范围围在3.08.0；O在水流流动相与与缓冲溶溶液中加加2000ppmm的叠氮氮钠；O流动相相中含有有缓冲溶溶液，应应注意用用95：5的水及及有机溶溶剂过滤滤，有机机溶剂不不能低于于5；O过夜或或贮存时时，冲洗洗掉盐和和缓冲液液，用纯纯有机溶溶剂流动动相保存存(乙腈最最好)。三、怎样样选择色色谱柱 现代高高效液相相色谱中中，分离离效果好好坏很大大程度上上取决于于色谱填填料的选选择。但但是色谱谱填料的的选择范范围很宽宽，要做做合适的的选择，必必须对此

17、此有一定定的认识识和了解解。1.硅胶胶基质填填料（1）正正相色谱谱 正相色色谱用的的固定相相通常为为硅胶(Siilicca) 以及其其他具有有极性官官能团，如如胺基团团(NH2APSS)和氰基基团(CNN,CPPS)的键合合相填料料。由于硅胶胶表面的的硅羟基基(SiiOH)或其他他极性基基团极性性较强，因因此，分分离的次次序是依依据样品品中各组组份的极极性大小小，即极极性较弱弱的组份份最先被被冲洗出出色谱柱柱。 正相色色谱使用用的流动动相极性性相对比比固定相相低 ，如：正己烷烷(Heexanne)、氯仿(Chhlorrofoorm)、二氯氯甲烷(Meethyylenne CChlooridde

18、)等。（2）反反相色谱谱反相色谱谱用的填填料常是是以硅胶胶为基质质表面键键合有极极性相对对较弱的的官能团团的键合合相。反相色谱谱所使用用的流动动相极性性较强，通通常为水水、缓冲冲液与甲甲醇、乙乙腈等的的混合物物。样品流出出色谱的的顺序是是极性较较强的组组份最先先被冲洗洗出，而而极性弱弱的组份份会在色色谱柱上上有更强强的保留留。常用的反反相填料料有：C一八(OODS)、C8(MOOS)、C4(buutyll)、C6H5(Phhenyyl)等。2.聚合合物填料料聚合物填填料多为为聚苯乙乙烯-二乙烯烯基苯或或聚甲基基丙烯酸酸酯等，其其主要优优点是在在pH值为1114均可使使用。相对于硅硅胶基质质的C

19、一八填料料，这类类填料具具有更强强的疏水水性；大大孔的聚聚合物填填料对蛋蛋白质等等样品的的分离非非常有效效。 现有的的聚合物物填料的的缺点是是相对硅硅胶基质质填料，色色谱柱柱柱效较低低。3.其它它无机填填料 其它HPLLC的无机机填料色色谱柱也也已经商商品化。由于其其特殊的的性质，一一般仅限限于特殊殊的用途途。如，石石墨化碳碳正逐渐渐成为反反相色谱谱柱填料料。这种种填料的的分离不不同于硅硅胶基质质烷基键键合相，石石墨化碳碳的表面面即是保保留的基基础，不不再需其其它的表表面改性性。该柱柱填料一一般比烷烷基键合合硅胶或或多孔聚聚合物填填料的保保留能力力更强。石墨化化碳可用用于分离离某些几几何异构构

20、体，又又由于在在HPLLC流动相相中不会会被溶解解，这类类柱可在在任何pH与温度度下使用用。氧化化铝也用用于HPLLC，氧化化铝微粒粒刚性强强，可制制成稳定定色谱柱柱柱床，其其优点是是可在pH高达12的流动动相中使使用。但但由于氧氧化铝与与碱性化化合物作作用也很很强，应应用范围围受到一一定的限限制，所所以未能能广泛应应用。新新型氧化化锆基质质色谱填填料也可可用于HPLLC，商品品化的仅仅有聚合合物涂层层的多孔孔氧化锆锆微球色色谱柱，应应用pH范围1114，温度度可达100。由于于氧化铝铝填料是是最近几几年才开开始研究究，加之之面临的的实验难难度，其其重要用用途与优优势尚在在进行中中。四、怎样样

21、选择填填料粒度度 目前，商商品化的的色谱填填料粒度度从1m到超过30m均有售售，而目目前分析析分离主主要用3、5和10m填料，填填料的粒粒度主要要影响填填充柱的的两个参参数，即即柱效和和背压。粒度越越小，填填充柱的的柱效越越高；然然而粒度度越小，柱柱压越大大，柱压压的增加加限制了了粒度小小于3m的填料料应用。在相同同选择性性条件下下，提高高柱效可可提高分分离度，但但不是唯唯一的因因素。如如果固定定相选择择是正确确，但是是分离度度不够，那那么选用用更小粒粒度的填填料是很很有用的的。3m填料填填充柱的的柱效比比相同条条件下的的5m填料的的的柱效效提高近近30；然然而，3m的色谱谱柱的背背压却是是5

22、m的2倍。与与此同时时，柱效效提高意意味着在在相同条条件下可可以选用用更短的的色谱柱柱，以缩缩短分析析时间。另外，可可以采用用低粘度度的溶剂剂做流动动相或增增加色谱谱柱的使使用温度度，比如如用乙腈腈代替甲甲醇，以以降低色色谱柱的的压力。名称别名功能基团正相反相离子对应用Silica非极性和中等极性以及非离子性有机化合物SASC1-OH在所有的烷基键合相中对非极性于中等极化合物保留最弱；典型用于中等极性和多官能团化合物。BtylC4-(CH3)3分离肚和蛋白质，保留时间比C8和C一八短。MOSC8,Octyl-C4H9中等极性到强极性化合物，小肽和蛋白质，极性药物、甾族环境样品。ODSC一八-C

23、8H37烷基键合相中对中等极性化合物保留最强。广泛用于药物、甾族化合物、脂肪酸和环境样品。CPSCN,Cyano(Propyl nitrile)-(CH2)3CN对极性化合物有独特的选择性，适合应用于正相分离。当用于反相系统时，其选择性与C8和C一八不同。在药学领域和复杂混合物的分离中应用广泛。APSNH2(Amino propy)-(CH2)3NH2反相中分析糖类和其他极性化合物。弱阴离子交换，阴离子和有机酸则应用缓冲剂和有机改性剂做流动相。正相中与硅胶的选择性不同，分析芳香族效果很好。Phenyl-(CH3) C3H5芳香族化合物Diol-(CH2)2OCH2(CH2OH)2反相时，分离肽

24、和蛋白质。正相时，与硅选择性相似，但极性较弱SCX强阳离子次换-(CH2)2C6H4 SO3H-有机碱SAX强阴离子交换-(CH2)3N+（(CH3)3有机酸、核苷和核苷酸五、如何何选择保保护柱 怎样选选择保护护柱，但但又不影影响分离离分析?这是色色谱工作作者经常常提出的的一个问问题。通通常，在在选择保保护柱之之前首先先要考虑虑的是样样品是否否清洁。对于大大部分分分析工作作者来说说，一支支lcm长的保保护柱便便能提供供对柱子子的保护护，工作作中发现现要经常常更换1cm的保护护柱，那那么应选选择2cm或3cm长的保保护柱。保护柱柱越长，自自然所装装填的色色谱填料料越多，则则其越能能避免污污染物进

25、进入分析析色谱柱柱的机会会。当然然，随着着保护柱柱的长度度加长，样样品的保保留时间间会比使使用短保保护柱长长。一般来说说，保护护柱的内内径与分分析色谱谱柱的内内径相同同或相当当即可。 保护柱柱的填料料装填方方式也很很重要。目前有有薄膜装装填法的的保护柱柱，使用用过程很很简单方方便，而而且可以以在实验验室中进进行干装装。但是是，其最最大的缺缺点是不不经济，特特别是针针对中国国的具体体情况，一一次性使使用相对对费用较较高。另另外，薄薄膜装填填法的保保扩性所所装填的的色谱填填料有限限，只能能提供很很有限的的保护作作用；不不过也因因为所装装填的色色谱填料料较少，保保护柱的的长度也也较短，所所以对分分析

26、样品品的保留留时间的的影响也也很小。 另一种种保护柱柱结构其其实质是是缩短了了的色谱谱分析柱柱，设计计方式上上有直连连式、手手紧式或或整体式式。整体体式设计计是由色色谱柱的的生产厂厂商直接接安装在在色谱分分析柱上上的，必必须与色色谱分析析柱一同同订货，可可以非常常方便地地使用，但但不能够够被修改改。直连连式结构构设计可可在任何何时候由由色谱工工作者来来安装连连接，可可以与任任何品牌牌的色谱谱分析柱柱连接使使用，而而且还可可以根据据样品的的相关情情况选择择不同的的保护柱柱一样，只只是在连连接时不不需要借借助扳手手等工具具，直接接用手上上紧即可可。另外外从保护护柱结构构的角度度看，保保护柱的的结构

27、又又分为是是否可以以更换保保护柱柱柱芯。现现在大多多数的保保护柱均均可以更更换保护护柱柱芯芯，可以以降低保保护柱的的使用成成本。大大多数人人是根据据色谱分分析柱的的填料选选择保护护柱的填填料，正正常情况况下可以以选择与与分析色色谱柱一一样的色色谱填料料。但是是，根据据实际的的分析工工作，也也可不必必与分析析色谱柱柱的填料料完全相相匹配。 对于选选择保护护柱的原原则是：在满足足分析分分离要求求的前提提条件下下，尽可可能地选选择较短短的保护护柱结构构，尽可可能选择择对分离离样品小小一些保保留性的的填料。六、故障障与解决决的方法法 选样了了一根好好的柱子子，再加加上有效效的维护护与预防防，可以以避免

28、不不少意外外故障的的发生。当然谁谁也不能能保护色色谱柱“永远”不出故故障，任任何一根根色谱柱柱最终都都会因为为柱效下下降直到到报废。柱损坏坏的标志志是：塔板数数下降；峰形改改变；压力增增加；保留时时间变化化。有时时往往是是几种情情况伴随随着同时时发生。1、塔板板数下降降 在色谱谱柱使用用过程中中，塔板板数会不不断下降降一般般情况下下，进20000个样品品后柱效效N值要降降低50，(但也不不能一概概而论)，而用C一八，柱柱梯度分分析氨基基酸，进进100个血清清样品之之后，柱柱效就下下降50%。这两两种情况况的差别别之所以以这么大大，关键键在于处处理样品品的方法法不同。 如果柱柱效很快快下降，应应

29、考虑上上节所提提到的人人为不利利因素。N值突然然下降(如一个个工作日日内)，应考考虑柱头头塌陷或或进了不不合格的的样品。如果使使用了不不同系统统的色谱谱柱造成成柱效下下降，是是某系统统中存在在柱外效效应。新新建立的的方法中中柱效下下降，可可能是样样品和其其它内在在因素引引起，此此时要采采取相应应措施，防防止继续续给柱造造成危害害。2、峰形形变坏 出现拖拖尾峰、分叉峰峰或非高高斯峰的的原因很很多，但但总是与与塔板数数骤然下下降联系系在一起起的。峰峰形变坏坏而保留留时间不不变，多多半是柱柱受到阻阻塞(不锈钢钢烧结片片)，或者者柱头有有了空穴穴。 3、压力力增加 和柱塔塔板数不不断减少少一样，在在使

30、用过过程中柱柱压慢慢慢增加，可可视为正正常。如如果压力力一下子子增加过过高，应应考虑两两种可能能，一是是样品沉沉积在柱柱内，二二是柱内内硬件阻阻塞(未考虑虑系统其其它部分分的阻塞塞)。 对于第第一种情情况，要要用能溶溶解所用用样品的的溶剂冲冲洗。冲冲洗时拆拆开柱与与检测器器之间接接头，正正向冲洗洗或将柱柱出口接接在泵上上反向冲冲洗(如果柱柱条件许许可)，使用用大约3050mmL溶剂。不要让让冲洗液液通过检检测器流流动池，以以防污染染。在冲冲洗过程程中不断断检查，直直到压力力恢复正正常为止止。如冲冲洗无效效，应该该考虑是是第二种种情况，先先换烧结结不锈钢钢过滤片片，拆下下柱，拧拧开柱头头上的压压

31、帽，持持垂直方方向小心心取出不不锈钢过过滤片，换换上新的的(不是洗洗过的旧旧滤片)。换滤滤片时尽尽量不要要搅动柱柱头填料料，如有有塌陷，可可用同种种填料中中乙醇调调成糊状状补平柱柱头，压压紧，压压平，柱柱性能可可恢复如如前。如如果柱头头填料己己脏，可可挖去23mm，用新新填料补补平。4、保留留时间的的改变 保留时时间的变变化指两两种类型型的情况况，第一一种是同同一根柱柱样品间间的保留留变化，第第二种类类型主要要是填料料的差异异造成的的，许多多实验都都会碰到到，现讨讨论如下下。 不同牌牌号的色色谱柱分分离的色色谱峰保保留时间间可在小小范围内内移动，但但峰的顺顺序和分分辨率不不变，可可改变流流速或

32、溶溶剂强度度(反相色色谱加水水调节)进行校校正。如如果谱图图中色谱谱顺序发发生了变变化，或或者两峰峰重叠在在一起，问问题就比比较严重重。保留留时间发发生大的的变化，主主要由柱柱填料硅硅酸相互互作用所所致，另另外有次次级保留留因素的的影响。硅胶为为基质的的填料表表面含有有硅醇，有有的封尾尾填料可可部分去去掉硅醇醇、不封封尾填料料的硅胶胶表面硅硅醇基更更多。酸酸性或碱碱性分子子可与硅硅醇发生生不同程程度的相相互作用用。硅酸酸与样品品分子作作用的强强弱，因因不同批批号的硅硅胶和不不键合相相填料而而异。即即使同批批号的硅硅胶而不不同批号号的键合合相也有有差异。硅醇对对阳离子子或碱性性样品影影响最大大。

33、参照照下列要要求做可可以减少少色谱柱柱之间保保留时间间的变化化。 (1)仅用同同一厂商商的柱。实际上上不具可可操作性性，但最最起码作作某一专专门分析析方法时时要用同同一厂商商的柱。 (2)设计分分离条件件，使保保留值变变化最小小(建立标标准的方方法)。 (3)选用液液相色谱谱系统或或色谱柱柱对次级级保留因因素(外界)灵敏度度最低。 (4)换新柱柱时调整整分析条条件保持持旧柱的的保留值值(改变条条件)。这一一步工作作是必不不可少的的，在长长期的常常规分析析中，不不会从头头至尾用用一根柱柱，中间间总要换换新柱，每每换一次次，都应应仔细地地调整各各组分的的保留。 在实际际工作中中，应考考虑到可可能会

34、发发生什么么问题，怎怎样预防防这些问问题的发发生。 第一，前前面提到到的作某某一专门门分析尽尽量用同同一批号号的柱。也可与与厂商接接洽，提提出特殊殊的要求求。 第二，选选择硅醇醇影响最最小的分分离条件件，减少少柱间的的差异。如在流流动相中中添加三三乙胺抑抑制硅醇醇的作用用。 第三，许许多色谱谱工作者者认为，在在流动相相中加入入离子对对试剂更更能抗硅硅醇的干干扰，使使保留具具有更好好的重复复性。 不管什什么情况况下引起起保留值值的明显显变化，都都应该改改善分离离条件。 改善特特别差的的峰的分分离度，并并使保留留值稳定定下来。例如用用梯度洗洗脱分析析体液中中的氨基基酸，这这种复杂杂的样品品有20多

35、个组组分，保保留稍有有变化可可能对分分离就产产生灾难难性的结结果。一一些极端端组分，如如偏向酸酸性或碱碱性的组组分很易易发生保保留值的的改变，应应用不同同流动相相的组成成、pH值和缓缓冲液的的浓度，可可以改善善关键色色谱峰间间的分离离。色谱谱峰分离离度变差差，可能能会系统统地改变变保留值值。 塔板数数降低、压力增增高、峰峰形变差差、保留留值变化化可能同同时发生生，可能能都是由由柱引起起的。下下表的内内容可帮帮助找到到一些故故障的原原因，有有些内容容将在后后面的章章节中详详细讨论论。表11-1 由柱引引起的故故障 故 障现象解决办法过滤片阻塞柱头塌陷键合相流失样品阻塞强吸附的样品压力增高，N下降

36、，峰形差峰分叉，N下降保留改变，峰形差，N下降高压N下降，保留减小倒柱冲洗或换过滤片修补柱头，可恢复80以上换柱用能溶解样品的溶剂冲洗柱强溶剂反冲七、延长长柱寿命命的方法法 一根柱柱到了不不可使用用的时候候应更换换。“不可挽挽救”这个概概念在许许多色谱谱工作者者的认识识上不完完全相同同，有人人认为只只有当柱柱的压力力增高到到系统不不可承受受的地步步才考虑虑报废，只只要压力力在可接接受的范范围内总总要设法法修补，以以延长柱柱的寿命命。另另外也可可以从分分析高要要求的样样品改作作分析低低要求的的样品，从从分离多多组分的的样品改改作分离离单组分分的样品品，从分分离介质质复杂的的样品改改为分离离介质相

37、相对简单单的样品品。实验验室最常常用的延延长柱寿寿命的方方法是修修补柱头头、换不不锈钢烧烧结片，冲冲洗、倒倒冲柱。 修补柱柱头和换换不锈钢钢结片常常联系在在一起，前前面已简简单作了了叙述。去掉过过滤片后后发现柱柱头塌陷陷或填料料被污染染，可用用无水乙乙醇调成成糊状的的同种填填料(挖去脏脏填料)填补柱柱头，用用与柱内内径相同同的、顶顶端平而而光滑的的不锈钢钢或聚四四氟乙烯烯棒压紧紧，再填填平，再再压紧，反反复35次，最最后用无无水乙醇醇将柱头头四周润润湿几次次，擦干干净柱外外壁的填填料、加加上新过过滤片，拧拧紧接头头，接上上泵冲洗洗，而后后再接检检测器。如果塌塌陷很深深，或者者挖去的的脏填料料很

38、多，填填平柱头头后接上上泵冲洗洗一五min，再拆拆下柱填填平，再再接上泵泵冲洗，反反复数次次可恢复复大部分分柱效。有时还还应该用用比较高高的流速速才能有有效。 修补过过的柱一一般不能能恢复到到原先的的柱效，刚刚开始修修补数次次效果不不错，随随着修补补次数的的增多，维维持一个个短时间间又要修修补，到到了后期期，键合合相随硅硅胶的溶溶蚀而流流失，加加上化学学物质的的腐蚀，此此时再也也无法修修补了。 对价格格高的柱柱一定坚坚持自己己动手修修补。如如排阻色色谱柱不不随时间间而改变变保留，仅仅需比较较低的分分离条件件，稍为为修补就就可解决决问题。 倒冲柱柱也是经经常采用用的维护护措施，不不提倡新新柱倒冲

39、冲柱。色色谱柱用用到中后后期，而而且修补补过多次次后才考考虑逆向向反冲。可在倒倒冲柱前前填平原原柱头的的塌陷现现冲洗，也也可倒向向冲洗后后再填平平柱头(原柱出出口)，后者者效果好好一些。柱逆向向使用后后柱效损损失较大大(约4060)，常常常可以倒倒过来再再倒过去去，只要要不破坏坏柱床，效效果还不不错。倒倒冲柱前前要检查查柱两端端的烧结结过滤片片情况，防防止烧结结过滤片片(原柱头头承受过过度压力力，填料料被泵打打出)。 在采取取以上措措施时，冲冲洗过程程应伴随随始终。 有少数数实验室室自己装装柱，或或请厂商商装柱。柱硬件件都是用用过的旧旧柱，这这可节约约50的经经费，但但有时也也碰到一一些麻烦烦

40、。柱内内壁未经经再抛光光处理，柱柱壁效应应比较大大，分辨辨率降低低，或者者拖尾峰峰。重装装柱后卡卡套易松松动，整整个柱头头渗漏。可借助助于聚四四氟乙烯烯软膜密密封，但但已不能能承受较较高的压压力。 对有些些柱重新新处理是是值得的的，但有有些则无无价值。除考虑虑价格外外，还要要考虑实实际工作作要求。任何柱柱都可以以修补数数次，样样品处理理好、流流动相温温和、压压力中下下可以减减少修补补柱的次次数。柱柱压升高高超过系系统所承承受的限限度就要要报废柱柱。实验验室内要要备有不不同类型型的散装装填料(C一八、硅硅胶)，用同同类型、同粒度度的填料料修补柱柱头效果果好。如如果手头头没有所所要求的的填料，可可

41、以用其其它填料料代替，这这比用柱柱头塌陷陷的柱要要好得多多。八、如何何解决色色谱柱使使用过程程出现的的问题1.保留留值与分分离度重重现性不不好原因因分析问题原因表现不同色谱柱间差异使用期间柱变化填料、键合相不同柱床破坏键合相丢失硅胶基质溶解强保留组分堆积堵塞保留因子(k)，分离因子()柱效(N) 保留因子(k)，分离因子()柱效(N)保留因子(k)，柱效(N)柱外效应系统差异、进样量大、进样阀与色谱柱之间、色谱柱与检测器之间的管路太长、检测器流通池体积大、接头死体积大等。柱效（N)分离效果变差流动相组分改变流速改变温度改变保留因子(k)，柱效变化很小保留因子(k)，分离因子（）保留因子(k)，

42、柱效变化很小柱平衡慢重新平衡时间不够保留因子(k)，柱效变化很小柱超载样品量太大保留因子(k)，柱效(N)液相色谱培训讲义(十一)x转载自：发布日期：2007-5-22八、如何解决色谱柱使用过程出现的问题1.保留值与分离度重现性不好原因分析问题原因表现不同色谱柱间差异使用期间柱变化填料、键合相不同柱床破坏键合相丢失硅胶基质溶解强保留组分堆积堵塞保留因子(k)，分离因子()柱效(N) 保留因子(k)，分离因子()柱效(N)保留因子(k)，柱效(N)柱外效应系统差异、进样量大、进样阀与色谱柱之间、色谱柱与检测器之间的管路太长、检测器流通池体积大、接头死体积大等。柱效（N)分离效果变差流动相组分改变

43、流速改变温度改变保留因子(k)，柱效变化很小保留因子(k)，分离因子（）保留因子(k)，柱效变化很小柱平衡慢重新平衡时间不够保留因子(k)，柱效变化很小柱超载样品量太大保留因子(k)，柱效(N)2.造成色谱峰(不对称)拖尾的原因(1)色谱柱本身填装问题，筛板堵塞或填料塌陷(2)柱头有污染(3)样品超载(4)样品溶剂不合适(5)柱外效应(6)化学或二次保留(硅羟基)效应(7)缓冲容量不足或不合适(8)重金属污染3.如何解决峰形拖尾的问题A、与化学有关的拖尾问题(1)流动相中，加入30mM的三乙胺(用于碱性化合物)或醋酸胺(用于酸性化合物)，未知化合物加醋酸三乙胺；(2)如仍然拖尾，将三乙胺换为二

44、甲基辛胺（或醋酸二甲辛胺）；(3)降低进样量到1g。B、与色谱柱有关的拖尾问题(l)如柱头处有强保留的样品组分积聚，反相柱可用20倍柱体积的96的二氯甲烷与4甲醇，加l氢氧化铵混合液冲洗；正向柱可用甲醇冲洗；(2)使用保护柱；C、与HPLC系统有关的峰拖尾和峰加宽(1)进样体积过大，(通常25L)：(2)进样阀与色谱柱及检测器之间的管路体积过大(最佳连接管应20cm，内径为0.007)；(3)检测器流通池的体积过大。4.如何贮存色谱柱(1)防止缓冲溶液和水溶液流动相产生微生物，做到流动相用多少配多少，或在水流动相中加20ppm叠氮钠以抑制细菌生长(一定当心其毒性和潜在的爆炸性)；或在流动相中加

45、20的有机改性剂，也可抑制微生物生长，有机改性剂还有助于流动相脱气。(2)尽可能将色谱柱贮存于100有机溶剂(乙腈最好)中，避免在缓冲液中保存。(3)使用缓冲液后的色谱柱，应用一五20倍柱体积的不含缓冲剂的同种水-有机溶剂流动相冲洗色谱柱换成100有机溶剂贮存。(4)避免用纯水冲洗键合致密的C一八柱。(5)将色谱柱两端用堵头拧好，以免柱床填料干裂。九、谱图问题液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来，其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决，而其他的问题必须通过修改操作程序来解决，对于色谱柱和流动相的正确选择是得到好的色谱图的关键。A、峰拖尾原因解决方法1、筛板阻塞1、a、反冲色谱柱b、更换进口筛板c、更换色谱柱2、色谱柱塌陷2、填充色谱柱3、干扰峰3、a、使用更长的色谱柱b、改变流动相或更换色谱柱4、流动相pH选择错误4、调整pH值。对于碱性化合物，低pH值更有利于得到对称峰5、样品与填料表面的活性点发生反应5、a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰b、更改色谱柱B、峰前延原因解决方法1、柱温低1、升高柱温2、样品溶剂选择不恰当2、使用流动相作为样品溶剂3、样品过载3、降低样品含量4、色谱柱损坏4、见A1、A2C、峰分叉原因解决方法1、保护柱或分析柱污染1、取下保护柱再分析。也可更换保护柱。拆下来清洗。如果问题仍然存在，可能是柱子被强保留物质污染，可运用适当的再生措施